CN118006725A - 一种肌酐检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
一种肌酐检测试剂盒及方法，试剂盒由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂和第二试剂的体积比为4～6:1，第一试剂包括缓冲液、NAD合成酶、葡萄糖6磷酸脱氢酶、ATP、deamido‑NAD和乳酸脱氢酶抑制剂，第二试剂包括缓冲液和肌酐亚胺水解酶，缓冲液的pH为7.0～9.0，肌酐检测方法为：反应在第一试剂中进行，向第一试剂中加入样本，样本与第一试剂的体积比为1:18～22，在37℃±0.5℃条件下反应4.5min～5.5min测试反应液在340nm下的吸光度A1，继续加入第二试剂，保持在37℃±0.5℃的温度条件下反应4.5min～5.5min后取样在检测反应液在340nm下的吸光度A2。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域。特别地，本发明涉及一种用于检测肌酐方法和试剂盒。
背景技术
肌酐，化学式是C4H7N3O，是肌肉在人体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外。血中肌酐来自外源性和内源性两种，外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物；内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。血液中的肌酐水平反映了肾小球的滤过功能，是衡量肾功能的重要指标之一。
测定血清肌酐的方法主要有两种：一种是碱性苦味酸速率法(Jaffe法)，一种是酶法。Jaffe法由于线性范围窄，特异性差，易受样本中其他物质，如酮体、抗坏血酸、胆红素、头孢、多巴胺等干扰，出现检测偏差，已逐渐退出市场。酶法包括肌氨酸氧化酶法、肌酐亚胺水解酶法等，其中肌氨酸氧化酶法由于试剂稳定、线性范围宽、灵敏度高等优点被作为肌酐检测的常规方法。但该方法受到内源性肌酸的干扰产生正误差、同时该方法中的肌氨酸氧化酶也可以将L-脯氨酸作为底物而产生正误差。一些还原性物质，如维生素C、胆红素、羟苯磺酸钙、酚磺乙胺、多巴酚丁胺，由于消耗了反应产生的过氧化氢，导致负偏差。虽然该方法在试剂1中额外添加过氧化氢酶、抗坏血酸氧化酶、高铁氰化钾、氧化剂可消除或减少还原性物质产生的干扰，但不能完全避免。同时该方法对试剂2中的色原要求较高，必须选择和过氧化氢反应速度较快的色原，否则试剂2中的叠氮化合物在抑制过氧化氢酶的过程中过氧化氢酶会消耗部分过氧化氢，导致低值样本结果偏低。
肌酐亚胺水解酶法多以肌酐亚氨基水解酶偶联谷氨酸脱氢酶法，通过肌酐亚氨基水解酶水解肌酐得到氨和N-甲基乙内酰脲，再通过谷氨酸脱氢酶催化氨和α-酮戊二酸，在NAPDH供氢的情况下生成谷氨酸，最后测定340nm处吸光度降低率以求得肌酐含量，但该方法虽然从原理上避免了还原性物质的干扰，但试剂中NADPH不稳定且血清中氨的存在会消耗试剂中的NADPH导致该方法试剂线性范围较窄，从而影响了该方法的广泛应用。
基于肌酐检测领域领域的现状，提供一种能够既能避免内源性肌酸、维生素C、胆红素、还原性药物对肌酐检测的干扰又能避免内源性氨的干扰，具有良好的重复性、准确度以及宽的线性范围，且成本较低操作简单的检测方法及制剂盒，成为现有技术中亟待解决的问题。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，在先期研究中我们发现，采用ATP和deamido-NAD在NAD合成酶的作用下可以将血清中内源性氨转化为NAD+，NAD+进而再与葡萄糖6磷酸在葡萄糖6磷酸脱氢酶的作用下转化为NADH，基于此发现，本发明采用的技术方案是：
提供一种肌酐检测试剂盒，所述试剂盒由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂和第二试剂的体积比为4～6:1，第一试剂包括缓冲液、NAD合成酶、葡萄糖6磷酸脱氢酶、ATP、deamido-NAD和乳酸脱氢酶抑制剂，所述第二试剂包括缓冲液和肌酐亚胺水解酶，所述缓冲液的pH为7.0～9.0。
