CN114381494B - 一种乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂及检测方法，本发明采用1,4‑脱水己糖醇作为抑制剂，通过逆反应进行检测，可达到较高的平衡常数，因此NADH用量少，只是正向反应所用NAD+的3％；酶反应速率也比顺反应快，单位时间内吸光度的变化较大，能使用比较少的样品在较短的时间内进行测定；酶活力随时间的线性关系较长；用NADH或丙酮酸启动反应，其反应速度相同，而由乳酸盐到丙酮酸的反应中，LDH1活力取决于使用的启动剂。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂，以及采用该检测试剂的检测方法。
背景技术
乳酸脱氢酶(LDH)是糖酵解过程中一种重要的酶，主要是在辅酶Ⅰ的递氢作用参与下，使乳酸脱氢生成丙酮酸。
LDH由两种亚基(H和M)组成四聚体结构，有五种亚基组合，构成五种LDH同工酶，按电泳中向正极移动速度的快慢依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，其亚基组成分别为H4、H3M、H2M2、HM3和M4。LDH同工酶的分布具有相对的组织特异性，LDH1、LDH2主要来源于心肌细胞，特别在急性心梗时LDH1增加比LDH更敏感、特异，通过测定LDH1活性和分析LDH与LDH1活性的比率，对急性心肌梗塞的鉴别诊断有很大帮助。
目前，LDH同工酶的测定主要电泳法、化学抑制法、免疫抑制法、亲和层析法等，其中电泳法的研究成果较多，结果准确可靠，但是操作繁琐、时间长，对仪器和人员的有较高要求。亲和层析法结果准确，同样要求较高且操作时间长。以上两种方法常用于基础研究，不适合用于现代临床快速检验。化学抑制法较免疫抑制法价格低廉，通过使用化学抑制剂抑制样本中LDH2-LDH5，仅使LDH1参与反应，化学抑制法的反应时间短、操作简单，更易于推广，特别是使用全自动生化分析仪自动分析，有很好的应用前景。目前常用的抑制剂主要有硫氰酸胍、高氯酸盐、过氯酸钠、羟基化合物。以上抑制剂虽然都基于相同的原理，但不同的反应体系、反应条件或含量，会导致试剂的特异性较差，仍会受到部分其他乳酸脱氢酶同工酶的干扰，或一部分LDH1受到抑制，从而使检测结果与真实值存在偏差。
血液中总LDH的检测原理和技术已经较为成熟，但LDH同工酶的检测还处于研究阶段，找到一种对LDH1特异性高、易获得、抗干扰能力强、准确度高、灵敏度高的配方和检测方法是本发明的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性好、准确度高、反应速度快、线性范围广的乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂，所述检测试剂由试剂R1和试剂R2组成；
所述试剂R1包括以下含量的组分：
所述试剂R2包括以下含量的组分：
所述试剂R1和试剂R2中缓冲液的pH值为7.6±0.2。
优选的，所述试剂R1和试剂R2中缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液(AMP缓冲液)、咪唑缓冲液、N-甲基-右旋糖苷缓冲液、二乙醇胺缓冲液、焦磷酸钠缓冲液或PBS缓冲液中的一种。
优选的，所述试剂R1和试剂R2中稳定剂选自聚氧乙烯脂肪酸酯、海藻糖和甘油中的一种或几种。
优选的，所述试剂R1和试剂R2中防腐剂选自叠氮钠、Proclin300和柠檬酸钠中的一种或几种。
本发明的另一目的是提供一种采用上述检测试剂对乳酸脱氢酶同工酶1进行检测的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种采用上述乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂的检测方法，其特征在于：包括以下检测步骤：所述试剂R1、试剂R2与待测血清样本的比例为48:12:1；将待测血清样本先与试剂R1混匀，37℃下孵育2-5min；然后加入试剂R2，混匀，37℃孵育1-3min后开始测定，连续测定2min，计算相对于空白样本的吸光度变化率；检测主波长为340nm，检测副波长405nm；
