CN113881658A - 一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂 - Google Patents

一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及诊断试剂技术领域，具体涉及一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂，该高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂由混合保护剂和生物缓冲液复配组成，所述混合保护剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、二硫苏糖醇、表面活性剂以及甘氨酸；所述生物缓冲液包括牛血清蛋白和AEP‑HBC。所述高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂可有效地提高肌酸激酶检测试剂盒的稳定性，以解决现有技术中存在的缺陷。

Description

一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂
技术领域
本发明涉及诊断试剂技术领域，尤其涉及一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添 加剂。
背景技术
肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组 织的细胞浆及线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接 关系的重要激酶，它可逆的催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。肌酸激酶有四 种同工酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型 主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌 细胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。
肌酸激酶在临床上的测定指的是总CK活性，主要用于诊断心肌梗塞。心肌 梗塞患者发病后2-4小时，血液中肌酸激酶的活动即开始增高。相比血清中谷草 转氨酶和乳酸脱氢酶的活力变化出现得更早。相比常用的谷草转氨酶和乳酸脱氢 酶，有以下优点：肌酸激酶升高迅速，患者疼痛出现后4小时肌酸激酶急剧上升， 最高可达正常上限的10-12倍，是目前最敏感的酶试验。因肝中肌酸激酶含量很 少，心脏疾病伴有肝郁血或肝损伤时，谷丙转氨酶、谷草转氨酶和乳酸脱氢酶活 力升高而肌酸激酶无变化，具有较强的特异性。此外，红细胞中此酶活力较低， 溶血标本对此酶测定的干扰较谷草转氨酶和乳酸脱氢酶小，成为临床化学方面常 用酶之一。在心肌梗死的病程中，如肌酸激酶活力再次升高，即说明心肌再梗死。 但此酶活力持续时间较短，2-4天后即恢复正常水平。故用此酶诊断心肌梗死， 因特别注意病程时间。对于发病时间较长的病例，应测定能维持较长时间持续升 高的酶活力的乳酸脱氢酶，此时肌酸激酶活性正常并不能否定心肌梗死诊断。
肌酸激酶还可用于肌肉疾病的诊断。在Duchenne肌萎缩患者血中，肌酸激 酶极度增高，甚至可高出正常上限的50倍，后随病程延长下降。此病是和性染 色体有关的遗传病，在无症状的女性，隐性携带者约75％肌酸激酶也高于正常。 其他内型的原发性肌萎缩患者肌酸激酶也有不同程度的升高，这可用于区别继发 性肌病如神经性或废用性肌萎缩，此时肌酸激酶活力往往正常。此外，肌酸激酶 还可用于脑肌病的诊断。高肌酸激酶活力常见于发作性癫痫、破伤风。肌酸激酶 增高也见于器质性神经肌病，如脑梗死、脑膜炎和脑炎等。
目前，肌酸激酶目前已有多种定性和定量的检测方法可用。现有检测方法包 含电泳法、化学发光法、酶法等。其中，电泳法存在灵敏度不够，操作时间长， 且操作繁琐等缺点，化学发光法虽具有高灵敏性，但其重复性差也阻碍了其大量 适用于临床，而酶法通过肌酸激酶检测试剂和对肌酸激酶进行检测，具有酶活性 高，检测灵敏度高的优点，但也存在酶在缓冲液中容易失去活性导致检测试剂盒 存储上会出现检测结果下降的缺点。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种高稳定性的肌酸激酶酶保 护添加剂，所述高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂可有效地提高肌酸激酶检测试 剂盒的稳定性，以解决现有技术中存在的缺陷。
