CN111334557B - 一种稳定、抗干扰能力强的血清唾液酸测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种唾液酸测定试剂盒,试剂盒含有试剂R1和试剂R2;试剂R1中含有以下成分:三羟甲基氨基甲烷‑盐酸(Tris‑HCL)缓冲液、乳酸脱氢酶(LDH)、N‑乙酰神经醛缩酶、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、表面活性剂、稳定剂、EDTA‑Na2、防腐剂;试剂R2:三羟甲基氨基甲烷‑盐酸(Tris‑HCL)缓冲液、神经氨酸苷酶、表面活性剂、稳定剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用,该试剂盒是一种稳定性强,抗干扰能力强,准确度高,重复性好的液体试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生化试剂测定技术领域,特别涉及一种唾液酸测定试剂盒,还涉及所述唾液酸测定试剂盒制备方法和应用。
背景技术
唾液酸(Sialic acid SA)又称N-乙酰神经氨酸,唾液酸是含有9碳糖神经氨酸的一族复合物的总称,在人体组织中其主要的衍生物是N-乙酰神经氨酸,它位于糖蛋白、糖脂结构的末端,而糖蛋白、糖脂则是细胞膜的重要组成成分,因此唾液酸对于维护细胞表面的功能起着决定性的作用。如参与识别宿主与病体之间的反应,保护膜免受蛋白水解,有助于激素受体的激活等。近年来,许多学者定量测定了不同疾病状态的血清唾液酸含量,发现肾病,糖尿病,心肌梗塞,中枢神经系统病变以及细菌感染时,其含量显著异常,同时,唾液酸也常被视为肿瘤标志之一。
肾功能的实验室检测,多年来临床上都广泛采用了BUN,Cr,尿酸及内生肌酐清除率等作为试验指标,但是这些指标在肾脏疾病,尤其是在慢性肾炎的早期诊断,其敏感性较差。研究发现,早期慢性肾小球肾炎和慢性肾功能不全的病人血清唾液酸显著升高,且与BUN,Cr无明显相关性,同时病人的尿中唾液酸也增高。由此唾液酸浓度的测定可以作为肾功能损害早期诊断的指标。同时,血清唾液酸在心肌梗塞病人中,与CRP、α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、α2-巨球蛋白等指标均呈正相关,为显著升高。另外,唾液酸含量与恶性肿瘤细胞的增值,转移、浸润、细胞粘附性降低,肿瘤抗原性及逃避宿主细胞的免疫监视等密切相关,是一种广泛有效的肿瘤标志物。测定血清唾液酸的含量,对恶性肿瘤的辅助诊断,疗效观察及预后判断有重要的临床价值。
由于唾液酸的多种生理作用,所以唾液酸的诊断具有非常重要的临床意义。
目前检测唾液酸的方法有硫代巴比妥酸显色法、过碘酸—间苯二酚法、酶联免疫法、神经氨酸苷酶法,荧光分析法、高效液相层析法。硫代巴比妥酸显色法、过碘酸—间苯二酚法均为最初的化学检测方法,但该两种法抗干扰能力差,操作繁琐。酶联免疫法灵敏度高,特异性强,但干扰因素多,重复性不好,价格不菲;荧光分析法和高效液相法,准确性和灵敏度高,但是仪器设备昂贵,试剂保存不方便,且为手工操作,耗时较长,价格不菲,无法在临床中应用;神经氨酸苷酶法具有特异性高,操作简单快捷、准确安全、可自动化分析、成本较低的优点,但现有技术中国产试剂盒存在稳定性、重复性较差等缺点,本发明针对现有唾液酸试剂盒的缺点进行改进以满足临床检测以及化学分析的要求。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种唾液酸测定试剂盒及其制备方法和应用,该试剂盒是一种稳定性强,抗干扰能力强,准确度高,重复性好的液体试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种唾液酸测定试剂盒,试剂盒含有试剂R1和试剂R2;
试剂R1中含有以下成分:
试剂R2:
其中所述百分比为体积比。
优选地,所述试剂R1的pH为7.5-9.5。
优选地,所述试剂R2的pH为7.0-8.0。
优选地,所述试剂R1和R2试剂中的表面活性剂选自吐温系列、曲拉通系列中的一种或两种。
优选地,试剂R1和R2试剂中的稳定剂为牛血清白蛋白(BSA)、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮k25。
优选地,所述试剂试剂R1和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫柳汞和硫酸庆大霉素中的一种或多种。
优选地,所述试剂R1与试剂R2的体积比为1~5:1。更优选地,所述试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。
上述所述的唾液酸测定试剂盒的制备方法,包括以下步骤:试剂R1、R2均先加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液,用盐酸或氢氧化钠调节pH,试剂R1的pH值调节为7.5-9.5,试剂R2的pH调节为7.0-8.0,再按照比例添加其他物质溶解,制成唾液酸测定试剂盒。
本发明还公开了唾液酸测定试剂盒的应用,用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中唾液酸的浓度。
