CN111766233B - 一种血清总抗氧化物状态测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种总抗氧化物状态测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有以下成分：3‑吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、硅酸钠、焦磷酸钠、乙二胺四乙酸二钠、表面活性剂、防腐剂；试剂R2：3‑吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、过二硫酸钾、2，2‑联氮‑二(3‑乙基‑苯并噻唑‑6‑磺酸)二铵盐（ABTS）、碳酸钾、表面活性剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，抗干扰能力强，准确度高，重复性好的液体试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生化试剂测定技术领域，特别涉及一种总抗氧化物状态测定试剂盒，还涉及所述总抗氧化物状态测定试剂盒制备方法和应用。
背景技术
活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧，同时一些环境因子例如紫外照射、γ射线照射、吸烟、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和 DNA 等的氧化损伤，诱发氧化应激(Oxidative stress)，继而导致各种动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、肝损伤、以及中枢神经系统疾病等。机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导的氧化应激(oxidativestress)的产生。一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。因此测定血浆、血清、尿液、唾液等各种体液，细胞或组织等裂解液中的总抗氧化能力具有非常重要的生物学意义。
临床或实验室诊断方法有比色法、酶联免疫法、福林钨钼酸法等。目前检测总抗氧化物状态的方法主要是生化试剂中的比色法，该方法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析、成本较低的优点，但现有技术中国产试剂盒存在稳定性差、抗干扰能力差等缺点，本发明针对现有总抗氧化物状态试剂盒的缺点进行改进以满足临床检测以及化学分析的要求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种总抗氧化物状态测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，抗干扰能力强，准确度高，重复性好的液体试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种总抗氧化物状态测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；
试剂R1中含有以下成分：
3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液 50~120 mmol/L；
乙二胺四乙酸二钠 0.1~0.5 mmol/L；
固定剂 0.1~1 mmol/L；
表面活性剂 0.1 %~1%；
防腐剂 0.5 ~1 ml/L；
试剂R2中含有以下成分：
3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液 50~120mmol/L；
过二硫酸钾 0.5~1.0mmol//L；
2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS） 0.5~1.0mmol/L；
碳酸钾 0.1~1. 0 mmol/L；
表面活性剂 0.1 %~1%；
防腐剂 0.5~1 ml/L；
其中所述百分比为体积比。
优选地，所述试剂R1和R2的pH 为 6.5-7.5。
优选地，所述试剂 R1 和R2试剂中的表面活性剂选自吐温系列、曲拉通系列中的一种或两种。
优选地，所述试剂 R1中的固定剂选自硅酸钠和焦磷酸钠，更优选地，硅酸钠和焦磷酸钠的摩尔比为1:1。
优选地，所述试剂R1 和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫柳汞和硫酸庆大霉素中的一种或多种。
优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1。 更优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
上述所述的总抗氧化物状态测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：试剂R1、R2均先加入3-吗啉丙磺酸缓冲液，用盐酸或氢氧化钠调节pH，试剂R1和R2的pH值为 6.5-7.5，再按照比例添加其他物质溶解，制成总抗氧化物状态测定试剂盒。
本发明还公开了总抗氧化物状态测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中总抗氧化物状态的浓度。
本发明试剂盒采用比色法，其反应原理为2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）被过二硫酸钾氧化生成 ABTS自由基阳离子，发较稳定蓝绿色光，可在600nm 测定。抗氧化物抑制标本中该色度的生成，抑制程度与抗氧化剂浓度成正比。反应具有特异性，使用全自动生化仪进行检测，操作简单、自动化程度高，可减少人为误差，试剂稳定，适合大多数临床实验室应用。