为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂，该高稳定性 的肌酸激酶酶保护添加剂由混合保护剂和生物缓冲液复配组成，所述混合保护剂 包括脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、二硫苏糖醇、表面活性剂以及甘氨 酸；所述生物缓冲液包括牛血清蛋白和AEP-HBC。
进一步地，所述混合保护剂包括以下组分：脂肪醇聚氧乙烯醚20ml/L、烷基 酚聚氧乙烯醚20ml/L、二硫苏糖醇10mmol/L、甘氨酸0.5％(W/V％)以及表面活 性剂1％(W/V％)。
进一步地，所述生物缓冲液中包括：牛血清蛋白5wt％和AEP-HBC5g/L。
进一步地，所述混合保护剂和生物缓冲液的体积比为1：4，所述表面活性剂 为聚乙烯吡络烷酮。
第二方面，本发明提供一种稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂，该高稳定性的 肌酸激酶酶保护添加剂由混合保护剂和生物缓冲液组成，所述混合保护剂包括脂 肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、二硫苏糖醇、表面活性剂以及水解明胶或 部分水解明胶；所述生物缓冲液包括牛血清蛋白和AEP-HBC。
进一步地，所述混合保护剂和生物缓冲液的体积比为1；2-4，所述表面活性 剂为聚乙烯吡络烷酮。
第三方面，本发明提供一种高稳定性的肌酸激酶酶检测试剂盒，该高稳定性 的肌酸激酶酶检测试剂盒上述第一方面和第二方面所提供的肌酸激酶酶保护添 加剂。
进一步地，该高稳定性的肌酸激酶酶检测试剂盒包括相互独立的R1试剂和 R2试剂，其中，所述R1试剂中含有上述第一方面和第二方面所提供的肌酸激酶 酶保护添加剂。
进一步地，所述R1试剂包括乙酸镁、烟酸铬、咪哇缓冲液、葡萄糖、五磷 酸二腺苷、腺苷-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸、叠氮钠以及权利要求1所述的肌酸激酶酶保护添加剂；所述R2试剂包括： 咪哇缓冲液、二磷酸腺苷、磷酸肌酸、叠氮钠和葡萄糖激酶。
更进一步地，所述R1试剂包括：乙酸镁10mmol/L、烟酸铬0.04(v/v)、 咪哇缓冲液100mmol/L、葡萄糖25mol/L、五磷酸二腺苷12umol/L、腺苷-磷酸 5mmol/L、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶3KU/L、葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 3mmol/L、叠氮钠10mmol/L、脂肪醇聚氧乙烯醚20ml/L、烷基酚聚氧乙烯醚 20ml/L、二硫苏糖醇10-20mmol/L、甘氨酸0.5％(W/V％)、表面活性剂1％(W/V％)、 牛血清蛋白5wt％以及AEP-HBC5g/L；所述R2试剂包括：咪哇缓冲液100mmol/L、 二磷酸腺苷2mmol/L、磷酸肌酸50mmol/L、叠氮钠10mmol/L和葡萄糖激酶3KU/L。
进一步地，所述R1试剂的pH值为6.5-6.8。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
第一方面，本发明提供的一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂通过实验证 明可对酶起到一定的保护作用，使其降低对存放温度的要求，并延长其保存时间， 使得试剂盒在长期存放后仍能保持测定结果的准确性，在诊断试剂领域具有良好 的应用前景。
第二方面，本发明提供的一种高稳定性的肌酸激酶酶检测试剂盒，该试剂盒 包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包含本发明提供的酶保护剂，通过添加该 酶保护剂可使得酶不易被氧化失活，从而提高了肌酸激酶CK的检测试剂盒长期 存放的稳定性，以保证检测试剂盒长期保存后测定结果的准确性。
附图说明
图1为本发明的实施例1-实施例3的试剂盒产品的准确度对比结果，其中， 1a为实施例1和实施例2的对比结果，1b为实施例3和实施例2的对比结果， 1c为实施例1和实施例3的对比结果；
图2为本发明的实施例1-实施例3的试剂盒产品的稳定性对比结果，其中， 2a为实施例1的对比结果，2b为实施例2的对比结果，2c为实施例3的对比结 果；
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅 用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本 发明的保护范围。
实施例1
本实施例为未加肌酸激酶酶保护剂的肌酸激酶检测试剂盒的制备，其组成包 括R1试剂和R2试剂，且R1试剂和R2试剂的体积比为4：1，R1试剂和R2试剂 具体组成如下：
