CN107607524A - 氨测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检验技术领域,具体涉及一种氨测定试剂盒。本发明主要解决的是现有试剂稳定性不好的技术问题,故提供了一种新的氨测定试剂盒,其含有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、α‑酮戊二酸、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和防腐剂等组分。本发明氨测定试剂盒稳定性优异,检测灵敏准确,可应用于全自动生化分析仪,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域,具体涉及一种氨测定试剂盒。
背景技术
氨(Ammonia,AMM)在人体内含量极低,但氨对人体是有毒性的,尤其是对中枢神经系统有毒副作用。正常人体内血氨的来源主要是两方面,一是来源于体内蛋白质在代谢过程中产生的氨基酸,以及经脱氨作用分解而来的内源性氨;另一来源是蛋白质类食物在肠道内经细菌分解而成的外源性氨。在正常人体内主要经过以下途径去除血氨的毒作用:1、肝内经鸟氨酸循环合成尿素,经肾脏排出体外;2、转变为氨基酸上的氨基;3、在肾脏泌氨中与肾小管腔中的H+形成铵盐,随尿排出体外。肝脏将氨合成尿素,是保证血氨正常的关键。当肝脏功能严重损伤(80%肝组织遭破坏)时,氨不能被解毒,在中枢神经系统聚集,会引起肝性脑病。
一般来说,正常人体内游离血氨含量极低,血氨的生产和消除在正常体内维持着动态平衡,打破了这种平衡,血氨的生产增加或消除减少,都会引起血氨水平的增高。在发生代谢障碍性疾病肝性昏迷、肝性脑病、重症肝炎、尿毒症等及遗传性代谢性疾病时,由于氨不能从循环中及时清除均可使血氨升高。血氨测定是肝性脑病的重要实验诊断及监测指标,严重肝脏疾病时,氨不能从循环中清除,导致血氨增高,可引起肝性脑病(肝昏迷)。血氨病理学增高见于:1、严重肝损伤(肝性脑病、肝硬化、肝癌、重症肝炎等);2、尿毒症;3、上消化道大出血;4、肝外门脉系统分流形成。生理性增高见于过多进食高蛋白饮食和运动后;减低见于低蛋白饮食和严重贫血等。由于高血氨有神经毒性,因此它的测定对于肝昏迷、Reye综合征及儿科的一些先天性代谢等疾病的诊断、观察和预后判断有着重要的意义。
目前检测血氨的方法有多种,扩散法、去蛋白波氏比色法、离子交换层析法、氨电极法、酶法以及干化学法等等,全国临床检验操作规程推荐采用基于谷氨酸脱氢酶的酶学方法。基于谷氨酸脱氢酶的酶学方法的反应原理是:氨在谷氨酸脱氢酶的作用下与α-酮戊二酸和NADH反应,生成L-谷氨酸和NAD+,通过监测NADH的下降速率,与校准液相比,计算出血液样本中氨的含量。目前市场上存在单、双、三试剂等多种液体试剂盒及干片制剂用于血氨检测,但普遍存在试剂稳定性差的问题,特别是其中的NADH组分的稳定性尤为不好。NADH在水溶液中不稳定,易发生氧化还原反应,从而缩短试剂效期,难以在医院推广使用。冻干试剂虽能很好的解决液体试剂稳定性差的问题,但试剂在制备过程中需要进行冻干,增加试剂成本;冻干制剂在使用时也需要复溶等过程,使用较为繁琐,且复溶后的试剂短期不用完也难以继续使用,造成浪费,增加检测的实际成本。
发明内容
本发明的目的是针对以上问题,提供了一种稳定性优异、检测灵敏准确的氨测定试剂盒。
该氨测定试剂盒含有以下浓度的组分:
乳酸脱氢酶5~50KU/L;
谷氨酸脱氢酶1~10KU/L;
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸280~380μmol/L;
α-酮戊二酸5~15mmol/L;
缓冲液20~40mmol/L;
防腐剂0.025-0.8%。
进一步的,上述氨测定试剂盒含有以下浓度的组分:
乳酸脱氢酶8-30KU/L;
谷氨酸脱氢酶3-8KU/L;
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸280-380μmol/L;