然后按以下公式计算检测结果：
其中，△AT/min：样本相对于空白的吸光度变化率；
△AS/min：校准品相对于空白的吸光度变化率。
目前大部分商品化试剂盒均采用顺反应，即乳酸盐→丙酮酸。相比于顺反应，本发明(逆反应)有如下优点：
1)可达到较高的平衡常数，因此NADH用量少，只是正向反应所用NAD+的3％；
2)酶反应速率也比顺反应快，单位时间内吸光度的变化较大，能使用比较少的样品在较短的时间内进行测定；
3)酶活力随时间的线性关系较长；
4)用NADH或丙酮酸启动反应，其反应速度相同，而由乳酸盐到丙酮酸的反应中，LDH1活力取决于使用的启动剂。
附图说明
图1为本发明实施例1检测结果与电泳法检测结果的相关性曲线；
图2为本发明实施例2检测结果与电泳法检测结果的相关性曲线；
图3为本发明实施例3检测结果与电泳法检测结果的相关性曲线。
具体实施方式
除有明确定义外，以下实施例中所用的技术术语与本发明所属领域技术人员普遍理解的含义相同。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
一、本发明的反应原理
利用乳酸脱氢酶同工酶1在还原型辅酶Ⅰ(NADH)的作用下，使丙酮酸转变成乳酸。340nm处吸光度降低的速率与血清中的LDH1的活性成线性关系。1,4-脱水己糖醇为LDH的M亚基的特异抑制剂，在340nm处测定吸光度的下降速率，即可测出LDH1活性。
其中各组分的作用是：
缓冲液：丙酮酸-乳酸的反应为可逆反应，其反应方向受pH值影响，方向由乳酸转变为丙酮酸时，最适pH范围是8.8-9.8；方向由丙酮酸转变为乳酸时，最适pH范围是7.4-7.8。缓冲液提供一个稳定的pH环境；KCl增加盐离子浓度，对试剂盒及反应体系中各组分的稳定性起着至关重要的作用。上述缓冲体系避免了原金氏法中甘氨酸缓冲液对LDH的抑制作用，提高了阳性检出率。
1,4-脱水己糖醇：特异性抑制LDH分子中M亚基，且其抑制作用与1,4-脱水己糖醇的浓度有关。据实验显示，当1,4-脱水己糖醇的最终浓度为400mmol/L时，可完全抑制LDH2-LDH5的活性。
稳定剂：一种或几种组合使用，能有效保护乳酸脱氢酶的活性及NADH的稳定性，消除NADH对LDH的抑制作用，提高试剂的乳化作用，提高试剂的准确性和特异性。
防腐剂：抑制液体中微生物的生长。
抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶：在试剂R1中加入，在试剂R2加入反应前，有效消除样本中抗坏血酸、胆红素和甘油三酯的干扰。
二、本发明的检测方法
所述试剂R1、试剂R2与血清样本的比例为48:12:1；
待测血清先与R1混匀，37℃下孵育3min。
然后加入试剂R2，混匀，37℃孵育1min后开始测定，连续测定2min，计算相对于空白的吸光度变化率(△AT/min)；
检测波长：主波长为340nm，副波长405nm；
检测方法为连续监测法；
反应方向：下降；
反应最适pH7.4；
结果计算：
其中，△AT/min：样本相对于空白的吸光度变化率；
△AS/min：校准品相对于空白的吸光度变化率。
三、具体实施例
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1：
试剂R1：
试剂R2：
实施例2：
试剂R1：
试剂R2：
实施例3：
试剂R1：
试剂R2：
1、检测参数：
上述实施例使用日立LABOSPECT006全自动生化分析仪，利用速率法进行检测，检测波长340nm，上机参数如表1。检测样本前使用纯化水做试剂空白，使用可溯源的LDH1校准品进行校准。
表1试剂检测参数
2、分析灵敏度试验：
按照表1设置上机参数，按照实施例1、实施例2、实施例3的配方配制试剂，同时使用顺反应原理的试剂盒作为对照试剂，重复测试同一血清样本3次，记录在主波长340nm下的吸光度变化率(△A/min)，换算为65U/L的吸光度变化率(△A/min)。灵敏度检测结果见表2。