R1试剂：烟酸铬0.04(v/v)、咪唑缓冲液100mmol/L、葡萄糖25mol/L、 叠氮钠10mmol/L、五磷酸二腺苷12umol/L、腺苷一磷酸5mmol/L、葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶3KU/L、乙酸镁10mmol/L、葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 3mmol/L；
R2试剂：咪唑缓冲液100mmol/L、二磷酸腺苷2mmol/L、磷酸肌酸50mmol/L、 叠氮钠10mmol/L、葡萄糖激酶3KU/L。
实施例2
市售品牌肌酸激酶CK检测试剂盒(生产厂家：贝克曼库尔特实验系统(苏 州)有限公司)。
实施例3
本实施例为添加肌酸激酶酶保护剂的肌酸激酶CK检测试剂盒的制备，其组 成包括R1试剂和R2试剂，且R1试剂和R2试剂的体积比为4：1，R1试剂和 R2试剂具体组成如下：
R1试剂：烟酸铬0.04(v/v)、咪唑缓冲液100mmol/L、葡萄糖25mol/L、 叠氮钠10mmol/L、五磷酸二腺苷12umol/L、腺苷一磷酸5mmol/L、葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶3KU/L、乙酸镁10mmol/L、葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 3mmol/L、脂肪醇聚氧乙烯醚20ml/L、烷基酚聚氧乙烯醚20ml/L、二硫苏糖醇 10mmol/L、甘氨酸0.5％(W/V％)以及表面活性剂1％(W/V％)、6wt％和AEP-HBC8g/L。
R2试剂：咪唑缓冲液100mmol/L、二磷酸腺苷(ADP)2mmol/L、磷酸肌酸 50mmol/L、叠氮钠10mmol/L和葡萄糖激酶3KU/L。
实施例4
对实施例1-3的试剂盒进行准确度验证，具体实施方式如下：
比对试验：参照EP9A2的方法，收集新鲜的临床样本共40份，所选CK浓 度在试剂线性范围内并均匀分布，采用实施例1-3的试剂盒对40份样品中的 CK浓度进行分别检测，具体检测方法如下：
在检测过程中以全自动贝克曼AU480生化分析仪为例，设置主波长为： 340nm，副波长为410nm；比色杯光径为1.0cm；速率A(RATE A)；上升反应。
具体的操作步骤如表1所示：
表1测定肌酸激酶CK活性的检测步骤
Figure BDA0003181922990000061
在测定样本前，需要进行校准和质控程序，使用配套的校准品作校准曲线， 采用两点线性法定标。校准曲线每7天重新制作一次，当发生如下情形时，需 要重新校准；试剂批号更换时，仪器更换零部件或者保养时，质控品或样本结 果异常时。质控程序；采用配套的质控品，每天进行质控实验；每个浓度质控品 重复测量10次，计算精密度CV，控制在质控品偏差范围内。
根据校准曲线，计算样本的肌酸激酶CK活性：
Figure BDA0003181922990000062
检测结果数值如表2所示；并将检测结果进行两两对比，计算进行对比的 各两组结果的相关系数(r)和直线回归方程，对比结果如附图1所示。
表2采用实施例1-3试剂盒检测40例样本中的CK含量(U/L)
Figure BDA0003181922990000063
Figure BDA0003181922990000071
结论：如表1和附图1的统计数据所示，根据线性回归方程：y＝ax+b，三 组对比结果的R2均大于0.995，实施例1-3间的对比结果相关性良好，说明采 用本发明方法制备的肌酸激酶检测试剂盒在添加肌酸激酶酶保护剂和未添加肌 酸激酶酶保护剂时的检测准确度均较高，符合检测的准确度要求。
实施例5
对实施例1-3的试剂盒进行稳定性验证，具体实施方式如下：
将实施例1-3的肌酸激酶检测试剂盒分成两份，一份置于2-8℃保存，另 一份置于37℃水浴中恒温保存，每隔一天测定对标准品进行检测，连续检测一 周，观察血清样本测定值(血清定值160U/L)，通过连续的测定结果比较试剂 的稳定性，实施例1-实施例3的测试结果分别如表1-表3所示，分析结果如附 图2所示：
表3采用实施例1组分制备得到的试剂盒的稳定性数据(U/L)
Figure BDA0003181922990000081
表4采用实施例2产品试剂盒的稳定性数据(U/L)
Figure BDA0003181922990000082
表5采用实施例3组分制备得到的试剂盒的稳定性数据(U/L)
Figure BDA0003181922990000083
Figure BDA0003181922990000091
