JP3632990B2 - 化学発光測定試薬及び化学発光測定方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、生物学的に特異的な結合反応、例えば抗原抗体反応の検出・定量等に有用な化学発光測定試薬及び化学発光測定方法に関する。特に、臨床検査及び臨床化学の分野等で生体微量成分の高感度な分析・定量に有用な化学発光測定試薬及び化学発光測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
測定対象物質を高感度に検出・定量するために、抗原、抗体、受容体等の特異的捕捉剤を用いた特異的な結合反応を利用することが知られており、代表的な測定方法にサンドイッチ型免疫測定法が知られている。前記結合反応の検出用物質としては、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光性物質、発光性物質等を利用することができる。これらのうち、酵素を検出用物質として用いる免疫測定法(EIA)は、ラジオアイソトープを用いる免疫測定法(RIA)のような危険性はなく、特異的な結合反応を増幅することができ、一般にその酵素の触媒活性を定量することによって、特異的に結合した測定対象物質量を間接的に測定することができるため、広く用いられている。
酵素としてペルオキシダーゼを使用し、この酵素活性をルミノール及び過酸化水素による化学発光反応を利用して測定する方法は、通常発光が短寿命であるが、増感剤の添加により、発光量の増加及び発光持続時間の長期化が図れ、この反応を用いるとRIAに匹敵する高感度な測定が可能となることが知られている。そのために種々の増感剤が検討されている(特開昭59−171839号公報、特表昭59−500252号公報、特開平2−291299号公報等)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
試薬の構成及び反応時の混合順序として、上記特開昭59−171839号公報、特表昭59−500252号公報等には、ペルオキシダーゼ、ルミノール、増感剤及び酸化剤の4つを別々の試薬として保存し、反応時に混合してルミネセンス反応を開始させることが記載される。さらに具体的には、使用の数時間前にルミノールと過酸化水素を混合して溶液を調製し、これを増感剤を予め加えた、ペルオキシダーゼ−抗体複合体を含む反応系に注入して反応を開始させる方法が記載されている。また、上記特開平2−291299号公報等には、ルミノールと過酸化水素水を使用の約2時間前に混合し、使用直前にさらに増感剤を加えて混合した混合液を、反応系に添加する方法が記載されている。
一般に、これらの化学発光反応を利用する測定方法が適用される測定対象物質は超微量であることが多々有り、上記各方法で充分ということはなく、さらに高感度でかつ安定な測定法及び保存安定性の高い試薬の開発が望まれている。
本発明は、これらの課題を解決するものであり、試薬の構成及び添加順序の点から、鋭意検討を行った結果なし得た、さらに高感度でかつ安定な測定方法及び保存安定性が高くかつ試薬キットの簡素化も図れる測定試薬及び測定方法を提供するものである。
【0004】
【課題を解決するための手段】
即ち本発明は、下記の(1)〜(4)に関する。
(1)酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定試薬であって、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の2液として保存してなる化学発光測定試薬。
(2)酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の2液を調製し、ペルオキシダーゼを含む反応系に、▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の順に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
(3)酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の2液を調製し、これらを別々にかつ同時にペルオキシダーゼを含む反応系に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
(4)酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の2液を調製し、使用直前にこれらを混合して、ペルオキシダーゼを含む反応系に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
【0005】
本発明における化学発光測定試薬及び化学発光測定方法は、酵素としてペルオキシダーゼを用い、酵素活性の検出・定量に化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いるものであれば、測定対象及び測定手法に特に制限はない。
