JPH0638757B2 - ペルオキシダ−ゼまたはｈ▲下２▼ｏ▲下２▼の測定方法 - Google Patents
ペルオキシダ−ゼまたはｈ▲下２▼ｏ▲下２▼の測定方法Info
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- JPH0638757B2 JPH0638757B2 JP61187147A JP18714786A JPH0638757B2 JP H0638757 B2 JPH0638757 B2 JP H0638757B2 JP 61187147 A JP61187147 A JP 61187147A JP 18714786 A JP18714786 A JP 18714786A JP H0638757 B2 JPH0638757 B2 JP H0638757B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ペルオキシダーゼの測定または過酸化水素
（Ｈ２Ｏ２）の測定法に関する。
（Ｈ２Ｏ２）の測定法に関する。
ペルオキシダーゼの測定またはＨ２Ｏ２の測定は、各種
の生体物質の測定において重要であり、臨床検査の分野
で広く用いられている。例えば、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）により抗原または抗体を測定するに際しては、酵素
活性を測定することが必要であるが、この酵素としては
ペルオキシダーゼが多用されている。具体的な例を示す
と、サンドイッチ法と称されるＥＩＡを用いて抗原を測
定する場合、固相に固定された抗体に測定する抗原を結
合させ、洗浄後、酵素（ペルオキシダーゼ）で標識した
抗体を固相化抗体についた抗原に結合させた後、再び洗
浄し酵素反応を行ってその活性を測定する。測定された
酵素活性（ペルオキシダーゼ活性）は、結合した酵素標
識抗体の量に相当し、酵素標識抗体の量は存在していた
抗原の量に相当する。即ち、酵素活性（ペルオキシダー
ゼ活性）を測定することによって目的とする抗原の測定
が可能となる。ここで、ペルオキシダーゼは、次の式で
示される酵素反応を触媒する酵素である。
の生体物質の測定において重要であり、臨床検査の分野
で広く用いられている。例えば、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）により抗原または抗体を測定するに際しては、酵素
活性を測定することが必要であるが、この酵素としては
ペルオキシダーゼが多用されている。具体的な例を示す
と、サンドイッチ法と称されるＥＩＡを用いて抗原を測
定する場合、固相に固定された抗体に測定する抗原を結
合させ、洗浄後、酵素（ペルオキシダーゼ）で標識した
抗体を固相化抗体についた抗原に結合させた後、再び洗
浄し酵素反応を行ってその活性を測定する。測定された
酵素活性（ペルオキシダーゼ活性）は、結合した酵素標
識抗体の量に相当し、酵素標識抗体の量は存在していた
抗原の量に相当する。即ち、酵素活性（ペルオキシダー
ゼ活性）を測定することによって目的とする抗原の測定
が可能となる。ここで、ペルオキシダーゼは、次の式で
示される酵素反応を触媒する酵素である。
Ｈ２Ｏ２＋ＡＨ２→２Ｈ２Ｏ＋Ａ （Ｉ） 式中、ＡＨ２は発色基質を表す。即ち、ペルオキシダー
ゼの存在下に該式で表される酵素反応が起こるとＨ２Ｏ
２により発色基質が酸化されて発色を呈することにな
る。したがって、一定量のＨ２Ｏ２の存在下に発色基質
の発色の程度を分光学的に測定すればペルオキシダーゼ
の活性を知ることができ、前述したようなＥＩＡにおい
てはこの原理を利用して酵素活性（ペルオキシダーゼ活
性）を測定する。
ゼの存在下に該式で表される酵素反応が起こるとＨ２Ｏ
２により発色基質が酸化されて発色を呈することにな
る。したがって、一定量のＨ２Ｏ２の存在下に発色基質
の発色の程度を分光学的に測定すればペルオキシダーゼ