α-酮戊二酸5-15mmol/L;
缓冲液20~40mmol/L;
防腐剂0.025-0.8%。
其中,上述氨测定试剂盒中,所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
进一步的,上述氨测定试剂盒中,所述的缓冲液pH为8.0-9.0。
进一步的,上述氨测定试剂盒中,所述的防腐剂为PC系列防腐剂或叠氮钠中的至少一种。
进一步的,上述氨测定试剂盒为单试剂。
此外,本发明还提供了上述的氨测定试剂盒在血液样本氨含量检测试剂中的用途。
本发明的有益效果在于:
本发明提供的氨测定试剂盒在37℃条件下可稳定14天,开瓶条件下可稳定30天,2-8℃条件下可稳定24个月,试剂稳定性优异。本发明氨测定试剂盒血氨检测精密度优异,批内CV≤4%;在氨浓度12~600μmol/L线性范围内,r≥0.990;当氨浓度在12~80μmol/L时,绝对偏差在±8μmol/L范围内,当氨浓度在80~600μmol/L时,相对偏差在±10%范围内;检测灵敏,结果准确可靠;且本发明为单试剂,操作方便,测定时间短,检测效率高,可应用于全自动生化分析仪,具有很好的应用前景。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明进行进一步的的说明,以下说明并不是对本发明保护范围的限制。
本发明通过大量创造性地工作,获得了一种新型的氨测定试剂盒。该氨测定试剂盒含有以下浓度的组分:
乳酸脱氢酶5~50KU/L;
谷氨酸脱氢酶1~10KU/L;
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸280~380μmol/L;
α-酮戊二酸5~15mmol/L;
缓冲液20~40mmol/L,pH8.0-9.0;
防腐剂0.025-0.8%。
上述氨测定试剂盒组分中乳酸脱氢酶缩写为LDH,谷氨酸脱氢酶缩写为GLDH,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸缩写为NADH。
本发明氨测定试剂盒的工作原理是在足量底物存在的条件下,加入高活力的GLDH催化反应向右移动迅速接近反应终点NH4 ++α-酮戊二酸+NADH→谷氨酸+NAD++H2O。NADH在340nm处有最大吸收,测定反应达到终点340nm处吸光度的变化与同法处理的标准液比较,计算氨的浓度。
由于传统血氨检测试剂中的NADH组分的稳定性尤为不好,在水溶液中易发生氧化还原反应,同时内源性丙酮酸引起NADH消耗(反应式为丙酮酸+NADH+H+→乳酸+NAD++H2O),从而缩短试剂效期,难以在医院推广使用。而在引入LDH后,导致试剂的组分更为复杂,相互之间的影响更不可控,导致其稳定性问题更难以解决。
本发明通过对LDH、NADH和GLDH的用量进行了大量筛选试验,经过大量创造性劳动,确定反应体系中加入5~50KU/L乳酸脱氢酶(LDH)、1~10KU/L谷氨酸脱氢酶(GLDH)、280~380μmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH);将NADH、LDH和GLDH的配比控制在上述范围内,能够有效确保试剂各组分的稳定性,进而保证测定试剂盒的稳定性和检测结果的准确性。
防腐剂是一类能够杀灭或抑制微生物生长的化学物质,在足够浓度并与微生物直接接触的情况下能发挥重要的防腐作用;防腐剂作用机制复杂,作用方式各不相同。目前常用的防腐剂种类繁多,如山梨酸钾、苯甲酸钠、PC-950、叠氮钠、CAA等。只有特定的防腐剂种类以及合适的试剂配伍比例,才能保证试剂的稳定性和氨浓度测定的准确性。
本发明通过大量试验对防腐剂种类及其用量进行筛选,发现在上述试剂配方时,使用PC系列防腐剂或叠氮钠,将其浓度控制在0.025-0.8%内能在不影响检测结果准确性的情况下,有效提高本试剂的稳定性,尤其是极大地提高了2-8℃条件下长期保存的时间和开瓶条件下的保存时间。所述PC系列(即ProClin系列)防腐剂包括PC-100、PC-200、PC-300、PC-500、PC-950等。
