JPS60253975A - 化学発光分析方法および検定用キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は試料中のベータラクタムを検出する方法に関し
、また化学ルミネセンス反応の成分の検出に関する。本
発明はまたこれらの検定のあるものを実施するための検
定用キットにも関する。

発明の背景 いくつかの化合物は化学ルミネセンス作用を示し、そし
てこの性質のために一般に尊重される。

ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１゜４−
フタラジンジオン）は酸化するとき光を発する能力のあ
ることでよく知られている。それは多くの分析方法に使
用される。例えば、痕跡の金属イオン、銅、鉄、過酸化
物およびシアン化物を分析するために使われる。

ルミノールの発光は典型的にはそれを、ペルオキシダー
ゼのような酸化反応用触媒の存在で過酸化水素のような
酸化剤と混合することにより引き出される。ここでこの
反応を「ルミノール反応」と呼ぶ。ホワイトヘッドら、
ネーチュア、３０５巻、１５８−１５９頁、１９８６年
（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ。

θｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒθ、３０５，１５８−１５
９（１９８３））にエリ、ホタルルシフェリンのルミノ
ール反応への添加は光出力を向上させると報告されてい
る。

化学的に誘導されたけい光を利用する検定法は当該技術
分野に公知であり、例えば米国特許第４，２２０，４５
０号を参照されたい。

米国特許第４．４３３．０６０号は、過酸化物とクロラ
ミンにエリ活性化されたトリフェニルメタン染料を利用
する化学ルミネセンス免疫検定法を開示している。トリ
フェニルメタン染料は標識物質として使用される。

ニーロウら、アナリティカ・ヒミカ・アクタ、６８巻、
２０３−２０４頁、１９７４年（ｙｕｒｏｗｅｔ　ａｌ
ｌＡｎａｌｙｔｉｃａ　ＯｈｉｍｉＣａ　ＡＣｔａ、、
　６８　、　ｐｐ。

２０３−２０４（１９７４））はルミノールを言む化学
ルミネセンス反応を使用するある種のケトンの検定法を
開示している。

ベータラクタムによるけい光筐たは化学ルミネセンスの
報告は何も知られていない。

発明の要約 本発明は、ルミノール反応のような反応の化学ルミネセ
ンスを増強する化合物としてのベータラクタムの使用に
関する。さらに詳細に述べれば、ルミノールおよびその
他の化学ルミネセンス化合物と協力するベータラクタム
の化学ルミネセンス作用は特定のベータラクタム類、特
にベータラクタム環構造を富む抗生物質のルミネセンス
検出において、またこれらのベータラクタム類の定性的
および定量的測定において有用である。本発明はまた、
ベータ）クタムを使用することにより反応の感度を増加
させる結果として化学ルミネセンス反応（例えばルミノ
ール反応）に基づく検定法の改良に関する。本発明はま
た、酸化触媒の必要を減じるかまたは除くことにより化
学ルミネセンス反応を単純化することに関する。最後に
、本発明はまた化学ルミネセンス検定を実施するための
キットに関する。

さらに詳細には、試料中のベータラクタムを検出するた
めの本発明の一方法は、ａ）１）化学ルミネセンス化合
物、過酸化物源および塩基から成る反応系とＨ）　分析
される試料の予め定量された一部を合わせて混合物とす
る工程、およびｂ）前記混合物の光出力を測定する工程
、から成る。前記反応系はさらに、もし前記試料の予め
定量された一部が唯一のベータラクタムとしてペニシリ
ンＧを含み、その宮有緻が結果として前記混合物がペニ
シリンＧを０．４５　ｍＭの濃度に宮むことになる程で
あると、光出力信号を発生し、これをルミノメータ−で
測定して、信号の開始から３０秒に亘り積分すると、前
記試料の予め定量された一部がベータラクタムを含まな
い場合に出す出力の少なくとも約２倍、そして好ましく
は少なくとも約４倍であることを特徴とする。反応系は
さらに化学ルミネセンス反応のための酸化触媒を含むこ
ともある。

本発明の他の一つの方法は試料中のベータ２クタムを検
出するための方法であって、ａ〕１）化学ルミネセンス
化合物、過酸化物源および塩基から成る反応系と１１）
前記試料の予め定量された一部を合わせて混合物とする
工程、およびｂ）前記混合物の光出力を測定する工程か
ら成り、その方法において化学ルミネセンス化学物がル
ミノール、ルミノール類似体、インルミノール、イソル
ミノール類似体、クマリン２、スルホロダミン１０１、
ウンベリフェロン、４−メｆルウンベリフエロンおよび
フルオレセインから成る群より選択される。

さらに本発明の他の一つの方法は、化学ルミネセンス化
合物、過酸化物源および任意に酸化触媒を含む化学ルミ
ネセンス反応の一成分の検出用の検定反応の感度を向上
させる方法である。

本発明において見いだされたことは、ベータラクタムに
より引き起される化学ルミネセンス反応の増７１０した
光出力は一般に付加的というエリはむしろ相乗作用的、
すなわち総光出力は個々の反応物の光出力の合計よりも
大である。この理由により、ここに述べた型の化学ルミ
ネセンス反応、すなわち「ベータラクタム反応」はベー
タラクタム類、特にベータラクタム抗生物質の強力な、
非常に高感度の検定方法を提供する。同様に、化学ルミ
ネセンス比合物（列えば、ルミノール）、過酸化物源、
または酸化触媒（例えば、セイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ）のようなベータラクタム反応の一成分の化学ルミ
ネセンス検定においてベータラクタム反りの使用はその
ような成分の非常に高感度の検定方法を与える。

詳細な説明 本発明は化学ルミネセンスの作用を示す新規な反応と組
成物を開示し、またその新規な反応と組成物の分析検定
手段としての利用についても開示する。

本明細書および特許請求の範囲を通じて用いられるとき
、「ベータラクタム」なる用語は検定される物質の量に
比汐りして測定し得る信号または標識の存在はすべての
足置的診断上の検定および分析の手順の本質的な要素で
ある。本発明の目的にとって、測定される信号は光出力
である。