本发明试剂盒采用神经氨酸苷酶法,其反应原理为样品中的唾液酸受神经氨酸苷酶的作用,形成N-乙酰神经氨酸,进而在N-乙酰神经醛缩酶的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖醇。丙酮酸在NADH存在下由乳酸脱氢酶(LDH)作用下生成乳酸和NAD+,通过测定NADH吸光度下降速率即可得到样品中唾液酸的浓度。反应具有特异性,使用全自动生化仪进行检测,操作简单、自动化程度高,可减少人为误差,适合大多数临床实验室应用。
有益效果
1)本发明稳定的唾液酸测定试剂盒为液体双试剂,无需复溶配制,开瓶可以直接使用。
2)通过在试剂R1和R2中加入牛血清白蛋白、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮k25等组成复合稳定剂,各组分协同作用,有效地提高了试剂中酶的稳定性,使试剂稳定性能优异,有利于该试剂在市场中进一步的推广。
3)添加胆红素氧化酶和抗坏血酸氧化酶,可以有效避免胆红素和抗坏血酸的干扰,大大增强试剂的抗干扰能力,一定程度的提高了试剂的稳定性。
4)该试剂的准确度、重复性、线性范围等性能指标卓越,价格便宜,使用方便,有利于该试剂在市场中进一步推广。
附图说明
图1为实施例1和对比例1试剂的相关性曲线;
图2为对比例1和对比例7试剂的相关性曲线;
图3为实施例1线性的相关性曲线;
图4为实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7提供的唾液酸测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:
本实实施例所述试剂盒,在使用时,其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪,利用速率法进行测定,检测主波长为340nm,操作如下:
加入生理盐水、样本或校准品5μL,再加入225μL的R1试剂,预孵育5min后
再加入75μL的R2试剂,混匀,延迟1.5min,连续监测2min,并计算ΔA/min。
唾液酸含量(mg/L)=(ΔA/min样本÷ΔA/min校准品)×校准品浓度。
样本要求:
1.不溶血血清。
2.样本稳定性:标本2~8℃保存可稳定3天,-20℃保存可稳定2周。
实施例1
一种常规的唾液酸测定试剂盒,它包括试剂R1和试剂R2。
试剂R1中含有以下成分:
试剂R2:
本实施例所述试剂R1和试剂R2,配制时需先配制三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液,用盐酸或氢氧化钠调节pH,试剂R1的pH值调节为8.5,试剂R2的pH调节为8.0,再添加其它物质。
所述的检测试剂,试剂R1与试剂R2的比例为3:1。
对比例1
市售的进口Sigma唾液酸测定试剂盒。
对比例2
与实施例1中唾液酸测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中的不含胆红素氧化酶和抗坏血酸氧化酶,其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例1中唾液酸测定试剂盒的区别仅在于试剂R1和试剂R2中的稳定剂不含海藻糖,其它与实施例1相同。
对比例4
与实施例1中唾液酸测定试剂盒的区别仅在于试剂R1和试剂R2中的稳定剂不含聚乙烯吡咯烷酮k25,其它与实施例1相同。
对比例5
与实施例1中唾液酸测定试剂盒的区别仅在于试剂R1和试剂R2中的稳定剂不含牛血清白蛋白(BSA),其它与实施例1相同。
对比例6
与实施例1中唾液酸测定试剂盒的区别仅在于试剂R1和试剂R2中的稳定剂中的海藻糖替换为相同质量的蔗糖,其它与实施例1相同。
对比例7
专利CN102072953B所采用的的灵敏度高的唾液酸检测试剂。
试剂R1中含有以下成分:
试剂R1的PH为6.5。
试剂R2:
试剂R1的PH为7.2。
试剂R1与试剂R2的比例为3:1
性能验证
试验一
相关性实验:实验方案为:实施例1、对比例1和对比例7,同时检测了40个临床血清样本,对两组检测结果进行相关性分析,计算相关系数r;以对比例1检测结果作为对照值,分别计算40对数据的相对偏差(r)。要求r不小于0.990,相对偏差不超过±10%。
检测结果如表1所示,并获得了实施例1和对比例1试剂的相关性曲线(如图1所示),对比例1和对比例7试剂的相关性曲线(如图2所示)。
表1相关性对比实验结果
表2对比例1分别与实施例1和对比例7的相关系数
由表1、2和图1的可以看出,实施例1和对比例1的试剂盒血清测试偏差最大值为3.54%,两种试剂的相关系数为0.9947,实施例1和对比例1的检测结果非常接近,因此本发明提供的实施例1检测试剂与的进口检测试剂相关性良好,完全可以替代进口试剂;由表1、2和图2可以看出,对比例7和对比例1检验结果偏差较大,相关系数为0.9498,说明本发明试剂盒准确度优于对比例7。
试验二
重复性实验:用实施例1分别检测低值质控品(靶值400±10mg/L)和中值质控(靶值700±10mg/L),对每份质控品进行20次检测,将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。结果见表3,由表3可以看出,实施例1检测数值接近靶值,标准偏差小,变异系数小,重复性较好。