由表3-表5以及附图2可以看出，采用实施例1方法制得的试剂在2-8℃ 保存一周，在第5天时，测得CK活性开始略有下降，而实施例2和实施例3 的试剂盒产品在2-8℃保存一周稳定性良好。而采用实施例3方法制得的试剂 于37℃水浴一周，虽然测定CK浓度有一定程度下降，但是下降幅度不大，在 允许范围内。从以上实验数据及分析对比图来看，其试剂稳定性实施例3＞实 施例2＞实施例1，而且明显优于实施例1未加入酶保护剂制得的试剂以及市售 产品实施例2。说明本发明提供的一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂可有效的保护相应酶的活性，进而提高试剂的稳定性，大大提高试剂盒稳定周期并 降低对短期储存环境的要求。
综合实施例4和实施例5的实验结果可知，采用本发明实施例3方法配制 的肌酸激酶检测试剂盒具有准确度高、稳定性好的优点，可以满足临床需求， 在临床诊断心肌梗死、心肌炎等病情方面有很好的应用价值。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例 对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其 均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构 造部分均为公知技术。

Claims (10)

1.一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂，其特征在于：由混合保护剂和生物缓冲液复配组成，所述混合保护剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、二硫苏糖醇、表面活性剂以及甘氨酸；所述生物缓冲液包括牛血清蛋白和AEP-HBC。
2.如权利要求1所述的一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂，其特征在于：所述混合保护剂包括以下组分：脂肪醇聚氧乙烯醚20ml/L、烷基酚聚氧乙烯醚20ml/L、二硫苏糖醇10mmol/L、甘氨酸0.5％(W/V％)以及表面活性剂1％(W/V％)。
3.如权利要求1所述的一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂，其特征在于：所述生物缓冲液中包括：牛血清蛋白5wt％和AEP-HBC5g/L。
4.一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂，其特征在于：由混合保护剂和生物缓冲液组成，所述混合保护剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、二硫苏糖醇、表面活性剂以及水解明胶或部分水解明胶；所述生物缓冲液包括牛血清蛋白和AEP-HBC。
5.如权利要求1或4任意一项所述的一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂，其特征在于：所述混合保护剂和生物缓冲液的体积比为1：4。
6.如权利要求1或4任意一项所述的一种高稳定性的肌酸激酶酶保护添加剂，其特征在于：所述表面活性剂为聚乙烯吡络烷酮。
7.一种高稳定性的肌酸激酶酶检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1或权利要求2所述的肌酸激酶酶保护添加剂。
8.如权利要求7所述的一种高稳定性的肌酸激酶酶检测试剂盒，其特征在于：包括相互独立的R1试剂和R2试剂，其中，所述R1试剂中含有如权利要求1或权利要求2所述的肌酸激酶酶保护添加剂。
9.如权利要求8所述的一种高稳定性的肌酸激酶酶检测试剂盒，其特征在于：所述R1试剂包括乙酸镁、烟酸铬、咪哇缓冲液、葡萄糖、五磷酸二腺苷、腺苷-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、叠氮钠以及权利要求1所述的肌酸激酶酶保护添加剂；所述R2试剂包括：咪哇缓冲液、二磷酸腺苷、磷酸肌酸、叠氮钠和葡萄糖激酶。
10.如权利要求8所述的一种高稳定性的肌酸激酶酶检测试剂盒，其特征在于：所述R1试剂包括：乙酸镁10mmol/L、烟酸铬0.04(v/v)、咪哇缓冲液100mmol/L、葡萄糖25mol/L、五磷酸二腺苷12umol/L、腺苷-磷酸5mmol/L、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶3KU/L、葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸3mmol/L、叠氮钠10mmol/L、脂肪醇聚氧乙烯醚20ml/L、烷基酚聚氧乙烯醚20ml/L、二硫苏糖醇10-20mmol/L、甘氨酸0.5％(W/V％)、表面活性剂1％(W/V％)、牛血清蛋白5wt％以及AEP-HBC5g/L；所述R2试剂包括：咪哇缓冲液100mmol/L、二磷酸腺苷2mmol/L、磷酸肌酸50mmol/L、叠氮钠10mmol/L和葡萄糖激酶3KU/L。
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