ベータラクタム、そして特にベータラクタム抗生物質が
、酸化触媒の存在で酸化されるとおだやかに化学ルミネ
センスを行なうことは既に知られている。この現象自身
が驚くべきことであり且つ有用である。さらに驚くべく
意外なことに、ルミノール反応のような化学ルミネセン
ス反応がベータラクタムの存在で行なわれろと、相乗的
化学ルミネセンス反応が起る。この反応は、その光出力
が成分の光出力の和よりも大であるという事実において
相乗的であることが発見され゛た。ルミノール反応自身
は実施例１０条件で約１０００相対光単ｉ　（ｒｅｌａ
ｔｉｖｅ　ｌｉｇｈｔ　ｕｎｉｔ）を与える。実施列２
に示すように、実施例１０条件でベータラクタムのみを
反応させた場合、２２５相対光単位までのおだやかな化
学ルミネセンスが観察された。実施例１の実験Ｂ、　Ｃ
，Ｄ、　ＥおよびＦにおいて、光出力の非常に大きな増
加がルミノ・−ル反応から得られることが判った。

ルミノール反応のような化学ルミネセンス反応は一般に
、化学ルミネセンスｆヒ合物（例えば、ルミノール反応
におけるルミノール）、過酸化物のような酸化剤、およ
び時にはペルオキシダーゼのような酸化触媒の存在を必
要とする。以下に示すように、ベータラクタム反応にお
けろベータラクタムの存在は、多くの場合に、化学ルミ
ネセンス反応から酸化触媒の除去を可能にする。そのよ
うな除去は、反応系を簡素化する（丁なわち、−成分の
削減により）ことになるので、また検定の感度の向上を
しばしば来すので、望ましい。

本明細書および特許請求の範囲において用いられるとき
、「化学ルミネセンス化合物」という用語は、過酸化物
の存在でエネルギーを受け螢光としてそれを放出する（
すなわち、過酸化物の化学ルミネセンス化合物との反応
および／または後者の存在における分解の結果として上
記の作用をする）化合物を表わす。本発明の実施に使用
される化学ルミネセンス化合物に含まれるものはルミノ
ールとイソルミノール、米国特許第４，６５５，１６５
号および同第４ｊ２２６，９９３号に記載のようなルミ
ノールとインルミノールの類似体、クマリン２、フルオ
レセイン、フルオレセインアミンアイソマーエエ、スル
ホロダミン１０１、およびウンベリフェロンと４−メチ
ルウンベリフエロンテアル。

過酸化物源に関する限り、ルミノール反応に役立つ過酸
化物源ならみな本質的に現在のベータラクタム反応に役
立つと信じられる。ベータラクタム反応に使用できる適
当な過酸化物源の例に含まれるものは過酸化水素、過ホ
ウ酸す）　ＩＪウム、ｍ−〜クロロ過安息香酸のような
有機過酸化物、およびターシャリ−ブチルペルオキシド
のような有機ヒドロペルオキシドなどである。

本発明の使用に適する酸化触媒に含まれるものは、セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ
、水溶液中の酸化性金属イオン、例えばＯＯ＋２、Ｆｅ
　＋　２、Ｃｕ＋、Ｃｒ４３、Ｎ１＋２およびその他の
遷移金属イオンの水溶液、ミクロペルオキシダーゼ（シ
グマ・ケミカル・コンパニー、セントルイス、ミズーリ
、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　（！ｏ、。

ｓｔ、　ｂｏｕｌｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、コバラミ
ン、ヘモグロビンおよびヘマチンのような金属ポルフィ
リン型化合物などである。その上、多くの場合に本発明
の相乗的反応はルミノール反応に必要な触媒なしで、ま
たは極〈少量の触媒だけで実施できることが判った。

本発明のベータラクタム反応を使用して検出されるベー
タラクタム、または化学ルミネセンス化合物、過酸化物
源、または酸化触媒を検出するための検定に使用される
ベータラクタムに會まれるものは、ペニシリンＧ、ペニ
シリン■、アンピシリン、クロキシシリン（ｃｌｏｘｉ
ｃｉｌｌｉｎ）とアミノペニシリン酸のようなペニシリ
ン類、およびセファビリンとセファロシンのようなセフ
ァロスポリン類などである。

本発明のベータラクタム反応の増加した光出力は化学ル
ミネセンス化合物対ベータラクタルのモル比に関係して
変化する。これは化学ルミネセンス化合物としてのルミ
ノールについて実施例ろと９に定量的に示されている。

実施１３ｉｌ１３では、１５゜ｒ］ｇ／ｒｎ７！程も少
量のペニシリンＧが検出されている。

ｆヒ字ルミネセンス反心は１００　ｎｇ／ｍＩ！程も少
量のベータラクタムについても検出された。感度は使用
される特定のベータラクタムと採用される反応条件に依
存するであろう。

ルミノール反范、は存在するベータラクタムの量に関係
して直線的に増加する光出力を示す（実施例３）とめう
観察を考慮すると、この反応は存在するベータラクタム
の濃度を定量的に測定するために利用できよう。これは
標準曲線との比較を含めて実施される。異なるベータラ
クタム類は夫々異なる程度の増加光出力を示すので、各
ベータラクタムについて別々の標準曲線を調製すること
が必要である。

ベータラクタム反応が起るためには、水性媒体は塩基性
でなければならない１゜すなわち、ＰＨが約７．５エリ
大であるべきであり、好ましくは入５〜１２の範囲、最
も好ましくは約８．５〜１２の範囲”（−する。ルミノ
ール、過酸化水素またはベータラクタムの分析のために
は、好ましいＰＨは約１０〜１２である。本発明の特定
のｆヒ学ルミネセンス反応に好唸しいＰＨは色性される
反応物の性質、例えはベータラクタムの種類に関係して
変動する。その反応は普通の有機または無機の塩基、例
えば重炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、グリシン、
ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、イミダゾ−ル、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなど、を使用
して塩基性にすることができ、比較的弱い塩基が好まし
い。