の活性を知ることができ、前述したようなＥＩＡにおい
てはこの原理を利用して酵素活性（ペルオキシダーゼ活
性）を測定する。
一方、（Ｉ）式で示される酵素反応を利用して、血中の
グルコース（ぶどう糖）や尿酸等の測定に必要なＨ２Ｏ
２の測定も行われており、この場合には、一定量のペル
オキシダーゼの存下に該酵素反応を行わせることにな
る。例えば、グルコースをグルコースオキシダーゼで酸
化してＨ２Ｏ２を生成し（このＨ２Ｏ２がグルコースの
量に対応する）、ペルオキシダーゼの存在下で、発色基
質の発色の変化を分光学的に測定することにより該Ｈ２
Ｏ２の量を測定し、グルコースの量を知ることができ
る。
グルコース（ぶどう糖）や尿酸等の測定に必要なＨ２Ｏ
２の測定も行われており、この場合には、一定量のペル
オキシダーゼの存下に該酵素反応を行わせることにな
る。例えば、グルコースをグルコースオキシダーゼで酸
化してＨ２Ｏ２を生成し（このＨ２Ｏ２がグルコースの
量に対応する）、ペルオキシダーゼの存在下で、発色基
質の発色の変化を分光学的に測定することにより該Ｈ２
Ｏ２の量を測定し、グルコースの量を知ることができ
る。
従来、ペルオキシダーゼ活性測定あるいはＨ２Ｏ２測定
の発色基質として、一般に、ｏ−フエニレンジアミン
（ＯＰＤ）、２、２′−アジノージ（３−エチル−シア
ゾリン−サルフェート）（ＡＢＴＳ）等が用いられてい
るが、これらの基質は感度は高いが、突然変異誘発物質
であり、特にＯＰＤは発癌性の疑いのある有害物質とし
て知られている。
の発色基質として、一般に、ｏ−フエニレンジアミン
（ＯＰＤ）、２、２′−アジノージ（３−エチル−シア
ゾリン−サルフェート）（ＡＢＴＳ）等が用いられてい
るが、これらの基質は感度は高いが、突然変異誘発物質
であり、特にＯＰＤは発癌性の疑いのある有害物質とし
て知られている。
最近、これらの発色基質に代わるものとして、３、
３′、５、５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等
のベンジジン誘導体が、有効かつ高感度であるという報
告がなされている。ＴＭＢ等のベンジジン誘導体は、Ｏ
ＰＤやＡＢＴＳ等に比べて更に感度が高く、発癌性も認
められない。このベンジジン誘導体は有機溶媒にのみ可
溶である。他方、前述した（Ｉ）式で示されるような酵
素反応は、本来、水溶液中で行われることが好ましく、
有機溶媒を用いると酵素活性を低下させて感度を悪くす
る傾向がある。そこで、ＴＭＢ等を発色基質として用い
る場合には、有機溶媒にバッファー水溶液を加えた混合
溶媒に溶解させている。しかし、このような混合溶媒に
ＴＭＢ等を溶解させた状態では保存安定性が低く、長時
間おくと白色の沈澱を生じるため、短時間に測定を実施
しなければならないという制約がある。有機溶媒を含有
する混合溶媒系に工夫を疑らして沈澱が可及的に生じな
いようにしたものであるが、この場合においては、溶解
後空気酸化等によって酵素反応によらない非特異的な発
色が起こることが認められている。また、使用する溶媒
によっては、廃液処理の問題も生じてくる。
３′、５、５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等
のベンジジン誘導体が、有効かつ高感度であるという報
告がなされている。ＴＭＢ等のベンジジン誘導体は、Ｏ
ＰＤやＡＢＴＳ等に比べて更に感度が高く、発癌性も認
められない。このベンジジン誘導体は有機溶媒にのみ可
溶である。他方、前述した（Ｉ）式で示されるような酵
素反応は、本来、水溶液中で行われることが好ましく、
有機溶媒を用いると酵素活性を低下させて感度を悪くす
る傾向がある。そこで、ＴＭＢ等を発色基質として用い
る場合には、有機溶媒にバッファー水溶液を加えた混合
溶媒に溶解させている。しかし、このような混合溶媒に
ＴＭＢ等を溶解させた状態では保存安定性が低く、長時
間おくと白色の沈澱を生じるため、短時間に測定を実施
