JPH02142498A - 体液中のカルシウム測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は体液中のカルシウム測定方法に関する。

ざらに詳しくは、ピルビン酸キナーゼがカルシウムによ
って阻害されることを利用した体液中のカルシウムωの
測定方法に関する。

発明の背景 現在、病院の検査室において、種々の体液（血清、尿等
）中のカルシウム量が測定され、疾患の診断に用いられ
ている。

カルシウムは生体内での細胞機能や、血液の凝固機能に
重要な役割を果しているが、ヒト血漿中の量は非常に厳
密に調節されていると言われており、異常低値および高
値を知ることでの診断価値が高い。

例えば、低カルシウム血症としては、低タンパク血症、
低リン血症、腎炎、ネフローゼ、クル病等の疾患、高カ
ルシウム血症としては、骨腫瘍、アジラン病、肺気腫等
の疾患の可能性があり、これらの診断に用いることがで
きる。

しかしながら、従来の方法では正確かつ簡便にカルシウ
ム量を測定することができなかった。

従来の技術およびその問題点 体液中のカルシウム測定法としては、以下の方法が知ら
れている。。

１）滴定法 ２）比色法 ３）原子吸光法 ４）突先分析法 ５）電極法 ６）酵素法 １）の滴定法は、シュウ酸塩やキレートを用いて、化学
的に滴定する方法であるが煩雑であることと、実施者に
より測定値に差異が出るという欠点を有する。

（２）の比色法のうち、発色剤にｏ−ＰＣＰ（オル（〜
−クレゾールフタレインコンプレクソン）を用いる方法
は、８−ヒドロキシキノリンを添加し、ＭＣＩ２＋イオ
ンの影響を排除するもので、現在、病院検査室で最も汎
用されている。

しかしながら、 １．８−ヒドロキシキノリンを加えてもなお数％程度の
Ｍ（］２＋イオンの影響があること、２、温度、時間に
より吸光度が変化すること、３、発色に至適ｐＨ範囲が
あること、 ４、低温度（Ｃａ２＋）で、測定値がマイナスになる領
１或があること、 等の欠点を有しており、特に用手法で実施する場合に問
題が多い。

（３）の原子吸光法は、機器が高価であり、熟練を要す
るとともに、検体を希釈する必要がおる。

（４）の炎色分析法も、検体の希釈が必要であるととも
に、特異性、■現性にも問題がある。

（５）の電極法は、機器が高価であるとともに、ｐｌ−
１の影響を受け、または器の保守が煩雑で必る。

（６）の酵素法には、ｉ）カルモジュリンを利用する方
法［特開昭６２−３６１９９号参照］、ｉｉ）ホスホリ
パーゼＤ、コリンオキシターゼを利用する方法がある［
特開昭６２−１９５２９７号参照］。

）カルモジュリンを用いる方法は、特異性にはすぐれて
いるが、感度が良過ぎるため、検体の希釈（１００〜１
０００倍）が必要となる。

）ホスホリパーゼＤ、コリンオキシターゼを用いる方法
は、特異性にすぐれ、また検体の希釈も不要でおるが、
反応に時間がかかるため、連続して測定できないという
欠点を有している。

以上のように、いずれの測定法も欠点を有しており、満
足のゆく測定法というものはなかった。

問題を解決するための手段 本発明者らは、酵素を用いるカルシウムの定量法を見出
ずべく鋭意検討を重ねた結果、ピルビン酸キナーゼの活
性が、カルシウムの量に比例して阻害されることを見出
し、本発明を完成した。

カルシウムがピルビン酸キナーゼの活性を阻害すること
は、すでに知られている［　Ｊ、　Ｆ、　Ｋａｃｈｍａ
ｎ。

Ｐ、Ｄ、Ｂｏｙｅｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、　
２００　６６９（１９５３）　］。

しかしながら、その阻害が、 （１）　Ｏ〜２０ｍｇ／　ｄＦ　（Ｄ範［１で（２）定
量的に起こることは 知られてあらず、これを利用し、体液中のカルシウムが
測定できることは、今回本発明者らにより初めて見出さ
れたことである。

通常のヒト体液中のカルシウム量は血漿中で１０ｍｇ／
　ｄＵ　、尿中で４〜１２ｍｙ／　ｄＭでおり、希釈を
要する測定法では希釈の操作が煩雑であるのみならず、
測定値に誤差が出る原因ともなり、診断自体が左右され
ることになりうるのであるが、本発明の測定法によれば
、検体を希釈することなく測定を行なうことができる。