本发明中防腐剂浓度均为质量体积浓度,防腐剂0.025~0.8%表示每升溶液中含有0.025~8g防腐剂,即防腐剂浓度0.025-0.8g/L。
本发明氨测定试剂盒加入pH8.0-9.0的缓冲液20~40mmol/L作为缓冲体系,保证试剂缓冲能力,一般使用三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
以下通过实施例对本发明的具体实施方式进行更进一步的详细描述。
本发明在前期试验中,综合考虑了氨测定试剂盒中各成分及其含量对试剂稳定性和检测结果准确性的影响,经过大量尝试,初步获得了一个试剂配方,然后通过进一步筛选验证试验,从而最终得到本发明氨测定试剂盒各成分及其含量的优选范围。
本发明中试验例和实施例中使用的主要仪器和试剂为:
主要仪器:
全自动生化分析仪,日立公司,7180型;
主要试剂:
乳酸脱氢酶购买自SIGMA公司;
谷氨酸脱氢酶购买自SIGMA公司;
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸购买自罗氏公司;
α-酮戊二酸购买自阿拉丁公司;
三羟甲基氨基甲烷缓冲液购买自SIGMA公司;
叠氮钠购买自上海西宝公司;
PC300、PC950购买自SIGMA公司;
硫酸铵购买自广东光华公司。
试验例1~6和实施例1~8均采用下述检测方法,包括以下步骤:
1、参数设置及操作见表一:
表一参数设置及操作
2、样本测定具体操作:
表二取样量
单位:微升(μl)
空白(B) | 校准(C) | 测定(U) | |
样本/质控品 | — | — | 15 |
蒸馏水 | 15 | — | — |
校准品 | — | 15 | — |
氨测定试剂 | 150 | 150 | 150 |
注:校准品为硫酸铵配制的氨溶液,氨浓度CC为370μmol/L;质控品1的氨浓度为60μmol/L;质控品2的氨浓度为540μmol/L。
取相应量的样品和氨测定试剂,混匀,37℃恒温1.5分钟后测定初始吸光度,然后连续监测2分钟,测定平均每分钟吸光度变化率(ΔA/min)。
3、计算公式
式中:
ΔAU/min――样本吸光度变化率;
ΔAC/min――校准品吸光度变化率;
CC――校准品浓度。
特别说明:本发明试验1~6和实施例1~8表中,S1为蒸馏水,S2为校准品;QC1为质控品1,QC2为质控品2。
本发明中,KS1代表蒸馏水与试剂反应的吸光度变化率,AS1代表蒸馏水与试剂反应监测点的吸光度值,KS2代表校准品与试剂反应的吸光度变化率,AS2代表校准品与试剂反应监测点的吸光度值,K值代表仪器根据试剂与蒸馏水、校准品反应产生的吸光度变化率换算出的计算因子(K=(KS2-KS1)×10000/CC)),用于样本浓度计算;KS1、AS1、KS2、AS2、K值可由仪器直接得出。
试验例1:氨测定试剂盒GLDH用量的筛选验证试验
当LDH为20KU/L、NADH为300μmol/L、α-酮戊二酸为10mmol/L、三羟甲基氨基甲烷缓冲液为30mmol/L(pH8.5)、PC-950为0.1%时,分别采用GLDH为0.5KU/L、1KU/L、3KU/L、5KU/L、8KU/L、10KU/L、12KU/L,配制氨测定试剂,将试剂置于37℃环境14天,用该项目的蒸馏水和校准品校准测定。以未热破坏前试剂测定的K值结果±10%偏差为稳定性判断标准,考察试剂热稳定性能力,结果见表三。
表三GLDH用量对氨测定试剂盒稳定性的影响
由表三数据可知,当GLDH浓度为0.5KU/L时,热破14天,偏差达到-11.43%,超过稳定性判断标准,试剂热稳定性较差;当GLDH浓度为12KU/L时,热破12天,偏差达到-10.53%,超过稳定性判断标准,试剂热稳定性下降较大,因此本发明氨测定试剂盒中设计GLDH用量为1~10KU/L;为了进一步提高试剂稳定性,优选的,GLDH用量为3~8KU/L。