上記のように、ここに述べるベータラクタム反応は、成
木の（例えば、水浴液の）試料、例えばミルクとプラズ
マ、の中のベータラクタム、特にベータラクタム抗生物
質の定性および定量分析のため非常に有用である。さら
にまた、実施例５に論じられ且つ第２図に示されるよう
に、各ベータラクタムは、ルミノメータ−と組脅せたス
トリップレコーダーにより記録されると、別々の特徴あ
る光出力線図を示す。従って、これらの化学ルミネセン
スの「指紋」は定性分析の方法として役立つ。

ベータラクタム反らが試料中のベータラクタムを検出す
る方法に１更用されろ場合に、そのような方法に採用さ
れる反し系はｆヒ学ルミネセンス化合物、過酸化物源、
塩基および任意に酸化触媒から成る。本発明のこのよう
な一方法において、反応系のさらに特徴どなるものは、
もし検定される試料の予め定量された一部が唯一のベー
タラクタムとしてペニシリンＧを富み、その宮有量が結
果として全体の反応混合物がペニシリンＧを０．４５ｍ
Ｍの濃度に営むような程であると、光出力信号を発生し
、これを慣用のルミノメータ−で測定して、信号の開始
から３０秒に亘り積分すると、前記試打の予め定量され
た一部がラクタムをざまなめ場合に出す出力の少なくと
も２倍になることである。

ある反応系がこの特別の方法に適てるがどうかを判定す
るためには、ベータラクタムを含筺ないことが知られて
ｂる（　Ｉｔｌｊえば、他の分析法で判定されたとして
）ある試料の予め定量された一部（′１″なわち、例え
ば、血漿が本発明の方法を使用して検定される場合には
、その血漿の一部）を用いて検定を行なめ、次に（反ろ
系と予め定量された試料の一部とから成る）混合物中の
ペニシリンＧの磁度が０．４５　ｍＭになるために十分
な敏のペニシリンＧをき有することが知られている試料
の予め定量された一部について再び検定する。光出力信
号をルミノメータ−を使用し且つ前記のように最初の６
０秒に亘って積分することにより両足する。

それからこれらの情号を比較する。ある反応系がこの特
別の方法に用いろために適当であるかどうかを判定する
場合には、光出力信号の測定は試料と反〔系の成分が混
合された時から約１０秒以内に開始されなければならな
い。

本発明の方法自身は、勿論、光出力信号を測定するどん
な適当な手段を採用してもよいことに理解されるべきで
ある。−１−なわち、光出力信号を、例えばピークの高
さを測り、全体の信号寸たはそのｆ！ｌ！Ｓ分の下の面
積を積分するなど、いかなる適当な方法に↓つても分析
１−ろことができろ。

ベータラクタムを検出するために本発明の方法を実施す
る際には、反応系の種々の成分および試料の予め定量さ
れた一部をどんな順序で混合してもよい。

ここに述べられるベータラクタム反応はまた、化学ルミ
ネセンス化合物、過酸化物源または酸ｆヒ触媒のような
ベータラクタム反応の成分の分析検定において非常に有
用である。

ここに述べられるベータラクタム反応はまた、標識が化
学ルミネセンス化合物（例えば、ルミノール）またはｆ
ヒ学ルミネセンス反応用の触媒である分析用反応におい
て役立つ。これらの反応の感度はより冒められる。すな
わち、ベータラクタムの存在のために得られるより大き
な光出力によって検定している成分が検出され且つより
容易に定量されろ。さらに、本発明はまた標識としての
ベータラクタムの使用、例えば、ベータラクタムで標識
づけたｆヒ学種を測定する配位子−反配泣子結合検定に
おける使用を可能にする。

公知のルミノールに基づく免疫検定の例はプａｒステロ
ンのようなステロイド用、ビオチンとアビジン用、チロ
キシン用、およびヘバチチスＢ表面抗原用などの検定で
ある。これらの検定法は「ルミネセンス検定：内分泌学
および臨床化学における展望」エム・セリオとエム・ボ
ザグリ編、ラベン・プレス、ニューヨーク、１９８２年
（’Ｌｕｍ１ｎｅＣｅｎｔ　７ｋｓｓａｙｓ　：　Ｐｅ
ｒｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
　ａｎｄ　Ｏ：１ｉｎｉｃａｌ　Ｏｈｅｍｉｅｔｒｙ”
ｓｄｉｔｅａ１）ｙ　Ｍ、５ｅｒｉｏ　ａｎｄ　Ｍ、Ｐ
ｏｚｚａｇｌｉ、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ。

ＮθｗＹｏｒｋ、１９８２　）という本に記載されてい
る。

標識種がセイヨウワサビペルオキシダーゼ、ミクロペル
オキシダーゼ、ヘミン甘たはヘモグロビンであるルミノ
ール反応に基づく検定に會唸れるものは、オルンンら、
ジャーナル・オシ・イミュノロジカル・メソツズ、２５
巻、１２７−１３５頁、１９７９年（Ｏｌｓｓｏｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｊ、■ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ１Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ、　２５　、１２７−１５５　（１９７９））
に記載のようなタンパク質結合検定、前記の「ルミネセ
ンス検定：内分易学および臨床化学における展望」に記
載のようなヘモグロビン用検定および酵素免疫検定、お
よびアナリテイカル・ケミストリー、５４巻、１１２６
−１１２９頁、１９８２年（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｏ
ｈθｍ１ｓｔｒｙ、　５４．１１２６−１１２９、（１
９８２））に記載のようなヒト血清アルブミン上のヘミ
ン触媒標識に基づく検定などである。

検定を改良する方法としての化学ルミネセンス反応の増
加の有用性は次のようにエリ十分に説明することができ
る。すなわち、化学ルミネセンス反応は数種の基質を必
要とするかまたは利用する。

一つ以上の（一般にはすべての）基質が決定的に重要で
あるかまたは速度を限定する。それらの基質は結合して
いても、または結合していなくてもよい。すなわち、あ
る場合に基質は他の物質、例えば、薬剤、抗体、タンパ
ク質、抗原、ＤＮＡなどと結合して、そのような他の物
質がそれによって検出されるように標識を与える。