有益效果
1）本发明稳定的总抗氧化物状态测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。
2）通过在试剂R1中加入硅酸钠和焦磷酸钠（比例为1:1）组成复合稳定剂，有效地聚集样本中的氧化物成分，防止样本外氧化物与样本中检测物反应，大大增强试剂的抗干扰能力，提高试剂性能。
3）通过在试剂R2中加入碳酸钾，可以有效地增强过二硫酸钾与2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐反应速度，同时提高试剂的稳定性。
4）该试剂的准确度、重复性、线性范围等性能指标卓越，价格便宜，使用方便，有利于该试剂在市场中进一步推广。
附图说明
图1为实施例1和对比例1试剂的相关性曲线；
图2为实施例1线性的相关性曲线；
图3为实施例1和对比例1、2、3、4提供的总抗氧化物状态测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
本实实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用速率法进行测定，检测主波长为600nm，操作如下：
加入生理盐水、样本或校准品10µL，再加入200µL 的R1试剂，预孵育5min后，记录吸光度值A1；
再加入50µL的R2试剂，混匀，反应5min后，记录吸光度值A2，并计算ΔA。
总抗氧化物状态含量（mmol/L）=（ΔA样本÷ΔA校准品）*校准品浓度。
样本要求：
1.不溶血血清。
2.样本稳定性：标本2~8℃保存可稳定3天，-20℃保存可稳定2周。
实施例1
一种常规的总抗氧化物状态测定试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。
试剂R1中含有以下成分：
3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液 100 mmol/L；
乙二胺四乙酸二钠 0.1 mmol/L；
硅酸钠 0.1 mmol/L；
焦磷酸钠 0.1 mmol/L；
曲拉通x-100 0.1%；
proclin300 1ml/L；
试剂R2中含有以下成分：
3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液 100mmol/L；
过二硫酸钾 0.5mmol//L；
2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS） 0.5mmol/L；
碳酸钾 0.1mmol/L；
曲拉通x-100 0.1 %；
proclin300 1ml/L；
其中所述百分比为体积比。
本实施例所述试剂R1和试剂R2，配制时需先配制3-吗啉丙磺酸缓冲液，用盐酸或氢氧化钠调节pH， 试剂R1和R2的pH值调节为7.0，再按照比例添加其他物质溶解，制成总抗氧化物状态测定试剂。
所述的检测试剂，试剂R1与试剂R2的比例为4:1。
对比例1
市售的进口朗道总抗氧化物状态测定试剂盒。
对比例2
与实施例 1 中总抗氧化物状态测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含硅酸钠，焦磷酸钠为0.2 mmol/L，其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例 1 中总抗氧化物状态测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含焦磷酸钠，硅酸钠为0.2 mmol/L，其它与实施例1相同。
对比例4
与实施例 1 中总抗氧化物状态测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中不含碳酸钾，其它与实施例 1 相同。
对比例5
与实施例 1 中总抗氧化物状态测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含焦磷酸钠和硅酸钠，其它与实施例1相同。
性能验证
试验一
相关性实验：实验方案为：实施例1、对比例1，同时检测了40个临床血清样本，对两组检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以对比例1检测结果作为对照值，分别计算40对数据的相对偏差（r）。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10%。检测结果如表1所示，并获得了实施例1和对比例1试剂的相关性曲线（如图1所示）。
表1相关性对比实验结果
表2对比例1分别与实施例1的相关系数
由表1和图1的可以看出，实施例 1 和对比例 1 的试剂盒血清测试偏差最大值为-3.67％，两种试剂的相关系数为0.990，实施例1和对比例1的检测结果非常接近，因此本发明提供的实施例1检测试剂与的进口检测试剂相关性良好，完全可以替代进口试剂，满足临床需求。
试验二
重复性实验：用实施例1分别检测中值质控（靶值1.60±0.10mmol/L），对每份质控品进行20次检测，将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。检测结果如表3所示。
表3 质控检测结果
由表3可以看出，实施例1检测数值接近靶值，标准偏差小，变异系数小，重复性较好。能够符合临床病例样本的要求，对于临床检验有重要意义。
试验三
线性实验：取总抗氧化物状态高值样本为2.60mmol/L，并进行稀释，配制5个不同浓度的样本，依次为2.60mmol/L、1.30mmol/L、0.65mmol/L、0.325mmol/L、0mmol/L浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。用实施例1的试剂进行检测。检测结果如表所示：
