JPS60137300A - ３α−ヒドロキシステロイドの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は３α−ヒＩ・ロキシステロイドの定量方法に関
する。

胆汁酸は肝臓でコレステロールより合成された後、いわ
ゆる腸肝循環系という極めて閉鎖的な回路を循環するた
め、正常人の末梢血中にはどく微量の胆汁酸しか存在し
ない。しかし、肝・胆道系疾患においては、これらの回
路に破綻が生じ直中胆汁酸量が上昇する。従って胆汁酸
の血中濃度の上昇を指標として肝・胆道系疾患の存否を
判定することができると同時に、成る程度の重症度を判
定することも可能吉なる。これらのことから、生体中、
特に血清中の３α−ヒドロキシステロイドの１成分であ
る胆汁酸の測定か肝・胆道系疾患の診断にとって重要な
ものとなっている。

３α−ヒドロキシステロイドの定量分析法としてはクロ
マ］・クラフィー法、酵素法、免疫学的測定法等か報告
されているが、臨床検査の分野では近年簡便な酵素法が
注目されてきている。

即ち、胆汁酸（３α−ヒドロキシステロイド）にニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す）
の存在下、３α−ヒトロキシステロイトチヒドロゲナー
ゼ（以下３α−Ｈ８Ｄと略す）を作用させ、ＮＡＤを還
元型ニコチンアミドアテニンジヌクレオチド（以下Ｎ　
Ａ　ＤＨと略す）とし、このＮＡＤＨを自体公知の方法
９例えばジアホラーゼの作用によりＮＡＤとし、同時に
共存させたニトロブルーテトラゾリウムをジホルマサン
に変換し、これを比色定量する方法等が行なわれている
。

ところが、血中胆汁酸濃度が極めて低いために、従来法
では試料を多量に使用して測定せねばならす、試料成分
による妨害を受けやすくなるなど必ずしも満足のいくも
のではない。

本発明者らはこれらの事情を考慮し種々鋭意検討し、高
感度な測定法を見出した。

即ち９本発明は被検体中の３α−ヒドロキシステロイド
にＮＡＤの存在下３α−Ｈ８Ｄを作用させＮ　Ａ　Ｄ　
Ｈを生じさせ次いで有機酸塩の存在下Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈの
電子を電子キャリヤーを用いて金属イオンに作用させ還
元型金属イオンとし次いで該還元型金属イオンに特異的
な金属比色試薬を作用させ金属錯体を生成させ生じた金
属錯体量を測定する３α−ヒドロキシステロイドの定量
方法を提供するものである。

本発明を実施するには、一定温度（例えば室温〜４０℃
の任意の温度）下に保持したｐｎ６〜８の緩衝液中に被
検体及び金属比色試薬、ＮＡＤ。

電子キャリヤー、鉄（３価）、３α−Ｈ８Ｄ。

反応助剤を加え一定温度下で反応させると次式（Ｄ　、
（ＩＩ）　、（Ｉｌｒ）の反応が進行し金属錯体が生成
する。

３−ケトステロイド十ＮＡＤＨ＋Ｈ＋ ＮＡＤ十鉄（２価） （ＩＩＩ　）鉄（２価）十金属比色試薬−−−−−−−
→鉄（２価）−金属比色試薬（金属錯体）この金属錯体
に適した波長で吸光度変化量を測定するか、もしくは一
定時間後に酸あるいはアルカリ溶液を加え反応を停止さ
せ、適した波長で吸光度をめる。得られた吸光度から盲
検の吸光度を差引いた値を、あらかじめめておいた標準
液の吸光度と比較し被検体中の３α−ヒドロキシステロ
イド量をめる。

なお２本発明に用いる試薬の調製はｐＨ５〜８の緩衝液
に金属比色試薬、ＮＡＤ、電子キャリヤー、鉄（３価）
、３α−Ｉ−ＩＳ’Ｄ及び有機酸塩を個別に加えて使用
してもよく、またはこれら全てをあらかじめ前記の緩衝
液に加えておいて使用してもよい。その地鉄（３価）ま
たは金属比色試薬のいずれかを除いたものを調製保存し
ておき、使用時にこれらを加えて使用することもできる
。

緩衝剤としては通常使用されているものであればいずれ
てもよい。例えばアミノエクンスルホン酸誘導体、アミ
ノプロパンスルホン酸誘導体、アミノ−２−ヒドロキシ
プロパンスルホン酸誘導体等が用いられる。

本発明で使用する電子キャリヤーとしては。

１−メトキシ−５−メチルツェナジニウムメチルサルフ
ェート（以下１−メｈキン−ＰＭＳと略ｔ）、　フェナ
ジンメトサルフェー１−（以下ＰＭＳと略す）及び９−
ジメチルアミンヘンシーα−フェナソキソニウムクロラ
イ１〜（以下メルトラブル−と略す）等が挙げられ、そ
の濃度範囲・は０．１−１０００μｍｏｌ／ｌ、好まし
くは２０−１７０μｍη０１／ｅの範囲で使用される。

金属イオンとしては鉄（３価）イオンが挙げられ、濃度
としては５０−１０００／Ｉｍｏｌ／ｅ、好ましくは１
５０〜１１００μｍｏｌ／ｌの範囲で使用される。

金属比色試薬吉しては、２−（５−フロモピリジルアゾ
）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホ−プロピルアミノ
）アニリン・ナトリウム塩（以下ＰＳＡＡと略す）、＋
　３−（２−ピリジル）−５，６−ビス（２−（５−フ
リルスルホン酸））　−１，２，４−トリアジン（以下
フェレン−８と略す）、３−（２−ピリジル）−５，６
−ジフェニル−１，２，４−トリアジン−Ｐ、Ｐ’−ジ
スルホン酸・１すトリウム塩（以下フェロジンと略す）
。