试验例2:氨测定试剂盒NADH用量的筛选验证
当LDH为20KU/L、GLDH为5KU/L、α-酮戊二酸为10mmol/L、三羟甲基氨基甲烷缓冲液为30mmol/L(pH8.5)、PC-950为0.1%时,分别采用NADH为250μmol/L、280μmol/L、320μmol/L、380μmol/L、400μmol/L,配制氨测定试剂,将试剂置于37℃环境14天,用该项目的蒸馏水和校准品校准测定,以未热破坏前试剂测定的K值结果±10%偏差为稳定性判断标准,考察试剂热稳定性能力,结果见表四。
表四NADH用量对氨测定试剂盒稳定性的影响
由表四数据可知,当NADH用量为250μmol/L时,热破14天,偏差达到-11.73%,超过稳定性判断标准,试剂热稳定性较差;当NADH用量为400μmol/L时,热破9天,偏差达到-11.95%,超过稳定性判断标准,试剂热稳定性显著降低,因此本发明氨测定试剂盒中设计NADH用量为280~380μmol/L。
试验例3:氨测定试剂盒防腐剂的筛选验证
当LDH为20KU/L、GLDH为5KU/L、NADH为300μmol/L、α-酮戊二酸为10mmol/L、三羟甲基氨基甲烷缓冲液为30mmol/L(pH8.5)时,分别采用浓度为0.1%的山梨酸钾、苯甲酸钠、PC-950、叠氮钠、CAA为防腐剂,配制氨测定试剂,将试剂置于37℃环境14天,用该项目的蒸馏水和校准品校准测定,以未热破坏前试剂测定的K值结果±10%偏差为稳定性判断标准,考察试剂热稳定性能力,结果见表五。
表五防腐剂种类对氨测定试剂盒稳定性的影响
由表五数据可知,防腐剂对试剂热稳定性影响较大,不适合的防腐剂,如山梨酸钾、苯甲酸钠、CAA等使试剂热稳定性显著降低,热破6至9天,偏差即超过稳定性判断标准;以叠氮钠、PC系列为防腐剂,试剂热稳定性良好。
试验例4:氨测定试剂盒防腐剂用量的筛选验证
当LDH为20KU/L、GLDH为5KU/L、NADH为300μmol/L、α-酮戊二酸为10mmol/L、三羟甲基氨基甲烷缓冲液为30mmol/L(pH8.5)时,分别采用叠氮钠、PC-950浓度为0.01%、0.025%、0.04%、0.80%、1.0%,配制氨测定试剂,将试剂置于37℃环境14天,用该项目的蒸馏水和校准品校准测定,以未热破坏前试剂测定的K值结果±10%偏差为稳定性判断标准,考察试剂热稳定性能力,结果见表六和表七。
表六叠氮钠用量对氨测定试剂盒稳定性的影响
表七PC-950用量对氨测定试剂盒稳定性的影响
本发明分别尝试了叠氮钠、PC-950用量对试剂热稳定性能的影响,由表六和表七数据可知,防腐剂用量不宜过低,也不宜过高;当叠氮钠浓度为0.01%时,热破14天,偏差达到-12.01%,超过稳定性判断标准,试剂热稳定性较差,当叠氮钠浓度为1.00%时,热破14天,偏差达到-11.80%,超过稳定性判断标准,试剂热稳定性较差;当PC-950浓度为0.01%时,热破14天,偏差达到-12.69%,超过稳定性判断标准,试剂热稳定性较差,当PC-950浓度为1.00%时,热破12天,偏差达到-10.20%,超过稳定性判断标准,试剂热稳定性较差;因此本发明将防腐剂浓度控制在0.025%~0.80%内,保证试剂热稳定性良好。
试验例5:氨测定试剂盒α-酮戊二酸用量的筛选验证
当LDH为20KU/L、GLDH为5KU/L、NADH为300μmol/L、三羟甲基氨基甲烷缓冲液为30mmol/L(pH8.5)、PC-950为0.1%时,分别采用α-酮戊二酸为2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L,配制氨测定试剂,将试剂置于37℃环境14天,用该项目的蒸馏水和校准品校准测定,以未热破坏前试剂测定的K值结果±10%偏差为稳定性判断标准,考察试剂热稳定性能力,结果见表八。
表八α-酮戊二酸用量对氨测定试剂盒稳定性的影响