表3质控检测结果
试验三
线性实验:取唾液酸钠高值样本为2000mg/L,并进行稀释,配制6个不同浓度的样本,依次为2000mg/L、1000mg/L、500mg/L、250mg/L、125mg/L、0mg/L浓度的样本,每个浓度水平各样本分别测定三次,分别取其平均值。用实施例1的试剂进行检测。检测结果如表所示:
表4线性相关验证实验检测结果
由表4和图3可以看出,本发明实施例1随稀释浓度呈线性变化,线性相关系数达到0.9999,大于0.990,说明实施例1线性范围较好,能够符合临床病例样本的要求,对于临床检验有重要意义。
试验四
热稳定性实验:对实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7提供的唾液酸测定试剂进行稳定性试验,试验方案为:对实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7提供的试剂,一起放入37℃水浴箱中,每天检测靶值为400±10mg/L的质控品,并监测质控品测定值的变化。
表5试剂热稳定性验证结果
由表5和图4可以看出,与对比例1相似,本发明提供的实施例1试剂在37℃水浴条件下10天内基本无变化,稳定性较好;而对比例2、3、4、5、6、7试剂在37℃水浴条件下10天内变化明显。实施例1的试剂盒稳定性优于对比实施例2、3、4、5、6、7试剂盒的稳定性,同时,海藻糖的加入效果也明显的优于蔗糖的效果。说明本发明牛血清白蛋白,聚乙烯吡咯烷酮k25,海藻糖同时的加入,可以协同作用,共同提高唾液酸测定试剂盒的稳定性,
试验五
干扰实验:取唾液酸样本,分成3等份,然后将每等份再分成5等份,加入不同的干扰物质,使其在血清中的浓度达到表6的要求。然后分别用实施例1试剂,与对比例1试剂和对比例2试剂同时对样本中唾液酸的含量进行检测,加入不同干扰物质后各组的测定结果见表6。
表6试剂抗干扰验证结果
由表6可以看出,实施例1试剂在甘油三酯≤20mg/L、胆红素≤20mg/L、抗坏血酸≤40mg/L时对测试结果无明显干扰。对比例1试剂、对比例2试剂在甘油三酯≤20mg/L,无明显干扰。而对比例1试剂在胆红素≤20mg/L、抗坏血酸≤40mg/L干扰物质存在时,受到干扰,检测结果相对偏差超过5%;而对比例2试剂在胆红素≤20mg/L、抗坏血酸≤40mg/L干扰物质存在时,受到干扰更加显著。这说明通过优化反应缓冲体系、增加抗干扰成分后,实施例1试剂的抗干扰性能显著提高,优于对比例1试剂。同时,由图4可以看出,两种酶的加入,在一定程度上也提高了试剂的稳定性。
综上所述,本发明一种稳定、抗干扰能力强的唾液酸检测试剂在临床样本检测时与对比例1试剂有较好的相关性,但是在对干扰物质的抗干扰能力方面均优于对比例1试剂,为本发明试剂盒提供了良好的发展空间,同时增强了本发明试剂盒在市场上竞争力。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代,但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (3)
1.一种唾液酸测定试剂盒,其特征在于,试剂盒含有试剂R1和试剂R2;
试剂R1中含有以下成分:
三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液 100 mmol/L;
乳酸脱氢酶 8.9 KU/L;
还原型辅酶Ⅰ 0.13 mmol/L;
N-乙酰神经醛缩酶 2.7KU/L;
EDTA-Na2 5 g/L;
胆红素氧化酶 1KU/L;
抗坏血酸氧化酶1 KU/L;
曲拉通-100 0.1%;
海藻糖 5g/L;
牛血清白蛋白 1g/L;
聚乙烯吡咯烷酮k25 4g/L;
叠氮钠 1 g/L;
试剂R2:
三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液 100 mmol/L;
神经氨酸苷酶 0.27KU/L
曲拉通-100 0.1%;
海藻糖 5g/L;
牛血清白蛋白 1g/L;
聚乙烯吡咯烷酮k25 4g/L;
叠氮钠 1 g/L;
所述的试剂R1与试剂R2的体积比为3:1;试剂R1的pH值为8.5,试剂R2的pH为8.0。
2.一种权利要求1所述的唾液酸测定试剂盒的制备方法,其特征在于,所述试剂R1和试剂R2,配制时需先配制三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液,用盐酸或氢氧化钠调节pH,试剂R1的pH值调节为8.5,试剂R2的pH调节为8.0,再按照比例添加其他物质溶解,制成唾液酸测定试剂盒。
3.一种权利要求1所述的唾液酸测定试剂盒的应用,用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中唾液酸的浓度。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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