また、本発明測定法の反応系では、マグネシウムの存在
が必須であるため（過剰量加えるため、マスクされる。

）、キレート剤等を用いた場合に問題となる体液中のマ
グネシウムの影響を無視することができる。

発明の構成 本発明は、（１）ホスホエノール　ピルベート、（２＞
ＡＤＰ（アデノシン　ジホスフェート）、（３）ピルビ
ン酸キナーゼおよび（４）マグネシウムイオンを必須成
分とする試薬を用いる体液中のカルシウム測定法である
。

この測定法の原理を第１図に従って説明する。

第１図中の各略号は下記の意味を表わす。

ＡＤＦ−アデノシン　ジホスフェート ＡＴＰ−アデノシン　トリホスフェートＰＥＰ−ホスホ
エノール　ピルベート ＰＡ　　−ピルビン酸 ＰＫ　　−ピルビン酸キナーピ ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）は、ホスホエノール　ピル
ベート（ＰＥＰ）を脱リン酸し、ピルビンＭ（ＰＡ）に
変換する酵素であり、この時、アデノシン　ジホスフェ
ート（ＡＤＰ＞はリン酸化され、アゾンシン　トリホス
フェート（ＡＴＰ）に変換される。この変換はマグネシ
ウムイオンを必要とする。

この系にカルシウムイオンを添加すると、定量的にＰＫ
を阻害し、反応が進行しなくなるため、ＰＫ阻害の程度
により、カルシウム量を知ることができる。

阻害の程度は、この系のうち出発原料（ＡＤＰ、ＰＥＰ
）　、生成物（ＡＴＰ、ＰＡ）のいずれか１つの量を測
定することにより知ることができる。

いずれの測定もよく知られており、 （ａ）ピルビン酸を測定するには、例えば以下の方法が
用いられる。

・ピルビン酸オキシターゼを用いて、用量的に発生する
過酸化水素を公知の過酸化水素測定系にか（プる方法、 ・２，４−ジニトロフェニルヒドラジンがピルビン酸に
よりにドラシンに変換されることを利用し、その吸光度
の変化により測定する方法、・乳酸脱水素酵素を作用さ
せ、ピルビン酸が乳酸に変換される際、同時にニコチン
アミドアデニンヌクレオチド（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ）が酸化
型（ＮＡＤ）に変換されることを利用し、ぞの吸光度の
減少を測定する方法。

（ｂ）ＡＴＰを測定するには、例えば、以下の方法が用
いられる。

・ヘキソキナーゼを用いてグルコースをグルコース６−
リン酸に変換し、さらにグルコース６−リン酸脱水素酵
素を反応させ、酸化型ニコチンアミドアデニンヌクレオ
チドリンｌ　（ＮＡＤＰ）を還元型（ＮＡＤＰＨ）に変
換することによる吸光度の増加を測定する方法、 ・ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセロアルデヒド、
３−リン酸脱水素酵素を用いる方法。

上記のような方法により、ピルビン酸キナーゼの活性を
カルシウムの含有量を変えた水溶液を用いて、あらかじ
め検量線を作成しておき、その検量線よりカルシウム量
を定量することができる。

本発明の各構成成分の濃度としては、以下の範囲で使用
することが好ましい。

ＰＥＰ　　　　Ｏ，１〜１０ｍｍｏｌ＃！ＰＫ　　　　
　２〜２００　ｕ／Ｉ ＡＤＰ　　　　０．１〜１０ｍｍｏｌ／、１！Ｍ（］　
２”　　　０．１〜１０　ｍｍｏｌ／、１！本発明方法
による測定には、通常用いられるような緩衝液（トリス
塩酸バッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ等）を加えてもよく
、また安定化剤（ＥＤＴＡ等のキレート剤、ＢＳＡ等の
アルブミン等）を加えてもよい。また、さらに出発原料
および生成物の足を測定するのに必要な試薬を同時に加
えてもよい。