由表八可知,α-酮戊二酸用量不宜过低,也不宜过高;当α-酮戊二酸浓度为2mmol/L时,热破12天,偏差达到-12.63%,超过稳定性判断标准,试剂热稳定性较差,当α-酮戊二酸浓度为20mmol/L时,热破14天,偏差达到-12.17%,超过稳定性判断标准,试剂热稳定性较差;当α-酮戊二酸用量为5~15mmol/L时,试剂热稳定性良好。
经过上述对氨测定试剂盒中成分及其含量的大量筛选实验,该测定试剂盒含有以下浓度的组分:
乳酸脱氢酶5~50KU/L;
谷氨酸脱氢酶1~10KU/L;
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸280~380μmol/L;
α-酮戊二酸5~15mmol/L;
三羟甲基氨基甲烷缓冲液20~40mmol/L;
防腐剂0.025-0.8%。
为了进一步提高氨测定试剂盒的稳定性和检测结果的准确性,优化的,上述氨测定试剂盒含有以下浓度的组分:
乳酸脱氢酶8-30KU/L;
谷氨酸脱氢酶3-8KU/L;
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸280-380μmol/L;
α-酮戊二酸5-15mmol/L;
三羟甲基氨基甲烷缓冲液20-40mmol/L;
防腐剂0.025-0.8%。
上述氨测定试剂盒的制备方法为:取相应量的各组分,将其溶解于水中,配制至相应浓度,即得;优选的,水的纯度不低于蒸馏水。
以下通过具体实施例进一步验证本发明氨测定试剂盒的稳定性和检测结果准确性。
实施例1:
表九实施例1氨测定试剂盒各组分浓度
组分 | 浓度 |
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 | 20mmol/L,pH8.0 |
LDH | 5KU/L |
GLDH | 1KU/L |
NADH | 280μmol/L |
α-酮戊二酸 | 5mmol/L |
PC-300 | 0.025% |
配制方法:按表九取相应量的各组分,将其溶解于蒸馏水中,配制至相应浓度,即得。
实施例2:
表十实施例2氨测定试剂盒各组分浓度
组分 | 浓度 |
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 | 30mmol/L,pH8.5 |
LDH | 25KU/L |
GLDH | 5KU/L |
NADH | 320μmol/L |
α-酮戊二酸 | 10mmol/L |
PC-950 | 0.1% |
配制方法:按表十取相应量的各组分,将其溶解于蒸馏水中,配制至相应浓度,即得。
实施例3:
表十一实施例2氨测定试剂盒各组分浓度
组分 | 浓度 |
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 | 40mmol/L,pH9.0 |
LDH | 50KU/L |
GLDH | 10KU/L |
NADH | 380μmol/L |
α-酮戊二酸 | 15mmol/L |
叠氮钠 | 0.2% |
配制方法:按表十一取相应量的各组分,将其溶解于蒸馏水中,配制至相应浓度,即得。
实施例4:氨测定试剂盒37℃热稳定性实验
将实施例1~3配制的试剂置于37℃环境14天,用该项目的蒸馏水和校准品校准测定,以未热破坏前试剂测定的K值结果±10%偏差为稳定性判断标准,考察试剂热稳定性能力,结果见表十二。
表十二氨测定试剂盒37℃热稳定性
结论:本发明氨测定试剂盒可在37℃条件下稳定14天,稳定性优异。
实施例5:氨测定试剂盒2-8℃开瓶稳定性评价
将实施例1~3配制的试剂置于2-8℃环境开瓶30天,用该项目的校准品校准后测定质控。氨测定试剂盒经校准后测定质控,以开瓶前试剂测定的质控结果±10%偏差为稳定性判断标准,考察试剂开瓶稳定性能力,结果见表十三。
表十三氨测定试剂盒2-8℃开瓶稳定性
单位:μmol/L
结论:本发明液体氨测定试剂盒可在2-8℃条件下开瓶稳定30天,稳定性优异。