例えば、ペルオキシダーゼを標識酵素として用いる特異的結合反応系として、酵素免疫測定法の一抗体法、二抗体法、競合分析法、サンドイッチ分析法、ホモジーニアス分析法、ヘテロジーニアス分析法、ウエスタン分析法、DNAプローブ法等の各種分析法に利用できる。
【0006】
本発明で用いられるペルオキシダーゼは特に限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼの塩基性アイソザイムが増感剤との組合せにより、高い特異発光量が得られる点から好適である。西洋ワサビペルオキシダーゼの塩基性アイソザイムにはB、C、D及びEの各型が知られているが、これらの中ではC型がRZ値(ヘミンとタンパク質の比を示す)及び酵素活性の点で最も好ましい。これは、例えば東洋紡(株)から市販され入手可能である。
【0007】
化学発光反応に用いる化学発光基質としては、ルミノール類、ルシゲニンなどがあるが、ルミノール類が好ましく、具体的には、ルミノール、イソルミノール、N−エチルイソルミノール、N−(4−アミノブチル)−N−エチルイソルミノールヘミサクシミド、N−(6−アミノヘキシル)−N−エチルイソルミノール等が挙げられる。中でもルミノール又はイソルミノールが好ましく、特にルミノールが好ましい。ルミノールは、通常入手できる試薬グレードのものには、製造原料であるヒドラジン及び硫化物イオンが混入している場合が多いので、再結晶を繰返し精製したものを用いるのが好ましい。
【0008】
化学発光反応に用いる酸化剤としては、過酸化水素、過硼素酸塩、過酸化尿素などが挙げられるが、過酸化水素が好ましい。
化学発光反応に用いる増感剤は、増発光効果や発光持続性効果のあるものであれば特に限定するものではないが、p−ヨードフェノール、p−ブロムフェノール、フェノールインドフェノール、4−[4′−(2′−メチル)チアゾリル]フェノール等のフェノール誘導体、6−ハイドロキシベンゾチアゾール、4− (4−ハイドロキシフェニル)チアゾール等のベンゾチアゾール誘導体、3− (10−フェノチアジル)−プロピルスルホン酸塩、p−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、ジエチルアニリン等が好ましいものとして用いられる。特に好ましいものは、S/N比(シグナルとノイズの比)が高い点で4−[4′−(2′−メチル)チアゾリル]フェノールである。
【0009】
本発明の化学発光測定試薬は、化学発光に関与する物質を▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の2液として保存してなる。このように保存すると、従来のような化学発光基質を▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質溶液、▲3▼増感剤溶液の3液系として保存する必要がないので、試薬キットの構成を簡素化でき、測定機器付属の自動分注装置に適用できる試薬数が少ない場合は便利である上、保存安定性も3液系と同等以上であり、優れる場合もある。
酸化剤溶液は安定性又は発光反応のS/N比を高めるために、緩衝液に防腐剤や界面活性剤やタンパク質等を添加した溶液を溶媒として用いるのが好ましい。酸化剤の濃度は、高発光が得られ、基質阻害がかからない濃度であれば特に限定するものではないが、溶液中0.1〜10mMが好ましい。
化学発光基質・増感剤溶液は、安定した発光を得るためにpH8〜13のアルカリ性であることが好ましい。
増感剤濃度は、S/N比の高い発光が得られれば特に限定するものではないが、溶液中0.01〜5mMの範囲が好ましい。
発光基質濃度は高発光が得られ、基質阻害がかからない濃度であれば特に限定するものではないが、溶液中0.01〜50mMの範囲が好ましい。
【0010】
本発明の化学発光測定方法は、予め化学発光に関与する物質を▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の2液として調製し、
(a)ペルオキシダーゼを含む反応系に、▲1▼の溶液、▲2▼の混液の順に添加するか、(b)▲1▼の溶液及び▲2▼の混液を、別々にかつ同時にペルオキシダーゼを含む反応系に添加するか、
(c)▲1▼の溶液及び▲2▼の混液の2液を使用直前に混合して、ペルオキシダーゼを含む反応系に添加するものである。
これらの方法をとることにより、従来の方法に比べて化学発光量の大きい、高感度な測定をすることができる。これらのうち、(c)の方法より(a)、(b)のほうが感度が高く好ましく、さらに(b)の方法より(a)の方法のほうが、感度がより高く好ましい。
なお、これらの測定方法には、前記の本発明の化学発光測定試薬を用いることができる。
【0011】
▲1▼の溶液と▲2▼の混液は、等量ずつ用いられるように、酸化剤、発光基質、増感剤の濃度をあらかじめ調整しておくと、使用時に制約が少なく便利である。