ルミノール反応の例では、自由のルミノールまたは他の
ある物質に結合したルミノールが検出され、る。この反
応は本発明の方法によれば増強されるであろう。

化学ルミネセンス反応において過酸化物源は必要な成分
であるので、過酸化物の存在は化学ルミネセンス反応の
発生によって示すことができょう。

従って、本発明の方法は、例えば、過酸ｆヒ水素贅たは
過酸化水素を発生する基質の検出を容易にするであろう
。

同様に、ベータラクタム類、他の物質に結合したベータ
ラクタム類、ルミノール反応の触媒および他の物質に結
合した触媒の検出は本発明の方法によって改良されよう
。

ベータラクタムの化学ルミネセンスを考慮すると、ベー
タラクタムは免疫検定の標識としてて使用することがで
きる。例えば、米国特許第４．２２０，４５０号は、ベ
ータラクタムの存在によって増強される化学ルミネセン
ス反応を言むが、これらすべての反応は本発明の利用の
機会を与えるであろう。すなわち、米国特許第４，２２
０，４５０号に記載の配位子または反配位子を化学ルミ
ネセンス反応の一成分によって標識をつけることができ
、そして配位子または反配位子をベータラクタムを使用
してずヒ学ルミネセンス反応の増加の結果としてより容
易に検出することができょう。

上記のように、酸化触媒の使用は本発明のベータラクタ
ム反応においては任意である。筺た、ここに述べた酸化
触媒を廿むベータラクタム反応のあるものにアスコルビ
ン酸塩（９１エバ、アルコルビン酸ナトリウム）の添加
、あるいは酸化触媒を毒するある種のイオンの塩の添加
は化学ルミネセンス検定の感度を増させることも見いだ
された。

適当なイオン塩に含まれるものはアジ化塩（例えば、ア
ジ化ナトリウム）、アジ化塩とシアン化塩の混合物（例
えば、後者はシアン化ナトリウム）である。アルコルビ
ン酸塩とアジ化塩の混合物もまた適当であることが判っ
た。理論に束縛されることは望まないが、二種の反応が
酸化触媒、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、が
存在ｊる本発明の化学ルミネセンス反応に包含されてい
ると信じられる。一つの反応は従来゛の化学ルミネセン
ス反応であり、他の反応はベータラクタムの存在を必要
とする別の反応である。酸化触媒の毒の存在で前者の反
応の光出力の減少および／または後者の反応の光出力の
増加を起すために感度が増すと信じられている。

化学ルミネセンス反応の一成分を検出するための本発明
の検一定用キットは、１）検定されるべき成分以外の化
学ルミネセンス反応の反応物、お工び１１）ベータラク
タムから成る。そのような反応物とベータラクタムは複
数の検定を行なうに十分な量に存在し、実質的に安定な
形に包装されている（￥なわち、そのキットは室温にお
いて少なくとも３０日の貯蔵寿命を示−ｆ）。

次の実施列は例証のために提供されるが、限定のためで
はない。

実施例１ ルミノール０．００２［］Ｍ、エチレンジアミン四酢酸
０．００２５　Ｍおよび重炭酸ナトリウム０．３０Ｍの
水浴液（ｐＨ１０，５）の１００μｍ、ベータラクタム
抗性物質水溶液（２Ｘ１０−３Ｍ）の１００μｍ、およ
びセイヨウワサビペルオキシダーゼ（４４０ｎｇ／ｄ）
、牛の血清アルジミン（２００μｇ／ｍｌ）と０．００
５０　Ｍのエチレンジアミン四酢酸を宮む水溶液の１０
０μＪを混合して溶液を８與した。反応をルマツク・ビ
オカウンター２０　Ｉ　Ｑ　（Ｌｕｍａｃ■Ｂｉｏｃｏ
ｕｎｔｅｒ　２０１０　）　Ｃスリーエム、セントボー
ル、ミネソタ（３Ｍ、ｓｔ。

Ｐａｕｌ、　Ｍｉｎｅｓｏｔａ）から入手できるルミノ
メータ−〕を使用して監視した。反応をそれからエチレ
ンジアミン四酢酸０．００１０　Ｍの過酸色水素肌０１
８Ｍ水溶液の１００μＪの添加により開始させた。

光出力を反応開始後６０秒間測定し、ストリップ・チャ
ート・レコーダー上に線図として記録し、そしてルミノ
メータ−により記録し且つ積分した。

ブランクとして、ベータラクタム抗生物質を含む溶液１
００μｋを蒸留水と取り替えて反応を実験した。

第１表はルミノメータ−で測定した光出力、計算した増
加光出力（ＥＬＯと略記され、記録された光出力からブ
ランクの光出力を減゛じた差を表わす）および増加光出
力係数（ここではＥＬＯ係数と略記され、光出力をブラ
ンクの光出力で割った商を表わす）を示す。光出力の単
位は前記の計器で測定された通り相対光単位（ここでは
ＲＬＵと略ｊ）である。

実験Ｂ、Ｏ，Ｄ、ＥおよびＦにおいて、ベータラクタム
抗生物質は反応により大きな光の増加を生じ、実験Ｅの
２５［］％から実験Ｃの１１５０％に及んだ。ベータラ
クタムの７７１］水分解生成物（実験ＧとＨ）および非
ラクタム抗生物質（実験工Ｉ　Ｊ　１およびＫ）は光出
力に比較し得る程大きな増加を生じなかった。

実施例２ 重炭酸ナトリウムＯ１ろＯＭ　（ＰＨ１０，５）および
エチレンジアミン四酢酸０．ＤＯ２５Ｍの水１００μヱ
、ベータラクタム抗生物質水浴液（２Ｘ　１０”−”Ｍ
）の１００μｍ、およびセイヨウワサビペルオキシダー
ゼ（４４０ｎｇ／ｄ）、牛の血清アルブミン（２００μ
ｇ／１ｎｌ）とエチレンジアミン四酢酸（０，００５０
Ｍ）を含む水浴液の１００μヱを混合して溶液を調製し
た。反応をルミノメータ−を使用して監視し、そして過
酸化水素０．０１８　Ｍおよびエチレンジアミン四酢酸
０．００１０　Ｍの水溶液ｌ０（）μぷを添加して反応
を開始させた。光出力を反応開始後３０秒間副足し、ス
トリップ・チャート・レコーダー上に線図として記録し
、そしてルミノメータ−により記録し且つ積分した。