实施例6:氨测定试剂盒2-8℃长期稳定性评价
将实施例1~3配制的试剂置于2-8℃环境存放24个月,用该项目的蒸馏水和校准品校准测定,并测定质控,以未热破坏前试剂测定的K值结果±10%偏差和质控结果±10%偏差为稳定性判断标准,考察试剂长期稳定性能力,结果见表十四。
表十四氨测定试剂盒2-8℃长期稳定性
单位:μmol/L
结论:本发明液体氨测定试剂盒可在2-8℃条件下长期稳定24个月,稳定性优异。
实施例7:氨测定试剂盒精密度试验
将实施例1~3配制的试剂用该项目的校准品校准后测定临床样本,每个实施例测定该样本10次,分别计算10次测定结果的批内CV,结果以±8%偏差为判断标准,考察试剂精密度性能,结果见表十五。
表十五氨测定试剂盒精密度试验
单位:μmol/L
注:CV即变异系数。
结论:本发明氨测定试剂盒批内CV小于4%,精密度优异。
实施例8:氨测定试剂盒线性试验
取接近线性上限的高值样本,按一定比例稀释为至少6种浓度(即理论x),其中,低值浓度样本须接近线性的下限,将实施例1~3配制的试剂用该项目的校准品校准后测定,对每一浓度的样本均重复测定3次(取样量参照表二),分别计算测定结果的均值(即实测y),根据实测y和理论x算得线性方程y=ax+b,进一步算出估算y'和偏差(偏差为实测y与估算y'的偏差),结果见表十六。
表十六氨测定试剂盒线性试验
单位:μmol/L
结论:在氨浓度12~600μmol/L线性范围内,r≥0.990;当氨浓度在12~80μmol/L时,绝对偏差在±8μmol/L范围内,当氨浓度在80~600μmol/L时,相对偏差在±10%范围内。
Claims (6)
1.氨测定试剂盒,其特征在于:含有以下浓度的组分:
乳酸脱氢酶 5~50KU/L;
谷氨酸脱氢酶 1~10KU/L;
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 280~380μmol/L;
α-酮戊二酸 5~15mmol/L;
缓冲液 20~40mmol/L;
防腐剂 0.025-0.8%。
2.根据权利要求1所述的氨测定试剂盒,其特征在于:含有以下浓度的组分:
乳酸脱氢酶 8-30KU/L;
谷氨酸脱氢酶 3-8KU/L;
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 280~380μmol/L;
α-酮戊二酸 5~15mmol/L;
缓冲液 20~40mmol/L;
防腐剂 0.025-0.8%。
3.根据权利要求1或2所述的氨测定试剂盒,其特征在于:所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
4.根据权利要求1~3任一项所述的氨测定试剂盒,其特征在于:所述的缓冲液pH为8.0-9.0。
5.根据权利要求1~4任一项所述的氨测定试剂盒,其特征在于:所述的防腐剂为PC系列防腐剂或叠氮钠中的至少一种。
6.权利要求1~5任一项所述的氨测定试剂盒在血液样本氨含量检测试剂中的用途。
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---|---|---|---|---|
CN104561237A (zh) * | 2013-10-21 | 2015-04-29 | 大连市沙河口区中小微企业服务中心 | 一种血氨试剂盒 |
CN106811505A (zh) * | 2015-11-30 | 2017-06-09 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定性强的单试剂液态血氨(amm)检测试剂 |
-
2017
- 2017-08-31 CN CN201710771678.3A patent/CN107607524A/zh active Pending
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