しなければならないという制約がある。有機溶媒を含有
する混合溶媒系に工夫を疑らして沈澱が可及的に生じな
いようにしたものであるが、この場合においては、溶解
後空気酸化等によって酵素反応によらない非特異的な発
色が起こることが認められている。また、使用する溶媒
によっては、廃液処理の問題も生じてくる。
一方、発色基質としてＴＭＢ等のベンジジン誘導体の塩
を用いることを提案されている。この塩は水系で使用す
ることができるので、前述したような有機溶媒の使用に
伴う問題を回避することができ、また、ＯＰＤ等を用い
た系に比べて数倍の吸光度を得ることも可能である。し
かし、このようなＴＭＢの塩等を用いる場合において
も、溶解後の水溶液の状態では、酵素反応によらない非
特異的な発色が起こるために感度を低下させることがあ
るという問題を残している。
を用いることを提案されている。この塩は水系で使用す
ることができるので、前述したような有機溶媒の使用に
伴う問題を回避することができ、また、ＯＰＤ等を用い
た系に比べて数倍の吸光度を得ることも可能である。し
かし、このようなＴＭＢの塩等を用いる場合において
も、溶解後の水溶液の状態では、酵素反応によらない非
特異的な発色が起こるために感度を低下させることがあ
るという問題を残している。
本発明の目的は、前述したような従来の問題を解決し、
ペルオキシダーゼまたはＨ２Ｏ２の優れた測定法を提供
することにある。
ペルオキシダーゼまたはＨ２Ｏ２の優れた測定法を提供
することにある。
本発明者は、この目的を果たすために研究を重ねた結
果、特定のベンジジン誘導体の塩を発色基質として用い
るとともに、系中に少量のキレート剤を存在させること
により、従来の問題を解決し得ることを見いだした。か
くして、本発明は、キレート剤の存在下に、発色基質と
して一般式 （式中Ｒは、水素原子、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基または
メトキシ基を示す） のベンジジン誘導体の塩を用いることを特徴とするペル
オキシダーゼまたはＨ２Ｏ２を測定する方法を提供す
る。
果、特定のベンジジン誘導体の塩を発色基質として用い
るとともに、系中に少量のキレート剤を存在させること
により、従来の問題を解決し得ることを見いだした。か
くして、本発明は、キレート剤の存在下に、発色基質と
して一般式 （式中Ｒは、水素原子、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基または
メトキシ基を示す） のベンジジン誘導体の塩を用いることを特徴とするペル
オキシダーゼまたはＨ２Ｏ２を測定する方法を提供す
る。
本発明に従うペルオキシダーゼまたはＨ２Ｏ２の測定法
においては、発色基質として高感度で水溶性のベンジジ
ン誘導体の塩を用いるので、有機溶媒を含有する混合溶
媒を用いる場合のように沈澱が生じることはなく、ま
た、非特異的な発色が起こることもなく、きわめて長時
間にわたって発色系が安定に保持される。従って、本発
明の方法は、ペルオキシダーゼまたはＨ２Ｏ２を高感度
で測定でき、しかも、発色系の調整後しばらく経過して
から測定を行うことも可能であるので実用的にも極めて
有利である。
においては、発色基質として高感度で水溶性のベンジジ
ン誘導体の塩を用いるので、有機溶媒を含有する混合溶
媒を用いる場合のように沈澱が生じることはなく、ま
た、非特異的な発色が起こることもなく、きわめて長時
間にわたって発色系が安定に保持される。従って、本発
明の方法は、ペルオキシダーゼまたはＨ２Ｏ２を高感度
で測定でき、しかも、発色系の調整後しばらく経過して
から測定を行うことも可能であるので実用的にも極めて
有利である。
本発明に従いキレート剤を存在させることにより発色系
が安定に保持される理由は必ずしも明らかではないが、
水中に含まれ非特異的反応に対して触媒作用を有するよ