また、低温では、化学発光反応が遅いので、反応は室温(15〜30℃)で行うのが好ましい。そのために▲1▼の溶液、▲2▼の混液を低温で保管している場合には、これらの試薬を反応前に室温に戻しておくことが好ましい。
反応時間は、用いる増感剤の種類等により異なるが、経時的に安定した発光が得られる時間を選択する方が良い。通常は、1時間以内が好ましく、特にフェノール誘導体を増感剤に用いた場合は、20分以内が好ましい。
本発明を利用できる測定対象物は、ペルオキシダーゼを直接又は標識物として用いる反応を利用するものであれば特に限定するものではないが、酵素免疫測定法との組み合わせによりamolオーダーまでの高感度測定が可能となるので、成長ホルモンやエンドセリンの測定にも好ましい方法として適用できる。
また、化学発光反応はpHが高いほど発光量は増大するが、同時にペルオキシダーゼの触媒能に依存しない発光量も増大するので、両者を考慮してpH7〜11の範囲で反応が行えるように試薬のpHを調整することが好ましい。
【0012】
【実施例】
本発明をさらに実施例により詳述する。
実施例1
化学発光測定試薬の組成が保存安定性に及ぼす影響
化学発光測定試薬の組成が保存安定性に及ぼす影響を検討するため、以下の実験を行った。すなわち、化学発光基質の構成試薬の数を1〜3とし、それぞれを37℃で一週間保管し、保管した試薬を用いた化学発光反応で発光量の変化を見ることにより、試薬の保存安定性を調べた。
まず、次の4構成の試薬を調製した。
(1)3液系
▲1▼過酸化水素溶液(4mM過酸化水素を含む50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10))
▲2▼増感剤溶液(2mM4−[4′−(2′−メチル)チアゾリル]フェノールを含むジメチルスルホキシド)
▲3▼ルミノール溶液(20mMルミノールを含む45.5mMNaOH)
(2)2液系A
▲1▼過酸化水素・増感剤混液(上記3液系試薬の▲1▼と▲2▼を体積比50:8の割合で混合)
▲2▼ルミノール溶液(20mMルミノールを含む45.5mMNaOH)
(3)2液系B(本発明の試薬)
▲1▼過酸化水素溶液(4mM過酸化水素を含む50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10))
▲2▼ルミノール・増感剤混液(上記3液系試薬の▲2▼と▲3▼を体積比8:50の割合で混合)
(4)1液系
▲1▼過酸化水素・ルミノール・増感剤混液
(上記3液系試薬の▲1▼と▲2▼と▲3▼を体積比50:8:50の割合で混合)
【0013】
化学発光量の測定は次の通り行った。黒色のマイクロフルオロリモーバウェル(ダイナテク社製)にペルオキシダーゼ標識抗エンドセリン抗体液(ヤマサ醤油社製)を0.1%(w/v)脱脂粉乳、0.1%(v/v)ツイーン20を含む50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)で10万分の1に希釈した溶液)100μlを添加した。次に、上記の3液系試薬を用いる場合には▲1▼を50μl、▲2▼を8μl、▲3▼を50μlの順に約1分間隔で添加、2液系A試薬を用いる場合には▲1▼を58μl、▲2▼を50μlの順に約1分間隔で添加、2液系B試薬を用いる場合には▲1▼を50μl、▲2▼を58μlの順に約1分間隔で添加、1液系試薬を用いる場合には▲1▼を108μl添加した後、混合撹拌し10分後に、化学発光測定装置(コロナ電気社製(MLR−100))を用いて発光量を測定した。
上記で1〜3液系に調製した4構成の試薬を37℃で保存し、そのうちの一定量を経時的にサンプリングし、上記と同様に化学発光量を測定した。
図1に化学発光測定試薬の保存日数と発光量との関係を示したが、1液系と2液系Aでは保存2日でほとんど発光が得られなくなったので、過酸化水素と増感剤、さらにルミノールとの混合により、化学発光測定試薬が急激に劣化することがわかった。一方、3液系と2液系Bは保存安定性は良好であり、過酸化水素溶液、ルミノール・増感剤混液の形で保存した場合(2液系B)は、過酸化水素、増感剤、ルミノールを分けて保存した場合(3液系)と同等以上であることがわかった。
【0014】
実施例2
化学発光測定試薬の添加方法が発光量に及ぼす影響
実施例1で保存安定性が良好な化学発光測定試薬(3液系及び2液系B)の化学発光反応系への添加方法について検討した。
抗エンドセリンモノクローナル抗体(ヤマサ醤油社製(MCA ET−01))を固定化した黒色のマイクロフルオロリモーバウェル(ダイナテク社製)に、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)でエンドセリン−1を種々の濃度(0〜100ng/ml)に希釈した溶液200μlを注入し、24時間反応後ウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗エンドセリン抗体(ヤマサ醤油社製)の100倍希釈液を200μl注入し3時間反応させることにより、抗原抗体反応によりウェルに固定したエンドセリン−1と結合させた。洗浄後、ペルオキシダーゼを触媒とするルミノール/過酸化水素の化学発光を測定した。
