CN109517813B - 一种肌酸激酶及其同工酶激活剂、测定试剂及试剂盒 - Google Patents

一种肌酸激酶及其同工酶激活剂、测定试剂及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种肌酸激酶及其同工酶激活剂、测定试剂及试剂盒，属于生化检测技术领域，激活剂为烟酸铬，测定试剂包括防腐剂、缓冲液、肌酸激酶及其同工酶活性测定抗体中的一种或多种，试剂盒包括含烟酸铬的第一试剂和第二试剂。本发明提供的激活剂稳定性好，不易被氧化失活，用于肌酸激酶及其同工酶活性测定的试剂及其试剂盒时，不需加入螯合剂，同时能够显著延长试剂的使用期限，能够保证试剂在长期保存后测定的准确性，该激活剂、测定试剂及试剂盒可用于全自动生化分析仪检测，操作简便。

Description

一种肌酸激酶及其同工酶激活剂、测定试剂及试剂盒
技术领域
本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种肌酸激酶及其同工酶激活剂、测定试剂及试剂盒。
背景技术
肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)与细胞能量运转、肌肉收缩、ATP再生有重要关系。主要存在于人体骨骼肌、心肌、平滑肌，其次是脑组织，在胃肠道、肺和肾中的含量最少。肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase Isoenzymes)是CK的四种亚基组合：肌肉型(CK-MM)、脑型(CK-BB)、杂化型(CK-MB)和线粒体型(CK-MiMi)。CK-MM主要存在于各种肌肉细胞中，CK-BB主要存在于脑细胞中，CK-MB主要存在于心肌细胞中，CK-MiMi主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。CK及其同工酶(主要为CK、CK-MB)在临床诊断中有十分重要的意义，其活性的测定可用于骨骼肌疾病、心肌疾病等的诊断。
CK的测定方法包括质量法、酶法(比色法)、电泳法(琼脂糖凝胶电泳、等电聚焦)、酶联免疫法(免疫抑制法)、色谱法。CK同工酶的测定方法包括电泳法、离子交换柱层析法、免疫抑制法、金标记法、免疫酶标法、放射免疫法。
CK酶法的测定原理是：CK+ADP→肌酸+ATP；ATP+葡萄糖+己糖激酶→葡萄糖-6-磷酸；葡萄糖-6-磷酸+葡萄糖-6-磷酸脱氢酶+NADP→NADPH+6-磷酸-葡萄糖酸盐；NADPH在340nm处有特异性吸光度，可通过测定NADPH的生成速率测定CK活性。CK-MB免疫抑制法的测定原理是：在健康人血清中，CK几乎是CK-MM(约占94％以上)，CK-MB约占5％以下，在试剂中加入抑制CK-M的抗体，该抗体能够完全抑制CK-M的活性，而不影响CK-B的活性，随后按照测定CK的方法测定，所得结果乘以2即为CK-MB的活性。
CK及其同工酶在血液中会钝化，该类酶的活性测定需提前加入激活剂。目前主要的激活剂是含巯基基团的化合物，巯基基团在保存过程中易被氧气或金属离子氧化，导致测定试剂在长期保存过程中准确性变差，进而影响试剂的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种肌酸激酶及其同工酶激活剂、测定试剂及试剂盒，该激活剂稳定性好，不易被氧化失活，用于肌酸激酶及其同工酶活性测定的试剂及其试剂盒时，不需加入螯合剂，同时能够显著延长试剂的使用期限，能够保证试剂在长期保存后测定的准确性，该激活剂、测定试剂及试剂盒可用于全自动生化分析仪检测，操作简便。
本发明提供了如下的技术方案：
一种肌酸激酶及其同工酶激活剂，激活剂为烟酸铬。
优选的，所述激活剂烟酸铬的使用浓度为0.01-0.05％(v/v)。
优选的，所述激活剂烟酸铬适用于细胞质中的CK、CK-MB、CK-MM、CK-BB的测定，也适用于线粒体中CK的测定。
一种肌酸激酶及其同工酶测定试剂，包括激活剂烟酸铬、防腐剂、缓冲液、肌酸激酶及其同工酶活性测定抗体中的一种或多种。
优选的，所述防腐剂为叠氮钠、庆大霉素、Proclin系列、KroVin系列中的至少一种，所述防腐剂的浓度为1-15g/L。
优选的，所述缓冲液为咪唑缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、硼酸缓冲液中的至少一种，所述缓冲液的浓度为50-100mmol/L。