所述的一种肌酐检测试剂盒，进一步的，第一试剂各成分的含量为：NAD合成酶1.0-10.0KU/L、葡萄糖6磷酸脱氢酶2.0-10.0KU/L、烟酸腺嘌呤二核苷酸钠盐1.0-10.0mmol/L、ATP 1.0-20.0mmol/L、乳酸脱氢酶抑制剂1.0-100.0mmol/L、缓冲液10.0-200.0mmol/L、葡萄糖6磷酸1.0-20.0mmol/L；第二试剂各成分的含量为：肌酐亚胺水解酶1.0-100KU/L、缓冲液10.0-200.0mmol/L。
所述的一种肌酐检测试剂盒，进一步的，第一试剂中还含有表面活性剂1-20ml/L，稳定剂1-100mmol/L，防腐剂，0.5-10ml/L；第二试剂中还含有表面活性剂1-20ml/L，稳定剂1-100mmol/L，防腐剂0.5-10ml/L。
所述的一种肌酐检测试剂盒，进一步的，所述缓冲液选自磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、三乙醇胺缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N，N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液/的至少一种。更进一步的选自Tris-HCl缓冲液或三乙醇胺缓冲液，所述缓冲液的pH为7.6～8.1。
所述的一种肌酐检测试剂盒，进一步的，所述防腐剂选自ProClin系列、叠氮钠、苯甲酸钠、硫酸庆大霉素中的至少一种，优选ProClin系列中的ProClin300或叠氮钠。
所述的一种肌酐检测试剂盒，进一步的，所述稳定剂选自是海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、氯化钠、氯化钾或螯合剂中的至少一种，优选蔗糖或海藻糖。
所述的一种肌酐检测试剂盒，进一步的，所述表面活性剂选自，曲拉通系列、吐温系列、Brij系列中的至少一种。进一步的，选自曲拉通100或吐温80
所述的一种肌酐检测试剂盒，进一步的，所述乳酸脱氢酶抑制剂选自草酸钾、草酸钠中的至少一种，所述deamido-NAD为烟酸腺嘌呤二核苷酸钠盐。
所述的一种肌酐检测试剂盒，进一步的，所述第一试剂的中的成分含量进一步优选为，缓冲液90～150mmol/L，NAD合成酶5-10KU/L，ATP6-10mmol/L，deamido-NAD
2.5～5mmol/L，葡萄糖6磷酸10-15mmol/L，葡萄糖6磷酸脱氢酶2-50KU/L，乳酸脱氢酶抑制剂25-50mmol/L；所述第二试剂中优选肌酐亚胺水解酶的含量范围为5-20KU/L。
本发明还提供一种肌酐检测方法，采用所述的一种肌酐检测试剂盒，检测方法为：
将样本经步骤1)处理后取样检测340nm下的吸光度A1，再经步骤2)处理后取样检测340nm下的吸光度A2，
以待检测样品为样本得到吸光度A1＝A1S，吸光度A2＝A2S，
以校准品为样本，得到吸光度A1＝A1C，吸光度A2＝A2，CC表示校准品的浓度；
待检测样品中肌酐浓度＝(A2S-A1S)/(A2C-A1C)*CC
所述步骤1)的反应在第一试剂中进行，向第一试剂中加入样本，在37℃±0.5℃条件下反应4.5min～5.5min后取样测试反应液在340nm下的吸光度A1，样本与第一试剂的体积比为1:18～22。
所述步骤1)的反应为：待测试样中的NH4 +和ATP在NAD合成酶作用下将deamido-NAD下转换为NAD+，NAD+再和葡萄糖6-磷酸在葡萄糖6-磷酸脱氢酶作用下生成NADH，反应式如下
所述步骤2)在完成步骤1)的反应液中继续加入第二试剂，保持在37℃±0.5℃的温度条件下反应4.5min～5.5min后取样在检测反应液在340nm下的吸光度A2；
所述第二试剂包括缓冲液和肌酐亚胺水解酶，步骤2)的反应为：肌酐在肌酐亚胺水解酶作用下分解产生NH4 +，NH4 +和ATP在NAD合成酶作用下将deamido-NAD下转换为NAD+，NAD+再和葡萄糖6-磷酸在葡萄糖6-磷酸脱氢酶作用下生成NADH，反应式如下