表2检测试剂灵敏度检测结果
由表2检测结果看出，相比于常用的由乳酸盐→丙酮酸，即顺反应检测血清中LDH1的含量，逆反应时，单位时间的吸光度变化更大，约是顺反应的2-3倍，有更高的灵敏度，反应速度更快。
3、准确度和特异性试验：
试验1：
取40个新鲜血清样本，分别使用实施例1、实施例2、实施例3在本发明检测条件下以及电泳法条件下对LDH1进行检测，以电泳法作为比对，统计个实施例与电泳法测定的线性相关系数r及偏差。检测结果见表3。
表3检测试剂准确度检测结果
由表3看出，使用临床样本，实施例1、实施例2、实施例3的检测结果与电泳法相比，具有很好的相关性，说明抑制剂能特异性的抑制LDH2-LDH5，准确测定LDH1的值，有很好的特异性和准确性。
试验2：
将混合均匀的新鲜血清分为6份，分别加入一定浓度的干扰物质：胆红素400mg/dL、甘油三酯2000mg/dL、血红蛋白350mg/dL、抗坏血酸1000mg/dL、类风湿因子200IU/mL，其中一份不加任何干扰物质的血清作为空白对照，分别使用实施例1，实施例2和实施例3所述配方的试剂，测定LDH1的含量，检测3次取平均值。与空白对照相比，相对偏差小于10％认为无明显干扰。检测结果见表4、表5和表6。
表4实施例1试剂抗干扰性能测定结果
表5实施例2试剂抗干扰性性能测定结果
表6实施例3试剂抗干扰性性能测定结果
由表4、表5、表6看出，在加入一定浓度的干扰物质后，实施例1、实施例2和实施例3的检测结果与未加干扰物质的空白对照相比，相对偏差均小于5％，说明本检测试剂有较强的抗干扰能力。
本乳酸脱氢酶同工酶1检测试剂通过使用一定浓度的1,4-脱水己糖醇作为化学抑制剂，有效抑制LDH2～LDH5不参加反应；通过使用可促进反应的缓冲体系，加入聚氧乙烯脂肪酸酯、海藻糖、甘油中的一种或几种稳定剂，提高试剂稳定性，使LDH1充分参与反应，具有很高的特异性和准确度。当胆红素≤400mg/dL、甘油三酯≤2000mg/dL、血红蛋白≤350mg/dL、抗坏血酸≤1000mg/dL、类风湿因子≤200IU/mL时，不会对结果造成影响，有很好的抗干扰能力。可广泛推广于乳酸脱氢酶同工酶1自动化检测领域。
本乳酸脱氢酶同工酶1检测方法，具有NADH用量少，使用样本少，单位时间内吸光度的变化较大，灵敏度高的优点。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂，其特征在于：所述检测试剂由试剂R1和试剂R2组成；
所述试剂R1包括以下含量的组分：
所述试剂R2包括以下含量的组分：
所述试剂R1和试剂R2中缓冲液的pH值为7.6±0.2；
所述试剂R1和试剂R2中缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液、N-甲基-右旋糖苷缓冲液、二乙醇胺缓冲液、焦磷酸钠缓冲液或PBS缓冲液中的一种；
所述试剂R1和试剂R2中稳定剂选自聚氧乙烯脂肪酸酯、海藻糖和甘油中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂，其特征在于：所述试剂R1和试剂R2中防腐剂选自叠氮钠、Proclin300和柠檬酸钠中的一种或几种。
3.采用如权利要求1-2任一项所述的乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂的检测方法，其特征在于：包括以下检测步骤：所述试剂R1、试剂R2与待测血清样本的比例为48:12:1；将待测血清样本先与试剂R1混匀，37℃下孵育2-5min；然后加入试剂R2，混匀，37℃孵育1-3min后开始测定，连续测定2min，计算相对于空白样本的吸光度变化率；检测主波长为340nm，检测副波长405nm；
然后按以下公式计算检测结果：
其中，△AT/min：样本相对于空白的吸光度变化率；
△AS/min：校准品相对于空白的吸光度变化率。
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