一种用于CK测定的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂含有烟酸铬、咪唑缓冲液、叠氮钠、五磷酸二腺苷(AP5A)、腺苷一磷酸(AMP)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙酸镁、葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)；所述第二试剂含有咪唑缓冲液、二磷酸腺苷(ADP)、磷酸肌酸、叠氮钠和葡萄糖激酶。
一种用于CK-MB测定的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂含有烟酸铬、咪唑缓冲液、乙酸镁、CK-M抗体、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷一磷酸(AMP)、五磷酸二腺苷(AP5A)、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和叠氮钠；所述第二试剂含有咪唑缓冲液、磷酸肌酸、葡萄糖激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)和叠氮钠。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的肌酸激酶及其同工酶激活剂，稳定性好，不易被氧化失活，用于肌酸激酶及其同工酶活性测定的试剂及其试剂盒时，能够取代N-乙酰半胱氨酸，使用时不需要加入螯合剂，能够显著延长试剂的使用期限，保证试剂在长期保存后测定的准确性。
(2)本发明中的激活剂烟酸铬不仅适用于细胞质中的CK、CK-MB、CK-MM、CK-BB的测定，同时适用于线粒体中的肌酸激酶的测定。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为实施例1相关性检测结果；
图2为CK对照试剂盒相关性检测结果；
图3为实施例2相关性检测结果；
图4为CK-MB对照试剂盒相关性检测结果；
图5为本发明实施例1和对应对照试剂盒在4℃条件下的稳定性检测结果；
图6为本发明实施例2和对应对照试剂盒在4℃条件下的稳定性检测结果；
图7为本发明实施例1和对应对照试剂盒在常温条件下的稳定性检测结果；
图8为本发明实施例2和对应对照试剂盒在常温条件下的稳定性检测结果。
具体实施方式
以下实施例所用试剂原料均为市场分析纯。
一种肌酸激酶及其同工酶激活剂，为烟酸铬，使用浓度为0.01-0.05％(v/v)。
激活剂烟酸铬适用于细胞质中的CK、CK-MB、CK-MM、CK-BB的测定，也适用于线粒体中CK的测定。
一种肌酸激酶及其同工酶测定试剂，包括激活剂烟酸铬、防腐剂、缓冲液、肌酸激酶及其同工酶活性测定抗体中的一种或多种。
具体的，防腐剂为叠氮钠、庆大霉素、Proclin系列、KroVin系列中的至少一种，防腐剂的浓度为1-15g/L。
具体的，缓冲液为咪唑缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、硼酸缓冲液中的至少一种，缓冲液的浓度为50-100mmol/L。
实施例1
一种用于CK测定的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂含有烟酸铬、咪唑缓冲液、叠氮钠、五磷酸二腺苷(AP5A)、腺苷一磷酸(AMP)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙酸镁、葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)；所述第二试剂含有咪唑缓冲液、二磷酸腺苷(ADP)、磷酸肌酸、叠氮钠和葡萄糖激酶。
本试剂盒的具体原料及配比如下：
表1第一试剂的组成和浓度
咪唑缓冲液 100mmol/L
烟酸铬 0.04％(v/v)
AP5A 12μmol/L
AMP 5mmol/L
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 3KU/L
乙酸镁 10mmol/L
葡萄糖 25mmol/L
NADP+ 3mmol/L
叠氮钠 10mmol/L
表2第二试剂的组成和浓度
咪唑缓冲液 100mmol/L
葡萄糖激酶 3KU/L
ADP 2mmol/L
磷酸肌酸 50mmol/L
叠氮钠 10mmol/L
本实施例对样品中CK进行检测，具体步骤如下：
(1)将200uL第一试剂和10uL待测样品混合均匀，37℃孵育后得到反应液1；
(2)然后加入50uL第二试剂混合均匀，得到反应液2，测定反应液2的吸光度A1；