表4线性相关验证实验检测结果
| 理论浓度（mmol/L） | 检测结果（mmol/L） |
| 0.00 | 0.00 |
| 0.325 | 0.34 |
| 0.65 | 0.62 |
| 1.30 | 1.34 |
| 2.60 | 2.64 |
| 相关系数R | 0.999 |
由表4和图2可以看出，本发明实施例1随稀释浓度呈线性变化，线性相关系数达到0.999，大于0.990，说明实施例1线性范围较好，能够符合临床病例样本的要求，对于临床检验有重要意义。
试验四
热稳定性实验：对实施例1和对比例1、2、3、4提供的总抗氧化物状态测定试剂进行稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例1、2、3、4提供的试剂，一起放入37℃水浴箱中，每天检测靶值为1.60±0.10mmol/L的质控品，并监测质控品测定值的变化。
表5试剂热稳定性验证结果
| 时间（天） | 实施例1试剂（mmol/L） | 对比例1试剂（mmol/L） | 对比例2试剂（mmol/L） | 对比例3试剂（mmol/L） | 对比例4试剂（mmol/L） |
| 1 | 1.61 | 1.63 | 1.56 | 1.55 | 1.59 |
| 2 | 1.62 | 1.61 | 1.56 | 1.53 | 1.57 |
| 3 | 1.61 | 1.59 | 1.56 | 1.52 | 1.57 |
| 4 | 1.61 | 1.57 | 1.55 | 1.52 | 1.55 |
| 5 | 1.61 | 1.57 | 1.55 | 1.53 | 1.54 |
| 6 | 1.60 | 1.55 | 1.54 | 1.51 | 1.53 |
| 7 | 1.58 | 1.54 | 1.54 | 1.52 | 1.49 |
| 8 | 1.59 | 1.53 | 1.53 | 1.51 | 1.48 |
| 9 | 1.58 | 1.49 | 1.52 | 1.51 | 1.46 |
| 10 | 1.59 | 1.48 | 1.52 | 1.51 | 1.44 |
由表5和图3可以看出，本发明提供的实施例1试剂在37℃水浴条件下10天内基本无变化，稳定性较好；而对比例1、4试剂在37℃水浴条件下10天内较实施例1变化明显。实施例1的试剂盒稳定性优于对比实施例1、4试剂盒的稳定性，说明碳酸钾的加入能够显著提高试剂的稳定性。同时对比例2试剂和对比例3试剂说明硅酸钠和焦磷酸钠的加入可以分别发挥作用，两种组分协同增效，共同提高试剂的准确度。稳定的缓冲液体系和多种成分共同提高了总抗氧化物状态测定试剂盒的稳定性。
试验五
准确度比对实验：取总抗氧化物状态高（2.40±0.10mmol/L）、中（1.60±0.10mmol/L）、低质0.80±0.10mmol/L）控样本，每个分成5等份，然后分别用实施例1试剂，与对比例1试剂、对比例2试剂、对比例3试剂、对比例5试剂同时对样本中总抗氧化物状态的含量进行检测，测定结果见表6。
表6试剂抗干扰验证结果
由表6可以看出，实施例1试剂在检测不同浓度质控物时，测试结果准确。对比例1试剂、对比例2试剂、对比例3试剂、对比例5试剂在检测低值质控时，结果显著降低。对比例2试剂、对比例3试剂和对比例5试剂说明虽然单组分的焦磷酸钠和硅酸钠双倍浓度的加入，但是抗干扰能力弱于两种成分的同时加入。说明焦磷酸钠和硅酸钠两种成分对于复杂的干扰成分能够相互协同，相互补充，共同作用，降低干扰物质对检测结果的干扰，提高检测结果的准确度。这说明通过优化反应缓冲体系、增加抗干扰成分和酶的保护剂后，实施例1试剂的抗干扰性能显著提高，优于对比例1试剂，满足临床需要。
综上所述，本发明一种总抗氧化物状态检测试剂在临床样本检测时与对比例1试剂有较好的相关性，但是在稳定性和抗干扰能力方面均优于对比例1试剂，为本发明试剂盒提供了良好的发展空间，同时增强了本发明试剂盒在市场上竞争力。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (3)
1.一种总抗氧化物状态测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；
试剂R1中含有以下成分：
3-吗啉丙磺酸缓冲液 100 mmol/L；
乙二胺四乙酸二钠 0.1 mmol/L；
硅酸钠 0.1 mmol/L；
焦磷酸钠 0.1 mmol/L；
曲拉通x-100 0.1%；
proclin300 1ml/L；
试剂R2中含有以下成分：
3-吗啉丙磺酸缓冲液 100mmol/L；
过二硫酸钾 0.5mmol//L；
2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐 0.5mmol/L；
碳酸钾 0.1mmol/L；
曲拉通x-100 0.1 %；
proclin300 1ml/L；
其中所述百分比为体积比，试剂R1与试剂R2的比例为4:1；试剂R1和R2的pH值均为7.0。
2.一种权利要求1所述的总抗氧化物状态测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：试剂R1、R2均先加入3-吗啉丙磺酸缓冲液，用盐酸或氢氧化钠调节pH，试剂R1和R2的pH值为 7.0，再按照比例添加其他物质溶解，制成总抗氧化物状态测定试剂盒。
3.一种权利要求1所述的总抗氧化物状态测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中总抗氧化物状态的浓度。
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