第■表は、示されたベータラクタム抗生物質が使用され
た場合のルミノメータ−で測定さ−れた光出力を示す。

これらの結果は、すべての試験されたベータラクタム抗
生物質がおだやかな化学ルミネセンスな示したが、総化
学ルミネセンス惜は採用された条件下では抗生物質の間
にかなりの変動のあることを示した。

第■表 ベータラクタム抗生物質の光出力 ペニシリンＧ　２２５ ペニシリンＶ　２６ アンビシリン　８２ セフアロシン　４４ アミノペニシリン酸　１１６ 実施列６ ベータラクタム反応がここではペニシリンＧ１アンピシ
リン、およびセファロシンを定歓するために用いられた
。水に希釈されたベータラクタム溶液（５０μＪ−）を
、０．１Ｙ重炭酸ナトリウム、０、［３０５Ｍエチレン
ジアミン四酢酸、および０．１係トイーン２０　（Ｔｗ
ｓｅｎ■２０　）　Ｃ−ｊ？　！Ｊ　オキシエチレン・
ソルビタン・モノラウレート、アイ・シー・アイ・アメ
リカ、ウイルミントン、プラウエア（工Ｃ工Ａｍｅｒｉ
ｃａ　、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　Ｄｅｌａｗａｒｅ
）から入手可能〕を含むルミノール溶液、０．１■／ｍ
ｌ、に加えて、夫々ＰＨ１１，０（ペニシリンＧ　）、
ＰＨ１２，０（アンピシリン）、またはＰＨ１０，０（
セファロシン）に調製した。反応をターシャリ−ブチル
ヒドロペルオキシド０．０２￥溶液（（１，０［］　Ｉ
　Ｍエチレンジアミン四酢酸を含む）１００μｍを８口
えて開始させ、その反応によって発生した光を１分間の
区間で積分した。

ペニシリンＧ、アンピシリン、およびセファロシンにつ
き夫に３分、２分および１分における光出力を第１図に
夫々曲線Ａ、ＢおよびＣとして記入した。これらのプロ
ットは、これらの反応から発生した光が反応混合物中に
存在する特定のベータラクタム抗生物質の磯度に対して
直線的関係にあることを示した。これらの検定のおおよ
その感度は、バックグランド反応の標準偏差を２回測定
すると、夫々１５０．２５０および５００　ｎｇ／ｍＪ
である。

実施例４ ベータラクタム反応からの光出力は、適当な反応条件と
反応物を選択することによって光出力の景と光出力の継
続期間の両方において変えることができる。ペニシリン
Ｇ、１■／ｍｔ、水溶液の１００μヱ、との反応を実施
して、その光出力を時間に対して記録した（第２図）。

使用された過酸化物が過酸化水素、０．０１８Ｍ溶液の
１００μｍ１−１１．０、であった揚会に、反応は大量
の光を速やかに発生したが（曲線Ｄ）、光の発生は殆ど
同様な速さで減退した。もし添加された過酸化物がター
シャリ−ブチルヒドロベルオキシト、０．０２Ｍ溶液の
１００μｍ、であると、反応ははるかに多くの光を発生
する（曲線Ｅ、ＦおよびＧ）が、それほど速くない。Ｐ
Ｈ１０，０では（曲線Ｅ）、ピークの光出力は１８分ま
で到達されないが、’ｐＨ１１，Ｑ（曲線Ｆ）とＰＨ１
２，０（曲線Ｇ）ではピークはさらに速く、夫々６分と
２分に到達され、その除光の総発生量に著しい減少は見
られない。

実施例５ 第３図は実施例１においてルミツメ・−ターと連結した
ストリップレコーダーにより記録された３０秒線図を夫
々ペニシリンＧ（第３Ａ図）、ペニシリンＶ（第６Ｂ図
）、アンピシリン（ｉＷ３ｃ図）、アミンペニシリン酸
（第３Ｄ図）およびセフ７０シン（ＩＥ３Ｅ図）につい
て示す。これらの特徴的線図は、試験された各ベータラ
クタム毎に異なり、種々のベータラクタム類についての
化学ルミネセンス指紋の役をつとめるので、定性分析法
として役立つ。

実施例６ １０μｇのルミノール、０．１係トイーン２０（Ｔｗｅ
ｅｎ■２０）、０．１　Ｍ重炭酸ナトリウム、および０
．００５Ｍエチレンジアミン四酢酸を言むルミノール溶
液（’ｐＨ１０，０）の１００μＪＫ、ベータラクタム
抗生物質１ｍｙ／−を詮む浴液５０μヱト、牛のヘモグ
ロビン（シグマ）　２．、．１５　Ｘ　１０−７■／ｒ
ｎＩ２、ミクロペルオキシダーゼ（シグマ）２．６　Ｘ
　１０−８■／ｍｌ、寸たは水のうち一つの５０μ上を
加えることにエリ一連の反応を実験した。

これらの溶液に、１００μＪの過酸化水素溶液（０，０
１８Ｍ、エチレンジアミン四酢酸０．００１Ｍを含む）
または過ホウ酸ナトリウム溶液ＣＤ、０２と、エチレン
ジアミン四酢酸０．０　ＣＩ２　Ｍを言む）を実施例１
に述べたように暗所で注入した。これらの反応から発生
する光を観察したが、その結果を第■、■および７表に
示す。

第■表 ベータラクタムとルミノールのヘモグロビン触媒との反
り アンピシリン　２４．４　２１．７ りａキシシリン１１．１　１０．１ ペニシリンＧ　１７．４　２１．７ セフアピリン　１０．２’　２４．９ セフアロシン　９，２　２１．３ 第ル表 ベータラクタムとルミノールのミクロ ペルオキシダーゼ触媒との反応 ＥＬＯ係数　ＥＬＯ係数 ベータラクタムＨ２ｏ２と　Ｎ　ａＢｏ　２　・Ｈ２０
２とアンピシリン　１７．９　１５．７ クロキシシリン　８．２　８．６ ペニシリンＧ　１５，５　１人２ セフアピリン　１５，９　３３．０ セフアロシン　１１，８　２０．４ 第Ｖ表 ベータラクタムとルミノールの無触媒反応アンピシリン
　７．６　５．２ クロキシシリン　４．７　３．３ ペニシリンＧ６．２５・０ セファビリン　３．６６．２ セフアロシン　３．６　５．２ これらのデータは、ベータラクタム抗生物質のルミノー
ルへの添加反応はヘモグロビンまたはミクロペルオキシ
ダーゼ触媒の存在ではより大量の光を発生すること、お
よび触媒なしでもこの反応はまたかなりの光を発生する
ことを示す。また、過酸化水素と過ホウ酸ナトリウムの
両方共にこれらの反応に酸化剤として役立つことが示さ
れた。