(3)120S后再次测定反应液2的吸光度A2，测定主波长为340nm、副波长为410nm；
(4)用步骤(1)-(3)的操作对CK标准液的吸光度进行测定，分别得到吸光度A3和A4；
(5)用吸光度差值进行计算，根据公式计算CK含量：CK浓度＝样本吸光度(A2-A1)×标准液浓度/标准液吸光度(A4-A3)。
实施例2
一种用于CK-MB测定的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂含有烟酸铬、咪唑缓冲液、乙酸镁、CK-M抗体、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷一磷酸(AMP)、五磷酸二腺苷(AP5A)、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和叠氮钠；所述第二试剂含有咪唑缓冲液、磷酸肌酸、葡萄糖激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)和叠氮钠。
本试剂盒的具体原料及配比如下：
表3第一试剂的组成和浓度
咪唑缓冲液 100mmol/L
烟酸铬 0.038％(v/v)
乙酸镁 12mmol/L
CK-M抗体 2KU/L
ADP 3mmol/L
AMP 5.5mmol/L
AP5A 0.01mmol/L
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 1.5KU/L
葡萄糖 31mmol/L
叠氮钠 10mmol/L
表4第二试剂的组成和浓度
咪唑缓冲液 100mmol/L
葡萄糖激酶 3mmol/L
磷酸肌酸 165mmol/L
NADP+ 2mmol/L
叠氮钠 10mmol/L
本实施例对样品中CK-MB进行检测，具体步骤如下：
(1)将200uL第一试剂和10uL待测样品混合均匀，37℃孵育后得到反应液1；
(2)然后加入50uL第二试剂混合均匀，得到反应液2，测定反应液2的吸光度A1；
(3)120S后再次测定反应液2的吸光度A2，测定主波长为340nm、副波长为410nm；
(4)用步骤(1)-(3)的操作对CK-MB标准液的吸光度进行测定，分别得到吸光度A3和A4；
(5)用吸光度差值进行计算，根据公式计算CK-MB含量：CK-MB浓度＝样本吸光度(A2-A1)×标准液浓度/标准液吸光度(A4-A3)。
实验例
一、相关性检测
利用罗氏标准品进行校准，以罗氏高值质控品(CK：286U/L；CK-MB：99.8U/L)为样本，2样本用生理盐水稀释，稀释梯度见表5。
表5样本梯度稀释体积比
样本浓度(X) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
生理盐水 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
浓度 X 0.8X 0.6X 0.4X 0.2X 0
分别利用实施例1、2制得的试剂对对应的各梯度样本进行测定，所有测定6次重复，取平均值。以国内市售的CK、CK-MB检测试剂盒为对照试剂盒，与本发明提供的CK、CK-MB测定试剂盒进行相同的测定。结果见图1至图4。
由图1至图4可知，实施1、2及对应的对照试剂盒随着样本稀释浓度的变化呈线性变化，相关系数均达0.99，说明所有试剂对于各浓度样本测定结果都比较准确。
二、重复性检测
利用罗氏标准品进行校准，以罗氏高值质控品(CK：286U/L；CK-MB：99.8U/L)为样本进行重复测试20次，所用试剂为本发明的实施例1、2及对应的对照试剂盒，检测结果见表6。
表6重复性检测结果
Figure GDA0003509168610000081
重复性实验结果显示对照试剂盒及本发明实施例1、2的变异系数均在5％以内，均满足国家标准和行业标准中的要求。
三、稳定性检测
将实施例1、2试剂及相应的对照试剂盒放于4℃冰箱保存，利用罗氏标准品进行校准，以罗氏高值质控品(CK：286U/L；CK-MB：99.8U/L)为样本进行重复测试6次，取平均值，跟踪试剂稳定性。每一季度定时检测一次，跟踪5个季度，检测结果见图5和图6。
将实施例1、2试剂及相应的对照试剂盒放于常温保存，利用罗氏标准品进行校准，以罗氏高值质控品(CK：286U/L；CK-MB：99.8U/L)为样本进行重复测试6次，取平均值，跟踪试剂稳定性。每隔2天定时检测一次，跟踪14天，检测结果见图7和图8。