うな微量の金属がキレート剤によりキレート化されて該
触媒作用が阻止されるためと推察される。キレート剤と
しては、以下に示すような化合物が好ましく、傾向とし
て、四座または六座配位子を有するものが好ましい。
が安定に保持される理由は必ずしも明らかではないが、
水中に含まれ非特異的反応に対して触媒作用を有するよ
うな微量の金属がキレート剤によりキレート化されて該
触媒作用が阻止されるためと推察される。キレート剤と
しては、以下に示すような化合物が好ましく、傾向とし
て、四座または六座配位子を有するものが好ましい。
・エチレンジアミン四酢酸 （ＥＤＴＡ） ・トランス−シクロヘキサンジアミン四酢酸 （ＣｙＤＴＡ） ・グリコールエーテルジアミン四酢酸 （ＧＥＤＴＡ） ・エチレンジアミン三酢酸 （ＥＤＴＡ−ＯＨ） ・メチレンスルホン酸 （ＥＤＴＰＯ） ・トリエチレンテトラミン六酢酸 （ＴＴＨＡ） およびこれらの塩 ・ニトロトリス（メチルスルホン酸）三ナトリウム塩
（ＥＤＴＡ） ・ビシン また、クエン酸ナトリウム塩、シュウ酸ナトリウム等も
効果が認められる。本発明の方法においては、これらの
キレート剤を少量、即ち、１．０ｍＭ未満の濃度で使用
することが好ましく、特に０．３〜０．７ｍＭの濃度で
使用することが好ましい。キレート剤の濃度が高くなる
と沈澱が生じ、他方、キレート剤の濃度が低いと非特異
的発色が生じることが認められている。
（ＥＤＴＡ） ・ビシン また、クエン酸ナトリウム塩、シュウ酸ナトリウム等も
効果が認められる。本発明の方法においては、これらの
キレート剤を少量、即ち、１．０ｍＭ未満の濃度で使用
することが好ましく、特に０．３〜０．７ｍＭの濃度で
使用することが好ましい。キレート剤の濃度が高くなる
と沈澱が生じ、他方、キレート剤の濃度が低いと非特異
的発色が生じることが認められている。
本発明において用いられるベンジジン誘導体の塩は、塩
酸塩が好ましいが、硫酸塩などの他の塩も使用可能であ
る。
酸塩が好ましいが、硫酸塩などの他の塩も使用可能であ
る。
本発明の方法に従い、前述したようなＥＩＡにより各種
の抗原または抗体を測定するには、ベンジジンの誘導体
の塩（発色基質）、キレート剤およびＨ２Ｏ２を含有す
る基質水溶液を調製し、これをペルオキシダーゼで標識
した抗原−抗体反応系に加え、前述の（Ｉ）式で表され
得るような酵素反応を行わせる。所定時間経過後、適当
な停止液で酵素反応を停止させ、発色基質に起因する吸
光度を測定することによりペルオキシダーゼ活性を求め
て、抗原または抗体の濃度を知ることになる。しかし
て、本発明の方法の特徴の一つは、発色基質、キレート
剤およびＨ２Ｏ２から成る基質水溶液が極めて安定であ
り、長時間放置していても非特異的な吸光度の変化は認
められないことである。従って、本発明の方法は、基質
水溶液を調整した後、都合のよいときに酵素反応を行わ
せることができるという利点がある。さらに、本発明に
従えば、停止液添加後の溶液も非常に安定であり、吸光
度の経時的な変化は認められず、従って、本発明の方法
は分光学的測定を随時に実施できるという点においても
実用的である。
の抗原または抗体を測定するには、ベンジジンの誘導体
の塩（発色基質）、キレート剤およびＨ２Ｏ２を含有す
る基質水溶液を調製し、これをペルオキシダーゼで標識
した抗原−抗体反応系に加え、前述の（Ｉ）式で表され
得るような酵素反応を行わせる。所定時間経過後、適当
な停止液で酵素反応を停止させ、発色基質に起因する吸
光度を測定することによりペルオキシダーゼ活性を求め
て、抗原または抗体の濃度を知ることになる。しかし
て、本発明の方法の特徴の一つは、発色基質、キレート
剤およびＨ２Ｏ２から成る基質水溶液が極めて安定であ
り、長時間放置していても非特異的な吸光度の変化は認
められないことである。従って、本発明の方法は、基質
水溶液を調整した後、都合のよいときに酵素反応を行わ
せることができるという利点がある。さらに、本発明に