セファロシンとセファビリンの場合に、過ホウ酸ナトリ
ウムを使用すると、過酸化水素よりも著しく大量の光を
発生する。

実施例７ ペニシリンＧ（ｌａｙ／−水溶液〕と過ホウ酸ナトリウ
ム（０，０２Ｍ、エチレンジアミン四酢酸０−００２　
Ｍを含む）の反応に試験化合物を添加した。各化合物を
、エチレンジアミン四酢酸の０．００５　Ｍ？Ｊ液であ
’）且ッＤ−１％トイーン２゜（Ｔｗｅｅｎ■２０）を
ＰＨ９，５で言む０．０５Ｍホウ酸ナトリウム中ＫＭ解
した。但し、クマリン２とアクリドン４ｚ別で、これら
は０．５−のジメチルスルホキシＶ沖に溶解してから、
ホウ酸塩緩衝液で１０．０−に希釈した。各反応は実施
例１と同じくセイヨウワサビペルオキシダーゼ５０μふ
と共に、捷たは触媒なしで５０−の緩衝液と共に実験さ
れた。反応を、過酸化物、１００μｍの試験化合物浴液
、および５０μｍのペニシリンＧを実施列１と同様に混
合することにより開始させ、発生する光を観測した。

これらの反応の結果を、存在するペニシリンＧによって
発生した光のそれなしで発生した光に対する比として、
第ＶＩ表に示した。本発明に従って化学ルミネセンス作
用について試験された化合物のうちで、クマリン２、ス
ルホロダミン１０１．４−メチルウンベリフェロン、ウ
ンベリフェロン、フルオレセインアミン・アイソマーエ
エ、フルオレセイン、ルミノールおよびインルミノール
はベータラクタム反応のため有用な化学ルミネセンス１
６合物として行動し、そしてこれらのうちイソルミノー
ルとルミノールが好ましい。第■表に列記された残りの
化合物は本発明の実施に使用するには適しない。

第■表 種々の化学ルミネセンス化合物の存在におけるペニシリ
ンＧの過ホウ酸ナトリウムとの反応クマリン２　０．［
］７　２．０　１．６スルホロダミン１０１　Ｃ１，１
５，７ん３スルホロダミンＢ０．０９　１．２　１゜２
アクリドン　０．０７’　１．５　１．１ダンシル酸　
０．０５　１．４　１．２４−メチル− ウンベリフェロン　０．０９　１．８　２．０ウンベリ
フエロン　０．０７　２．４　１．０フルオレセインア
ミン アインマーエエ　０．０６　１゜７２．４フルオレセイ
ン　Ｄ、１２゜２１．７ ろ一アミノｙｌ　−ルｅ　Ｏ，２３１，２１，０イソル
ミノール　Ｏｏｌ　５．０　５．６ルミノール　０．１
　４．６　５．７ ＋ＨＲＰ＝セイヨウワサビペルオキシダ一ゼ実施例８ 化学ルミネセンス反応用の緩衝剤はベータラクタム反応
から発生する光に影響を与える。エチレンジアミン四酢
酸のＯ，００５Ｍ溶液であり且つ０．１％トイーン２０
　、（Ｔｗｅｅｎ■２０　）　ヲ含す緩ｆＫｉ液（ｐＨ
９，５）中にルミ／−ルヲ０．０１■／＋＋＋ｌＣ溶解
”ｆ−ることにより第■表に示す種々の緩衝剤の存在で
反応を実験した。これらのルミノール溶液１００μｍに
、５０μＪのベータラクタム水溶液（１ｖｑ／ｍｌ）と
５０μｍのセイヨウワサビペルオキシダーゼ浴液（６，
８ｘ　１０　”ｍｙ／ｍｌ）を添加した。反応を実施例
１と同様に過酸化水素溶液（０，［］　１８　Ｍ、　ｘ
ｆｖンシ７　ミン四酢酸０．００１ｙを含む）の注入に
よって開始させた。

これらの反応の結果（第■表）は、各緩衝剤毎にＥＬＯ
があるが、炭酸塩、ホウ酸塩、およびトリス緩衝剤が試
験されたベータラクタムにつき最大のＥＬＯ係数を発生
することを示してｂろ。

実施例９ ルミノールは捷だ過酸化物の存在で、しかし酸化触媒の
不在でのベータ２クタム反応によって検出することがで
きる。ルミノールを０．１■／７！〜２．５ｎｇ／−含
む溶液を、０．００５　Ｍエチレンジアミン四酢酸と０
．１チトイーン２０　（Ｔｗｅｅｎ■２０）を言む０．
Ｉ　Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，０）中に希
釈することによって調製した。各１００μＬのルミノー
ル溶液に５０μＬの水と５０μヱのペニシリンＧ浴液（
１，０■／−水浴液）を添加した。

［］、ＯＤ　Ｉ　Ｍエチレンジアミン四酢酸浴液中０．
０１８ｙの過酸化水素１００　ｐｉを注入することによ
り化学ルミネセンス反応を開始させた。反応の光出力を
実施例１のように観測したが、ここでは光出力を６０秒
間に亘って積分した点が異なる。