由图5和图6可知，对照试剂盒随着时间的推移，试剂的检测结果衰减，但实施例1、2的试剂测定结果几乎不变，说明本发明中激活剂烟酸铬稳定性好，不易被氧化失活，用于CK及其同工酶活性测定试剂及其试剂盒时，能够显著延长试剂的使用期限，能够保证试剂在长期保存后测定的准确性。由图7和图8可知，实施例1、2试剂在常温下14天内测定结果几乎不变，而对照出现一定的衰减现象，进一步说明激活剂烟酸铬在CK及其同工酶活性测定试剂及其试剂盒中的效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.烟酸铬作为激活剂在制备肌酸激酶及其同工酶测定试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的烟酸铬作为激活剂在制备肌酸激酶及其同工酶测定试剂中的应用，其特征在于，所述测定试剂包括防腐剂、缓冲液、肌酸激酶及其同工酶活性测定抗体中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的烟酸铬作为激活剂在制备肌酸激酶及其同工酶测定试剂中的应用，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠、庆大霉素、Proclin系列、KroVin系列中的至少一种，所述防腐剂的浓度为1-15g/L。
4.根据权利要求2所述的烟酸铬作为激活剂在制备肌酸激酶及其同工酶测定试剂中的应用，其特征在于，所述缓冲液为咪唑缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、硼酸缓冲液中的至少一种，所述缓冲液的浓度为50-100mm/L。
5.一种用于CK测定的试剂盒，其特征在于，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂含有烟酸铬、咪唑缓冲液、叠氮钠、五磷酸二腺苷、腺苷一磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙酸镁、葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，其中，烟酸铬的浓度为0.04％(v/v)，咪唑缓冲液的浓度为100mmol/L，叠氮钠的浓度为10mmol/L，五磷酸二腺苷的浓度为12μmol/L，腺苷一磷酸的浓度为5mmol/L，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为3KU/L，乙酸镁的浓度为10mmol/L，葡萄糖的浓度为25mmol/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的浓度为3mmol/L；所述第二试剂含有咪唑缓冲液、二磷酸腺苷、磷酸肌酸、叠氮钠和葡萄糖激酶，其中，咪唑缓冲液的浓度为100mmol/L，二磷酸腺苷的浓度为2mmol/L，磷酸肌酸的浓度为50mmol/L，叠氮钠的浓度为10mmol/L，葡萄糖激酶的浓度为3KU/L。
6.一种用于CK-MB测定的试剂盒，其特征在于，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂含有烟酸铬、咪唑缓冲液、乙酸镁、CK-M抗体、二磷酸腺苷、腺苷一磷酸、五磷酸二腺苷、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和叠氮钠，其中，烟酸铬的浓度为0.038％(v/v)，咪唑缓冲液的浓度为100mmol/L，乙酸镁的浓度为12mmol/L，CK-M抗体的浓度为2KU/L，二磷酸腺苷的浓度为3mmol/L，腺苷一磷酸的浓度为5.5mmol/L，五磷酸二腺苷的浓度为0.01mmol/L，葡萄糖的浓度为31mmol/L，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为1.5KU/L，叠氮钠的浓度为10mmol/L；所述第二试剂含有咪唑缓冲液、磷酸肌酸、葡萄糖激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和叠氮钠，其中，咪唑缓冲液的浓度为100mmol/L，葡萄糖激酶的浓度为3KU/L，磷酸肌酸的浓度为165mmol/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的浓度为2mmol/L，叠氮钠的浓度为10mmol/L。
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