従えば、停止液添加後の溶液も非常に安定であり、吸光
度の経時的な変化は認められず、従って、本発明の方法
は分光学的測定を随時に実施できるという点においても
実用的である。
酵素反応を停止させるには、従来より、硫酸または塩酸
等の強酸を高濃度（Ｈ２ＳＯ４：１〜４Ｎ、ＨＣ１：４
Ｎ等）で用いている。本発明者は、ペルオキシダーゼの
濃度が低く吸光度が低い場合にはこのような停止液も使
用できるが、ペルオキシダーゼの濃度が高く吸光度が高
い場合には、従来のような停止液の濃度では、反応から
数分後に黒い沈澱を生じ、殆ど測定が不可能となること
を見いだしている。従って、本発明の好ましい態様に従
えば、停止液として最終濃度０．１〜０．２Ｎとなるよ
うな硫酸を加えることによって、広い範囲のペルオキシ
ダーゼ活性の測定が可能となる。また、この濃度の停止
液を用いることによって、酵素反応の吸光度を２時間後
でも殆ど変化なく測定できる。本発明の方法は、上述し
たようなＥＩＡによる抗原や抗体の測定に必要なペルオ
キシダーゼの測定の他に、Ｈ２Ｏ２を測定することによ
る血中のグルコースや尿酸等の生体物質の測定にも適用
できる。例えば、グルコースを測定する場合には、グル
コースオキシダーゼ（グルコース酸化酵素）、ベンジジ
ン誘導体の塩（発色基質）、キレート剤および一定量の
ペルオキシダーゼを含有する試薬を調整し、これに、グ
ルコース濃度を測定すべき検体を加える。この場合にお
いても、キレート剤を含有する本発明に従う該試薬は、
発色基質が経時的に非特異的発色を呈することもなく極
めて安定である。従って、その様な本発明に従う試薬を
用いて酵素反応を行わせ、Ｈ２Ｏ２の量に対応する発色
基質の吸光度を測定することによりグルコースの濃度を
精度よく求めることができる。なお、この場合において
は、酵素反応の停止液を加えることはせず、グルコース
量に対応するＨ２Ｏ２が消費されるまで反応を行わせた
後、吸光度を測定する。
等の強酸を高濃度（Ｈ２ＳＯ４：１〜４Ｎ、ＨＣ１：４
Ｎ等）で用いている。本発明者は、ペルオキシダーゼの
濃度が低く吸光度が低い場合にはこのような停止液も使
用できるが、ペルオキシダーゼの濃度が高く吸光度が高
い場合には、従来のような停止液の濃度では、反応から
数分後に黒い沈澱を生じ、殆ど測定が不可能となること
を見いだしている。従って、本発明の好ましい態様に従
えば、停止液として最終濃度０．１〜０．２Ｎとなるよ
うな硫酸を加えることによって、広い範囲のペルオキシ
ダーゼ活性の測定が可能となる。また、この濃度の停止
液を用いることによって、酵素反応の吸光度を２時間後
でも殆ど変化なく測定できる。本発明の方法は、上述し
たようなＥＩＡによる抗原や抗体の測定に必要なペルオ
キシダーゼの測定の他に、Ｈ２Ｏ２を測定することによ
る血中のグルコースや尿酸等の生体物質の測定にも適用
できる。例えば、グルコースを測定する場合には、グル
コースオキシダーゼ（グルコース酸化酵素）、ベンジジ
ン誘導体の塩（発色基質）、キレート剤および一定量の
ペルオキシダーゼを含有する試薬を調整し、これに、グ
ルコース濃度を測定すべき検体を加える。この場合にお
いても、キレート剤を含有する本発明に従う該試薬は、
発色基質が経時的に非特異的発色を呈することもなく極
めて安定である。従って、その様な本発明に従う試薬を
用いて酵素反応を行わせ、Ｈ２Ｏ２の量に対応する発色
基質の吸光度を測定することによりグルコースの濃度を
精度よく求めることができる。なお、この場合において
は、酵素反応の停止液を加えることはせず、グルコース
量に対応するＨ２Ｏ２が消費されるまで反応を行わせた
後、吸光度を測定する。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。
実施例１ ５種類のキレート剤（ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＣｙＤＴＡ、