この検定の結果を第４図に示す。これらの条件の下での
検出の限界は溶液−当り１．５　ｎｇのルミノール（８
，５Ｘ１０’Ｍ）であると見られる。

実施例１０ ベータラクタム反応はまた過酸化水素の存在の検出に使
用することができる。過酸化水素の溶液を０．０１８　
Ｍの濃度から１．３　Ｘ　Ｉ　Ｑ−６Ｍへ水中に希釈し
て調製した。ルミノールを１μｇ／　ｍｌ、０．００５
　Ｍエチレンジアミン四酢酸と０．１チトイーン２　［
］　（ＴＷｅθｎ■２０）を含むルミノール溶液（ｐＨ
１０，０）の１００μｍとペニシリンＧ浴液（１ｍｇ　
／　ｍｌ　）　（７）　Ｉ　ＣＩ　０μｍに、１００μ
ｍの過酸化水素溶液を加えて、その反応にエリ発生した
光を実施例８と同じく６０秒間観測した。

その検定結果を第５図に示すが、過酸化水素は３．７　
Ｘ　１０−’　Ｍの濃度まで検出できることを示してい
る。

実施例１１ ２種の別の過酸化物をベータラクタム反応において過酸
化水素の代りに使用した。１００μＬのルミノール溶液
（’０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、０．００５Ｍエチレン
ジアミン匹酢酸、および０．１チトイーン２　Ｄ　（Ｔ
ｗｅｅｎ■２０）の液中０．１　ｍｙ／ｍｅ、ＰＨ１［
１，０）と１００μＬのベータラクタム溶液（１■／−
水中）の混合物に暗所で１００μＪのターシャリ−ブチ
ルヒドロペルオキシド（１−ＢｕＯＯＨ）　（０，００
１Ｍエチレンジアミン四酢酸中０．０２Ｍ）、または１
００μＪのメタ−クロロ過安息香酸（ＭＯＰＢ　）　（
０，００１￥エチレンジアミン四酢酸中０．００２　Ｍ
　）のいずれかを７１０え、反応により発生した光を１
分間に亘り積分し１こ。その反応の結果が第■表にＥＬ
Ｏ係数として報告されている。

第■表 ベータラクタム反応におけろｔ−ブチルペルオキシドお
よびｍ−クロロ過安息香酸０）使用ＥＬＯ係数 ペニシリンＧ　９２，７　１７．７ アンビシリン　Ｉ　Ｂ、１６．８ クロキシシリン　ろ４．６　５．０ セフアビリン　９１．６　６．５ セフアロシン　６５０．６　４．７ これらの結果は、これらの過酸化物力くベータラクタム
との反応に際して著しい量σつ光を発生丁４ことを示す
。ターシャリ−ブチルヒドロペルオキシドの使用は、観
測された高いＥＬＯ係数から見られるように、特にこれ
らの反応において効果カーある。

実施例１２ ベータラクタム反応は血漿と乳の両方に有用である。反
応は実施例３の方法で、ペニシリンＧの水溶液（１０＋
ｖ／ｄ）を血漿または化ミルクで１０倍に希釈して、最
終濃度１＋ｖ／−のペニシリンＧ溶液としたものと共に
実施された。さらにベータラクタム抗生物質の希釈が適
当な液体（ｊなわち、血漿または乳）によって行なわれ
た。５０μｍの血漿筐たは乳に１００μｍの水と１００
μｍのルミノール浴ｉ　（［１１，１■／−のルミノー
ル、Ｑ、１Ｍ重炭酸ナトリウム、Ｄ、０［１５Ｍエチレ
ンジアミン四酢酸、および０．１チトイーン２０（ＴＶ
θθｎ■２［］）を苫む）を７１０えた。反応を１００
μの過酸化水素浴液（０，００１Ｍエチレンジアミン四
酢酸中０．０１８Ｍ）を暗所で注入して開始させてから
、反応からの光を６０秒間監視した。

血漿と乳夫々について第６図と第７図に示された、ペニ
シリンＧ水溶液度に対する正味の光出力のプロットから
、ベータラクタム反応からの光出力はペニシリンＧの濃
度と共に直線状に変化することが見られろ。このことは
この抗生物質の検出と定量を血漿では約１０μｇ／−１
乳では１μｇ／ｍＡの水準贅で可能にする。

分析される試料が乳である場合には、反応の解析を反応
系の成分と試料とを混合した後直ちに（−ｆなわち、約
１０秒以内に）開始することが感度の理由で望ましい。

実施例１３ ベータラクタム反応を１００μｍのルミノール溶液（０
，Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣ！０３．０．ＯＤ　５　Ｍエチレン
ジアミン四酢酸、およびｏ、ｉ％トイーン２　Ｑ　（Ｔ
Ｗｅｅｎ■２０）溶液中１　ｍｇ／　ｍｌ、ＰＨ１０，
０）、５０　ｔｔＪ−のペニシリンＧ水溶液（１■／　
ｍＡ　）　、および１００μヱの過酸比水素（［１，０
１８Ｍ、０．００１Ｍエチレンジアミン四酢酸）によっ
て行なった。この反応を５０μヱのシアンｆヒナトリウ
ム（２，６■／−）またはアジ化ナトリウム（２，８ｍ
ｇ／　ｍｌ！　）のいずれかを添加して改変した。

これらの反応により発生した光をストリップ・チャート
・レコーダー上で監視し、第８図に再現し、そして５分
間に毎分積分した。その結果は、第■表に示されている
が、アジ化物の添加は反応により発生した光を著しく増
加させる（それのなｌＡ揚合の１８５％）ことを示す。

シアン化物は光出力を減少させるが（５分間の観測で約
６０係の減少）、アジ化物と組合せて使用された場合に
は、アジ化物単独使用の場合とほぼ同・し、あるいは改
変しない反応の１７４％の光出力である。注意すべき他
の一つの結果は、アジ化物および／またはシアン化物が
存在する場合に、それらが不在の場合よりも速くピーク
の光出力が達成されることである（第８図）。

実施例１４ ベータラクタム反応をペニシリンＧとアジ化ナトリウム
単独かまたはアジ化ナトリウム／シアン化ナトリウム混
合物のいずれかを使用して実施例１３と同様に実験して
、ペニシリンＧを言まないバックグラウンド反応と比較
した。反応の３０秒と６０秒における積分光出力の比が
第Ｘ表に示されており、かなりの増７１０、’ｆなわち
アジ化ナトリウムでは夫々１．９および１０．５倍、ア
ジ化ナトリウムとシアンｆヒナトリウムでは夫々１．１
および６．１倍、を示してめろ。