４．７−ジフェニル−１，１０−フェナンスロリン誘導
体、α、α′−ジピリジル、１，１．０−フェナントロ
リン、３−（２−ピリジル）−５，６−１ニス（４−ス
ルポフーニノ慕）　−１，２，４，７１−リアジン・す
トリウム塩、２，４．６−トリス（２−ピリジル）〜Ｓ
−トリアジン、２−（２−チアゾリルアソ）−４−メチ
ル−５−（スルホメチルアミン）安息香酸、α、β、γ
、δ−テトラフェニルポルフィントリスルホン 塩，４−（２−チアヅリルアン）レゾルミノール、ピロ
カテコールスルホフタレイン、グリシンクレゾールレッ
ＩＳ，ニトロソフェノール誘導体等が挙げられ，その濃
度範囲は０．０　１〜２００ｍｍＯ１／ｌ，好ましくは
８０　μｍｏｌ／ｌ−　５０ｍ　ｍｏｌ／ｌの範囲で使
用される。

有機酸塩としてはオキサミン酸塩，シュウ酸塩，サリチ
ル酸塩，酒石酸塩，ソルビン酸塩。

フクル酸水素塩，乳酸塩，フェニルリン酸塩等が挙けら
れ，その濃度範囲は５〜２００ｍ　ｍｏｌ　／ｌ。

好ましくは１２０〜１　８　０　ｍ’　ｍｏｌ　／ｌの
範囲で使用される。

なお被検体としては血清，血漿または尿等３αーヒドロ
キシステロイドを含むものであれば。

いずれも使用可能である。

次に各種有機酸４を用いた時の結果について記載する。

有機酸塩として０．１６Ｍのオキサミン酸す１−リウム
，シュウ酸すｌ・リウム，サリチル酸す１〜リウム，酒
石酸すトリウム、ソルビン酸すｌ・リウム，フクル酸水
素す１〜リウム，乳酸す］・リウム。

フェニルリン酸すトリウムを各々使用し実施例１の方法
で吸光度を測定した。有機酸塩を添加していない時の吸
光度を１とし，各有機酸塩を添加した時の吸光度を相対
比で示した。

以上のように本発明方法は高感度か得られ。

極めて少量の試料で測定可能なため工業的に極めて有利
な方法である。

次に実施例で本発明の詳細な説明する。

実施例Ｉ ４００μＭのＮＡＤ，１００μＭのＰＳＡＡ。

１５０μＭの１−メ［・キシ−ＰＭｓ，０．］−６Ｍの
オキサミン酸すＩ・リウム，２００Ｕ＃の３α−Ｉ（Ｓ
Ｄ，２００μＭの塩化第二鉄を含む１．、／２０　Ｍビ
ス（２−ヒドロキシメチル）イミノｌ−リス（ヒドロキ
シメチル）メクンー塩酸緩衝液（ｐＩ］７．０）　（以
下測定試液という）１ｍＪに被検体２５μｅを加えて３
７°Ｃで６分間正確に反応させ，次に反応停止液（３，
５ｖ／ｗ％セチルトリメチルアンモニウムクロライドの
１２Ｍ酢酸緩ｍｌ液（ｐＨ３．２）溶液）０．２＋＋＋
６を加える。

５分間放置後，波長５７５ｎｍで吸光度を測定する。ま
た、同一試料について３α−１−Ｔ　Ｓ　Ｄを除いた測
定試液で同様な操作を行ない，検体フランク（盲検）と
する。

なお、被検体としてはクリつコール酸（以下ＧＣと略す
）を添加した血清を無添加血清で種々の濃度に希釈し，
て使用し検量線をめた。

結果 検量線は直線を示した。

実施例２ ］−ノドキシ−ＰＭＳの代わりに５０μＭのＰＭ　Ｓを
使用して実施例１と全く同様の操作を行ない，検量線を
めた。

結果 検量線は直線を示した。

実施例３ １−メトキシ−Ｐ　Ｉ’ｖｌ　Ｓの代わりに２５μＭノ
ル］・ラフルーを使用して実施例１と全く同様の操作を
行ない検量線をめた。

結果 検量線は直線を示した。

実施例４ ］？ＳＡＡの代わりに６０ｍｍｏｌ／ｌフェレンー８を
使用して実施例１と全く同様の操作を行ない検量線をめ
た。

結果 検量線・は直線を示した。

実施例５ ＰＳＡＡの代わりに６０ｍｍｏｌ／ｌフェロジンを使用
して実施例１と全く同様の操作を行ない検量線をめた。

結果 検量線は直線を示した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 被検体中の３α−ヒドロキシステロイドにニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチドの存在下３α−ヒドロギシス
   テロイトテヒ１−ロゲナーゼを作用させ還元型ニコチン
   アミ１〜アテニンジヌクレオチ１−を生じさせ次いで有
   機酸塩の存在下還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチドの電子を電子キャリヤーを用いて金属イオンに作
   用させ還元型金属イオンとし次いて該還元型金属イオン
   に特異的な金属比色試薬を作用さぜ金属錯体を生成させ
   生じた金属錯体量を測定することを特徴とする３α−ヒ
   ドロキシステロイドの定量方法。