ＤＴＰＡ，ＧＥＤＴＡ，クエン酸ナトリウム）をテトラ
メチルベンジジン塩酸塩０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｈ２Ｏ２0.
006％を含有する水溶液に添加し、室温に放置して、650
ｎｍにおける吸光度を測定することによりその安定性を
調べた。その結果を第１表に示す。表から、キレート剤
を添加しない場合には経時的に発色が進行しているのに
対し、本発明に従いキレート剤を添加したときにはその
ような発色は殆ど認められずに安定しており、空気酸化
等の影響を受けないことが理解される。
ＤＴＰＡ，ＧＥＤＴＡ，クエン酸ナトリウム）をテトラ
メチルベンジジン塩酸塩０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｈ２Ｏ２0.
006％を含有する水溶液に添加し、室温に放置して、650
ｎｍにおける吸光度を測定することによりその安定性を
調べた。その結果を第１表に示す。表から、キレート剤
を添加しない場合には経時的に発色が進行しているのに
対し、本発明に従いキレート剤を添加したときにはその
ような発色は殆ど認められずに安定しており、空気酸化
等の影響を受けないことが理解される。
実施例２ テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ・ＨＣｌ）、テ
トラメトキシベンジジン塩酸塩（ＴＭＯＢ・ＨＣｌ）を
用い、キレート剤として、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＣｙＤＴ
Ａを添加して、実施例１と同様の方法により、酵素基質
としての安定性を調べた。比較のためにＴＭＢ・ＨＣｌ
を用いるが、キレート剤を添加しない従来のものについ
ても安定性を調べた。
トラメトキシベンジジン塩酸塩（ＴＭＯＢ・ＨＣｌ）を
用い、キレート剤として、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＣｙＤＴ
Ａを添加して、実施例１と同様の方法により、酵素基質
としての安定性を調べた。比較のためにＴＭＢ・ＨＣｌ
を用いるが、キレート剤を添加しない従来のものについ
ても安定性を調べた。
試薬Ａ ＴＭＢ・ＨＣｌ ０．４ｍｇ／ｍｌ ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．５ｍＭ Ｈ２Ｏ２ 0.006％ 試薬Ｂ ＴＭＯＢ・ＨＣｌ ０．４ｍｇ／ｍｌ ＣｙＤＴＡ・２Ｎａ ０．５ｍＭ Ｈ２Ｏ２ 0.006％ 従来試薬 ＴＭＢ・ＨＣｌ ０．４ｍｇ／ｍｌ Ｈ２Ｏ２ 0.006％ その結果を第１図に示す。該図に示されるように、従来
のＴＭＢ・ＨＣｌのみを用いる方法では吸光度の増加が
みられ、空気酸化等の影を受け非特異的反応が生じると
考えられるのに対し、本発明による試薬Ａ、試薬Ｂでは
非特異的な吸光度の増加はほとんどなく、24時間後でも
吸光度の変化はほとんどみられなかった。
のＴＭＢ・ＨＣｌのみを用いる方法では吸光度の増加が
みられ、空気酸化等の影を受け非特異的反応が生じると
考えられるのに対し、本発明による試薬Ａ、試薬Ｂでは
非特異的な吸光度の増加はほとんどなく、24時間後でも
吸光度の変化はほとんどみられなかった。
実施例３ ＥＩＡ測定によるＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）測定へ
の応用 キレート剤で安定化したＴＭＢ塩酸塩溶液を実際のＥＩ
Ａに応用した。
の応用 キレート剤で安定化したＴＭＢ塩酸塩溶液を実際のＥＩ
Ａに応用した。
所定濃度のＴＳＨ標準液200μとホースラディッシュ
パーオキシダーゼで標識した抗ＴＳＨモノクローナル抗
体溶液200μ及び常法により抗ＴＳＨモノクローナル
抗体を固定したポリスチレンビーズを試験管に入れ、37
℃で２時間反応させ、Ｈ２Ｏでビーズを３回洗浄後、別