【0015】
測定に用いた化学発光測定試薬を次に示す。
(1)3液系
▲1▼過酸化水素溶液(2mM過酸化水素、0.1%(w/v)脱脂粉乳、0.1%(v/v)ツイーン20を含む50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10))
▲2▼増感剤溶液(2mM4−[4′−(2′−メチル)チアゾリル]フェノールを含むジメチルスルホキシド)
▲3▼ルミノール溶液(20mMルミノールを含む45.5mMNaOHと50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)の体積比1:1の混合液)
(2)2液系
▲1▼過酸化水素溶液(2mM過酸化水素、0.1%(w/v)脱脂粉乳、0.1%(v/v)ツイーン20を含む50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10))
▲2▼ルミノール・増感剤混液(上記3液系試薬の▲2▼と▲3▼を体積比8:100の割合で混合)
【0016】
測定aは3液系試薬の▲1▼を100μl、▲2▼を8μl、▲3▼を100μlの順に約1分間隔で添加、測定bは3液系試薬の▲2▼を8μl、▲1▼を100μl、▲3▼を100μlの順に約1分間隔で添加、測定cは2液系試薬の▲1▼を100μl、▲2▼を108μlの順に約1分間隔で添加、測定dは2液系試薬の▲1▼100μlと▲2▼108μlを別々にかつ同時に添加、測定eは2液系試薬の▲1▼と▲2▼を体積比100:108の割合で使用直前に混合したものを208μl添加した後、混合撹拌し10分後に、化学発光測定装置(コロナ電気社製(MLR−100))を用いて発光量を測定した。
図2にエンドセリン−1濃度と発光量との関係を示したが、増感剤溶液を第一番目に添加した測定bではほとんど発光が得られなかった。その他の測定では、エンドセリン−1 30ng/ml以上で発光量は一定となるが矛盾のない良好な発光量が得られた。また、化学発光量は測定c、測定d、測定e、測定aの順で大きかった。
【0017】
【発明の効果】
本発明の化学発光測定試薬は、試薬キットの構成が簡素化されると共に保存安定性に優れる。また、この測定試薬を用いる本発明の化学発光測定方法は、発光量が高く、高感度の測定が可能である。従って、酵素免疫測定法、DNAプローブ法等による生体微量成分の定量・分析等、臨床検査や臨床化学の分野で広範囲に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】横軸に化学発光測定試薬の保存日数、縦軸にそれぞれの試薬を用いた化学発光反応で定量された発光量を示し、化学発光測定試薬の保存安定性を表すグラフである。発光量の1カウントは、1.2×10−16Wである。
【図2】横軸にエンドセリン−1濃度、縦軸に発光量を示し、化学発光試薬の添加方法と発光量との関係を表すグラフである。発光量の1カウントは、1.2×10−16Wである。
Claims (8)
- 酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定試薬であって、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の2液として保存してなる化学発光測定試薬。
- 化学発光基質がルミノール類である請求項1記載の化学発光測定試薬。
- 酸化剤が過酸化水素である請求項1又は2記載の化学発光測定試薬。
- 酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の2液を調製し、ペルオキシダーゼを含む反応系に、▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の順に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
- 酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の2液を調製し、これらを別々にかつ同時にペルオキシダーゼを含む反応系に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
- 酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲1▼酸化剤溶液、▲2▼化学発光基質・増感剤混液の2液を調製し、使用直前にこれらを混合して、ペルオキシダーゼを含む反応系に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
- 化学発光基質がルミノール類である請求項4、5又は6記載の化学発光測定方法。
- 酸化剤が過酸化水素である請求項4、5、6又は7記載の化学発光測定方法。
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