本发明还提供了所述肌酐检测试剂盒在测定血清肌酐含量中的应用，采用所述肌酐检测方法，以血清为待检测样品。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明不需要复杂的预处理及特殊仪器，试剂具有足够的稳定性及易于操作等优点；
2、本发明试剂使用方便快捷，结果准确，线性范围宽、成本低廉。
3、本发明试剂采用葡萄糖6磷酸脱氢酶-NADH系统测定血清肌酐避免了肌酐亚氨基水解酶偶联谷氨酸脱氢酶法中试剂组分NADH不稳定的问题。
4、本发明试剂采用紫外法测定在340nm处NADH的生成来定量肌酐浓度，从原理上避免了维生素C、胆红素、羟苯磺酸钙、酚磺乙胺、多巴酚丁胺等还原性物质的干扰。在试剂中加入草酸盐有效的去除了血清中乳酸脱氢酶的干扰，使得结果更为准确，更能符合临床检验的要求。
附图说明
图1为实施例1制得的试剂与对照品对比回归分析图
图2本实施例1制得试剂在贝克曼AU5800全自动生化分析仪上的反应曲线图。
具体实施方式
现将描述实施本发明的一些方面的一些说明性且非限制性的实施例以及对比例。
实施例1：肌酐测定试剂盒的配制
第一试剂的组成：
第二试剂的组成：
实施例2：肌酐测定试剂盒的配制
第一试剂的组成：
第二试剂的组成：
测试步骤如下：样本10μL，加入200μL第一试剂中，温度37℃，反应5分钟后读取吸光度A1；加入试剂2 40μL混匀，5分钟后读取吸光度A2。用校准物代替样本同样测定。
样品中肌酐浓度＝(A2S-A1S)/(A2C-A1C)*CC
上式中，A2S和A1S分别表示样品的吸光度A2和A1；A2C和A1C分别表示校准品的吸光
度A2和A1；CC表示校准品的浓度。
利用上述方法重复测定50μmol/L、100μmol/L、500μmol/L肌酐标准溶液各10次。计算变异系数。结果参见下表。
由以上结果可见，肌酐测定试剂盒精密度(即变异系数)CV<3％，重复性好。
配制浓度5000μmol/L的肌酐标准溶液，用生理盐水稀释成9个不同的浓度(稀释梯度分别为1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、/710、8/10、9/10)作为理论浓度。用实施例1和2制备的试剂盒按照所述检测方法对每个浓度测定3次，计算平均值，作为实测浓度。以理论浓度为自变量，以实测浓度为因变量求出线性回归方程，计算线性回归相关系数r；结果如下表所示。
由以上结果可见：肌酐测定试剂盒线性相关系数大于0.999；线性范围上限可达5000μmol/L。证实所述试剂盒线性范围满足肌酐行业标准要求。
向血清中分别添加维生素C、胆红素、羟苯磺酸钙、酚磺乙胺至不同浓度、用实施例1按照所述检测方法每个浓度测定3次，计算平均值和干扰程度。结果如下表所示。
干扰程度计算方法如下
(添加后检测值-添加前检测值)/添加前检测值*100％
由以上结果可见，本发明提供的肌酐试剂盒采用脱氢酶法在340nm处测定血清中肌酐的浓度，从原理上避免了还原性物质的干扰。
使用本发明实施例1提供的试剂与对照品(肌酐(酶法)测定试剂盒，日本和光纯药工业株式会社、试剂规格：酶显色液A(试剂1):4×55mL、酶显色液B(试剂2):4×21mL)，采用肌氨酸氧化酶法进行比对，在贝克曼AU5800全自动生化分析仪上按照各自参数进行设置，测试40例人血清样本，结果见下表
以对照品测值为横坐标x，以实施例1测值为纵坐标y作回归分析，回归分析图见图2。经回归分析，由结果看出，两种试剂的相关性R2>0.999，回归方程为y＝0.9993x-2.1851。结果表明本试剂与对照品测定病人血清肌酐含量时的相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
使用本发明试剂实施例2在贝克曼5800全自动生化分析仪上测试3000μmol/L的肌酐标准溶液，反应曲线如图2。由结果看出该反应在加入R2后3min内达到平衡，且反应曲线平稳，无异常波动。
Claims (10)
1.一种肌酐检测试剂盒，其特征是所述试剂盒由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂和第二试剂的体积比为4～6:1，第一试剂包括缓冲液、NAD合成酶、葡萄糖6磷酸脱氢酶、ATP、deamido-NAD和乳酸脱氢酶抑制剂，所述第二试剂包括缓冲液和肌酐亚胺水解酶，所述缓冲液的pH为7.0～9.0。