の試験管に移しかえた。これに、次の組成の基質水溶液
１ｍｌ添加し、37℃３０分反応させた。
パーオキシダーゼで標識した抗ＴＳＨモノクローナル抗
体溶液200μ及び常法により抗ＴＳＨモノクローナル
抗体を固定したポリスチレンビーズを試験管に入れ、37
℃で２時間反応させ、Ｈ２Ｏでビーズを３回洗浄後、別
の試験管に移しかえた。これに、次の組成の基質水溶液
１ｍｌ添加し、37℃３０分反応させた。
基質水溶液 ＴＭＢ・ＨＣｌ ０．４ｍｇ／ｍｌ ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．５ｍＭ Ｈ２Ｏ２ 0.006％ 更に、０．３ＮのＨ２ＳＯ４溶液１ｍｌを添加して、酵
素反応を停止後、450ｎｍの吸光度を測定した（第２図
参照）。その結果、キレート剤で安定化したＴＭＢ塩酸
塩を用いることにより、酵素活性に影響を与えることな
く従来のＯＰＤ等よりも数倍高い吸光度を安定に得るこ
とができた。また、停止液の反応液は２時間でもほとん
ど変わらない吸光度を示した。更に、調整した基質溶液
は、24時間、冷暗所に保存した後に、上記測定に使用し
てもほとんど変わらない吸光度が得られた。
素反応を停止後、450ｎｍの吸光度を測定した（第２図
参照）。その結果、キレート剤で安定化したＴＭＢ塩酸
塩を用いることにより、酵素活性に影響を与えることな
く従来のＯＰＤ等よりも数倍高い吸光度を安定に得るこ
とができた。また、停止液の反応液は２時間でもほとん
ど変わらない吸光度を示した。更に、調整した基質溶液
は、24時間、冷暗所に保存した後に、上記測定に使用し
てもほとんど変わらない吸光度が得られた。
実施例４ グルコース（血糖）測定への応用 試験管に所定濃度のグルコース標準液20μずつとり、
それぞれに次の組成を有する試薬Ａを３．０ｍｌ加えて
混合し、37℃で１５分間加温した。
それぞれに次の組成を有する試薬Ａを３．０ｍｌ加えて
混合し、37℃で１５分間加温した。
試薬Ａ グルコースオキシダーゼ ５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ０．５Ｕ／ｍｌ ＴＭＢ・ＨＣｌ ０．１ｍｇ／ｍｌ ＤＰＴＡ ０．３ｍＭ 試薬ブランクを対照にして650ｎｍの吸光度を測定し
た。その結果400ｍｇ／ｄｌまで直線性を有する良好な
検量線が得られ、この方法がグルコースの測定に適用で
きることが確認された。
た。その結果400ｍｇ／ｄｌまで直線性を有する良好な
検量線が得られ、この方法がグルコースの測定に適用で
きることが確認された。
第１図は、本発明に従いＴＭＢ塩酸塩にＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ、ＴＭＯＢ塩酸塩にＣｙＤＴＭをそれぞれ添加して得
られた基質溶液の安定性を示すグラフであり、比較のた
めに従来法による基質溶液の安定性も示している。 第２図は、本発明に従いＴＭＢ塩酸塩を用いＥＩＡによ
るＴＳＨを測定する場合の検量線であり、従来のＯＰＤ
に比較して数倍の吸光度を安定に得ることができること
を示している。 第３図は、本発明の方法をグルコースの測定に適用する
場合の検量線を示すものである。
ａ、ＴＭＯＢ塩酸塩にＣｙＤＴＭをそれぞれ添加して得
られた基質溶液の安定性を示すグラフであり、比較のた
めに従来法による基質溶液の安定性も示している。 第２図は、本発明に従いＴＭＢ塩酸塩を用いＥＩＡによ
るＴＳＨを測定する場合の検量線であり、従来のＯＰＤ
に比較して数倍の吸光度を安定に得ることができること
を示している。 第３図は、本発明の方法をグルコースの測定に適用する
場合の検量線を示すものである。
Claims (2)
- 【請求項１】一般式、 （式中Ｒは、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基またはメトキシ基