第Ｘ表 ＥＬＯ係数への効果 添加　ＫＬＯ係数 イオン　ｔ−６０秒　６０秒 なし　３．４　６．０ アジ化ナトリウム　６．５　６３．０ シアンｆヒナトリウム とアジ化ナトリウム　３．８　１９．０実施例１５ ベータラクタム反応を再びペニシリンＧと、今回ハアス
コルビン酸ナトリウム（３００ｎｇ／ｍｌ　）、または
アスコルビン酸ナトリウム（３０Ｄｎｇ／−）とアジ化
ナトリウム（２，８７１１＆／ｄ）の混合物を使用して
実施例１６と同様に実験した。反応の光出力は著しい影
響を受けなかったが、バックグラウンド元出力はかなり
減少した。これは第■表に示されたこれらの反応のＥＬ
Ｏ係数によって見られ、ＥＬＯ係数は反応２分後に２０
０以上に増加している。

実施例１６ ルミノール反応の酸化触媒をベータラクタム反応によっ
て検出および定量することができる。

１００μｍのルミノール溶液（０，Ｉ　Ｍ重炭酸ナトリ
ウム、０．００５Ｍエチレンジアミン四酢酸、および０
．１％ト（７７２０（Ｔｗｅｅｎ■２．０　）　、ｐＨ
１０，０の溶液中、ルミノール１　ｍｙ／ｍｌ　）、５
０μｍのペニシリンＧ溶液（０，２■／−水溶液）、お
よび５０μｍのセイヨウワサビペルオキシダーゼ溶液（
緩衝液で５６００から１４　ｎｇ　／−へ希釈された）
の混合物に１００１ＬＪ−の過酸化水素（０，０１８Ｍ
）を暗所で加えてから、反応にエリ発生した光を１０秒
間監視した。第９図に反応の正味光出力が触媒の濃度に
対してプロットされており、それらの間に直線関係の存
在することを示している。

このグラフから、これらの条件における検出限界の６ｎ
ｇ／−が示される。

【図面の簡単な説明】

第１図はベータラクタム濃度に対する本発明の方法を使
用して得られた光出力のプロットであム（実施列３参照
） 第２図は時間に対する本発明の方法を使用する光出力の
プロットである。（実施例４参照）第６図は本発明の方
法を使用して得られる特定のベータラクタムに特徴的な
線図の例示である。 （実施例５参照） 第４図はルミノール濃度に対する本発明の方法を使用し
て得られる光出力のプロットである。 （実施例９参照） 第５図は過酸化水素濃度に対する本発明の方法を使用し
て得られる光出力のプロ°ットである。 （実施例１０参照） 第６図は血漿中のペニシリン濃度に対する本発明の方法
を使用して得られる光出力のプロットである。（実施例
１２参照） 第７図は化ミルク中のペニシリン濃度に対する本発明の
方法を使用して得られた光出力のプロットである。（実
施例１２＃照） 第８図は時間に対する本発明の方法を使用して得られた
光出力のプロットである。（実施例１３参照） 第９図はセイヨウワサビペルオキシダーゼ濃度に対する
本発明の方法を使用して得られる光出力のプロットであ
る。（実施例１６参照）代理人　浅　村　皓 Ｆｚｃ、　７ 七イヨ′う９サヒ゛４鉄花も：慣ａ　（Ｋ）　／へ、ノ
Ｆｚｃ、９ 手続補正書（自発） 昭和６０年５ＪＪ、ｉ／。 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第　７２．４５５　号３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 ５、補正命令の日刊 昭和　年　月　日

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）　ベータラクタムを含有すると思われる試料中の
   ベータラクタム環を含む化合物の検出方法であって、 ａ）１）化学ルミネセンス化合物、過酸化物源、および
   塩基から成ろ反む系、および１１）前記試料の予め定量
   された一部、を合わせて混合物とする工程、および ｂ）前記混合物の光出力を測定する工程、がら成り、さ
   らに前記反応系が、もし前記試料の前記予め定量された
   一部が唯一のベータラクタムとしてペニシリンＧを言み
   、その含有量が結果として前記混合物がペニシリンＧを
   Ｏ−４５ｍＭの濃度に含むことになる程であると、光出
   力信号を発生し、これをルミノメータ−で測定して、信
   号の開始から６０秒に亘り積分すると、前記試料の前記
   予め定量された一部がベータラクタムを包まない場合に
   出す出力の少なくとも約２倍であることを特徴とする上
   記の検出方法。
2. （２）前記ｔ１５系がさらに酸化触媒を會む、特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）　化学ルミネセンス化合物、過酸化物源および任
   意に酸化触媒を會む化学ルミネセンス反応の一成分の検
   出用の検定反応の感度を向上させる方法であって、前記
   成分が前記化学ルミネセンス化合物、過酸化物源、およ
   び酸化触媒のうちの一つであり、前記方法がベータラク
   タムを前記検定反応に含むことから成る上記の方法。
4. （４）　化学ルミネセンス化合物、過酸化物源および任
   意に酸化触媒を反応物として會む化学ルミネセンス反応
   の一成分を検出するための検定用キットであって、前記
   成分が前記化学ルミネセンス化合物、過酸化物源、およ
   び酸化触媒のうちの一つであり、前記キットが ａ）前記成分以外の前記反応物、およびｂ）ベータラク
   タム を苫み、キット内の反応物とベータラクタムが実質的に
   安定な形に包装されていることを特徴とする上記の検定
   用キット。
5. （５）　ベータラクタムを合有すると思われる試料中の
   ベータラクタム環を含む化合物の検出方法であって、 ａ）１）化学ルミネセンス化合物、過酸化物源、および
   塩基から成る反応系、およびＩＩ）前記試料の予め定量
   された一部、を合わせて混合物とする工程、および ｂ）前記混合物の光出力を測定する工程、から成り、前
   記方法において化学ルミネセンス化合物がルミノール、
   ルミノール類似体、インルミノール、インルミノール類
   似体、クマリン２、スルホロダミン１０１、ウンベリフ
   ェロン、４−メチルウンベリフェロンおよびフルオレセ
   インから成る群より選択されることを特徴とする上記の
   方法。