2.如权利要求1所述的一种肌酐检测试剂盒，其特征是，第一试剂各成分的含量为：NAD合成酶1.0-10.0KU/L、葡萄糖6磷酸脱氢酶2.0-10.0KU/L、烟酸腺嘌呤二核苷酸钠盐1.0-10.0mmol/L、ATP 1.0-20.0mmol/L、乳酸脱氢酶抑制剂1.0-100.0mmol/L、缓冲液10.0-200.0mmol/L、葡萄糖6磷酸1.0-20.0mmol/L；第二试剂各成分的含量为：肌酐亚胺水解酶1.0-100KU/L、缓冲液10.0-200.0mmol/L。
3.如权利要求2所述的一种肌酐检测试剂盒，其特征是第一试剂中还含有表面活性剂1-20ml/L，稳定剂1-100mmol/L，防腐剂，0.5-10ml/L；第二试剂中还含有表面活性剂1-20ml/L，稳定剂1-100mmol/L，防腐剂0.5-10ml/L。
4.如权利要求1～3任一所述的一种肌酐检测试剂盒，其特征是，所述缓冲液选自磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、三乙醇胺缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N，N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液/的至少一种。
5.如权利要求4所述的一种肌酐检测试剂盒，其特征是，所述防腐剂选自ProClin系列、叠氮钠、苯甲酸钠、硫酸庆大霉素中的至少一种，所述稳定剂选自是海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、氯化钠、氯化钾或螯合剂中的至少一种，所述表面活性剂选自，曲拉通系列、吐温系列、Brij系列中的至少一种。
6.如权利要求5所述的一种肌酐检测试剂盒，其特征是，所述防腐剂选自ProClin300或叠氮钠，所述稳定剂选自是蔗糖或海藻糖，所述表面活性剂选自曲拉通100或吐温80，所述乳酸脱氢酶抑制剂选自草酸钾、草酸钠中的至少一种，所述deamido-NAD为烟酸腺嘌呤二核苷酸钠盐。
7.如权利要求5或6所述的一种肌酐检测试剂盒，其特征是，所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液或三乙醇胺缓冲液，所述缓冲液的pH为7.6～8.1。
8.如权利要求7所述的一种肌酐检测试剂盒，其特征是，所述第一试剂的中的成分含量为，缓冲液90～150mmol/L，NAD合成酶5-10KU/L，ATP6-10mmol/L，deamido-NAD 2.5～5mmol/L，葡萄糖6磷酸10-15mmol/L，葡萄糖6磷酸脱氢酶2-50KU/L，乳酸脱氢酶抑制剂25-50mmol/L；所述第二试剂中肌酐亚胺水解酶的含量范围为5-20KU/L。
9.一种肌酐检测方法，采用如权利要求1～8任一所述的一种肌酐检测试剂盒，其特征是检测方法为：
将样本经步骤1)处理后取样检测340nm下的吸光度A1，再经步骤2)处理后取样检测340nm下的吸光度A2，
以待检测样品为样本得到吸光度A1＝A1S，吸光度A2＝A2S，
以校准品为样本，得到吸光度A1＝A1C，吸光度A2＝A2，CC表示校准品的浓度；
待检测样品中肌酐浓度＝(A2S-A1S)/(A2C-A1C)*CC
所述步骤1)的反应在第一试剂中进行，向第一试剂中加入样本，样本与第一试剂的体积比为1:18～22，在37℃±0.5℃条件下反应4.5min～5.5min后取样测试反应液在340nm下的吸光度A1，
所述步骤2)在完成步骤1)的反应液中继续加入第二试剂，保持在37℃±0.5℃的温度条件下反应4.5min～5.5min后取样在检测反应液在340nm下的吸光度A2。
10.如权利要求1～8所述的一种肌酐检测试剂盒在测定血清肌酐含量中的应用，其特征是采用如权利要求9所述的肌酐检测方法，以血清为待检测样品。
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