を示す。） で表されるベンジジン誘導体の塩を含有し、有機溶媒を
含有しない発色基質水溶液を使用するペルオキシダーゼ
またはＨ２Ｏ２を測定する方法において、四座配位子ま
たは六座配位子を有するキレート剤を添加することを特
徴とするペルオキシダーゼまたはＨ２Ｏ２を測定する方
法。 - 【請求項２】キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸、
トランス・シクロヘキサンジアミン四酢酸、グリコール
エーテルジアミン四酢酸、エチレンジアミン三酢酸、メ
チレンスルホン酸、トリエチレンテトラミン六酢酸及び
これらの塩、ニトロリス（メチルスルホン酸）三ナトリ
ウム塩、またはビシンから選ばれるものである特許請求
の範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61187147A JPH0638757B2 (ja) | 1986-08-09 | 1986-08-09 | ペルオキシダ−ゼまたはｈ▲下２▼ｏ▲下２▼の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61187147A JPH0638757B2 (ja) | 1986-08-09 | 1986-08-09 | ペルオキシダ−ゼまたはｈ▲下２▼ｏ▲下２▼の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6342470A JPS6342470A (ja) | 1988-02-23 |
| JPH0638757B2 true JPH0638757B2 (ja) | 1994-05-25 |
Family
ID=16200942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61187147A Expired - Fee Related JPH0638757B2 (ja) | 1986-08-09 | 1986-08-09 | ペルオキシダ−ゼまたはｈ▲下２▼ｏ▲下２▼の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0638757B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4477578B2 (ja) * | 2003-02-17 | 2010-06-09 | 株式会社同仁化学研究所 | 塩素濃度測定などに用いられるのに好適な新規化合物 |
| CN111537463A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-08-14 | 广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院） | 一种定量检测血清中尿酸的方法 |
| JP7232475B2 (ja) * | 2020-12-28 | 2023-03-03 | ヤマサ醤油株式会社 | ロイコ型色原体の安定化方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6036757A (ja) * | 1983-08-08 | 1985-02-25 | Kubota Ltd | 複合シリンダ−ライナ− |
-
1986
- 1986-08-09 JP JP61187147A patent/JPH0638757B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｎａｈｒｕｎｇ，２３（７），Ｐ．７１５−７２１，１９７９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6342470A (ja) | 1988-02-23 |
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