また、本発明方法は、用手法はもちろんのこと、通常の
生化学検査自動分析機器によっても実施することができ
る。

実施例 以下の実施例により、本発明を詳述覆るが、本発明はこ
れらの実施例により限定されるものではない。

実施例１ カルシウムイオン 活性を乳酸脱水素酵素を用いて測定する方法。

試薬溶液として以下の試薬を混合した。

還元型ニコチンアミドヌクレオチド（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ”
）２．５　ｍｍｏｆ／　（Ｊ　ｘｌｏｏ　μＭ乳酸脱水
素酵素 ５．５　　ｕ／ｍ、ｌｌ　ｘｌｏｏ　μｆｌピルビン酸
キナーゼ（ＰＫ） ０．２　ｕ／ｍＪｌ　ｘｌＯＯμ（Ｊ ホスホエノール　ピルベート（ＰＥＰ）１０　ｍｍｏｌ
＃）　ｘｌＯＯμＭ アデノシン　ジホスフェート（ＡＤＰ）１０　ｍｍｏｌ
／、１）　ｘｌｏｏ　、ｃｚＪｌト１ｅｐｅｓバッファ ５００　ｍｍｏｌ／　、１）　ｘ２００　ｕｆＪ塩化カ
リウム ２００　ｍｍｏｌ／　Ｊ）　ｘｌＯＯｕｆＪ塩化マグネ
シウム １０　ｍｍｏｌ＃　ｘｌＯＯμ（Ｊ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８０μρこの試薬溶液にＯ〜５　ｍｍｏｌ＃塩化カルシ
ウム水溶液２０μｇを添加し、３７°Ｃにおける３４０
ｎｍての吸光度減少を経時的に測定し、おのおのの反応
速度を出して、カルシウム測定法に対し、プロツトシた
検量線を第２図に示す。

実施例２ カルシウム測定法量的ピルビン酸キナーゼの活性を生じ
たＡＴＰ量よりヘキソース、グルコース−６〜リン酸脱
水素酵素を用いて測定する方法 以下の試薬を）捏合して試薬溶液を調製した。

グルコース６−リン酸脱水素酵素 ２０ｕ／彪Ｘ５０μ〃 ヘキソキナーゼ ４０ｕ／　ｍｘ５０μｎ ピルビン酸キナーゼ ０．２　　ｕ／　ｍｘ　１００μｇ ＡＤＰ　　　　　　　　１０　　ｍｍｏｌ＃！　ｘ　１
００ｕＥホスホエノール　ピルベ−１〜 １０　ｍｍｏｌ＃　ｘ　Ｉ　Ｑ　Ｑ　μ、Ｑ酸化型ニコ
チンアミドアデニンヌクレＡヂドリン酸（ＮＡＤＰ） ５　　ｍｍｏｌ＃　ｘ　１００ｔＬＱ ｌ〜リス塩酸バツフア １ｍｏｌ＃ｘ１００μｇ 塩化マグネシウム ２０　　ｍｍｏｌ＃　Ｘ　５０　ｕｆｌ塩化カリウム １００　　ｍｍｏｌ／［ｘ５０μρ グルコース　　　　　　１．５ｍｏｌ＃ｌ　ｘ　２００
　ｔｌｊ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　８０μｇ上記の試験溶液にＯ〜５　ｍｍｏｌ＃塩
化カルシウム水溶液２０μｇを添加し、３７℃にあける
３４０ｎｍでの吸光度増加を経済的に測定し、おのおの
反応速度を出して、カルシウム濃度に対しプロットした
検量線を第３図に示す。

比較例 本発明とｏ−ＣＰＣ法との相関 血清検体７７例につき、実施例１の方法と、現在汎用さ
れているｏ−ｃｐｃ法との実測値との相関を第４図に示
す。

ｏ−ＣＰＣ法は、カルシウム測定用キットであるＣａｌ
ｃｉｕｍＩＩ−ＨＡ　　Ｔｅ５ｔ　　ｗａｋ。

（和光紬薬社製）を用いて、自動分析器（日立７０５型
）で血清中のカルシウムを測定することにより実施した
。第４図から両者は、よい相関を示し、本発明方法は日
常検査用として十分利用できることがわかった。

発明の効果 本発明は、酵素を用いた方法でおるため他の方法に比し
特異性が高く、また従来の酵素を用いた方法に比べて、
検体の希釈の必要がなく、長い反応時間も必要としない
カルシウム測定法であり、種々の疾患における判定を適
確に行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明測定法の原理の説明図であり、第２図及
び第３図は本発明におけるカルシウム定量の検量線を示
し、第４図は本発明法と０−ＣＰＣ法との相関を示ずグ
ラフで市る。 特許出願人　　小野薬品工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ホスホエノールピルベート、アデノシンジホスフェ
   ート、ピルビン酸キナーゼおよびマグネシウムイオンを
   含有する試薬を用いることを特徴とする体液中のカルシ
   ウム測定法。 ２）マグネシウムイオン、ピルビン酸キナーゼ、ホスホ
   エノールピルベート及びアデノシンジホスフェートを必
   須反応成分とし、ピルビン酸キナーゼがピルビン酸に変
   換され、かつアデノシンジホスフェートがアデノシント
   リホスフェートに変換される反応系において、カルシウ
   ムイオンがピルビン酸キナーゼを阻害する反応を用いる
   ことを特徴とする体液中のカルシウムイオンの測定方法
   。 ３）ホスホエノールピルベート、アデノシ ンジホスフェート、ピルビン酸およびアデノシントリホ
   スフェートのいずれか一つを測定する請求項２記載の体
   液中のカルシウムイオンの測定方法。