CN106092942A - 一种测定唾液酸的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定唾液酸的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分：试剂R1：AMP缓冲液5~35mmol/L、神经氨酸苷酶2~8KU/L、乳酸脱氢酶0.01~0.30KU/L、吐温‑20 3~15g/L、苯甲酸钠0.1~2g/L，试剂R2：AMP缓冲液5~35mmol/L、NADH2~18mmol/L、神经氨酸醛缩酶0.5~5.5KU/L、聚乙二醇‑2000 1~15g/L、苯甲酸钠0.1~2g/L，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的唾液酸的浓度。本发明具有操作方便、测定准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定唾液酸的试剂盒及其制备方法。
背景技术
唾液酸（SA）是一种天然存在的碳水化合物,它最初由颌下腺粘蛋白中分离而出，也因此而得名,唾液酸通常以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在，人体中，脑的唾液酸含量最高，脑灰质中的唾液酸含量是肝、肺等内脏器官的15倍，唾液酸的主要食物来源是母乳，也存在于牛奶、鸡蛋和奶酪中。
唾液酸是细胞膜糖蛋白的重要组成部分，与生物体的许多生物学功能有关，且与细胞恶变、癌转移、浸润、失去接触性抑制、细胞粘附性降低以及肿瘤抗原性密切相关，测定血清唾液酸浓度，可作为癌肿诊断辅助性指标和疗效观察指标。
唾液酸（SA）明显升高的疾病有：急性白血病、食道癌、贲门癌、胃癌、肠癌、肝癌、肺癌以及卵巢癌等，其中以急性白血病患者为最高。肿瘤患者血清唾液酸增高可能是肿瘤细胞涎糖蛋白合成增加和代谢的改变在血中的反映
癌症患者的唾液酸（SA）水平动态变化与病情相关，可以用于早期发现肿瘤的转移和复发。
目前，检测唾液酸（SA）含量的方法有HPLC法、化学比色法，HPLC法虽然灵敏度高、特异性好，但是需要特殊的仪器且昂贵，化学比色法特异性低，操作复杂，部分反应的物质需要特殊的化学手段提取，而且测定准确度低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、成本高以及测定准确度低的缺陷，而提供一种测定唾液酸的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定唾液酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
AMP缓冲液 5~35 mmol/L
神经氨酸苷酶 2~8 KU/L
乳酸脱氢酶 0.01~0.30 KU/L
吐温-20 3~15 g/L
苯甲酸钠 0.1~2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
AMP缓冲液 5~35 mmol/L
NADH 2~18 mmol/L
神经氨酸醛缩酶 0.5~5.5KU/L
聚乙二醇-2000 1~15 g/L
苯甲酸钠 0.1~2 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定唾液酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
AMP缓冲液 20 mmol/L
神经氨酸苷酶 5 KU/L
乳酸脱氢酶 0.10 KU/L
吐温-20 9 g/L
苯甲酸钠 1 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
AMP缓冲液 20 mmol/L
NADH 10 mmol/L
神经氨酸醛缩酶 3.0KU/L
聚乙二醇-2000 8 g/L
苯甲酸钠 1 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明还公开了上述测定唾液酸的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
AMP缓冲液 5~35 mmol/L
神经氨酸苷酶 2~8 KU/L
乳酸脱氢酶 0.01~0.30 KU/L
吐温-20 3~15 g/L
苯甲酸钠 0.1~2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
AMP缓冲液 5~35 mmol/L
NADH 2~18 mmol/L
神经氨酸醛缩酶 0.5~5.5 KU/L
聚乙二醇-2000 1~15 g/L
苯甲酸钠 0.1~2 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的唾液酸的浓度。
作为优选，步骤（b）中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为3:1。
作为优选，步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:10到1:50之间。
本发明的检测原理是：样品中的唾液酸受神经氨酸苷酶的作用，形成N-乙酰神经氨酸，进而在N-乙酰神经氨酸醛缩酶（NANA-醛缩酶）的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺。丙酮酸在NADH存在下由乳酸脱氢酶（LDH）作用下生成乳酸和NAD+。测定该NADH的吸光下降的速率可求得样本中唾液酸浓度。
样本中唾液酸（SA）的活性（mg/dL）= CS ×（mg/dL）
式中：ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS校准液中SA的浓度
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明通过在试剂R2中添加了反应加速剂聚乙二醇-2000，加快了反应的反应速度，防止了因反应体系反应过慢所带来的酶浓度变化过小，进一步造成反映产物过低、变化不灵敏的缺陷，因此本发明的检测的准确性较高，另外在苯甲酸钠作为防腐剂的同时，提高了整个试剂的保存的稳定性，也就进一步提高了本发明的检测的准确性、精密性，而且本发明不含有任何污染物，不会造成环境的污染，操作也比较简便。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
AMP缓冲液 20 mmol/L
神经氨酸苷酶 5 KU/L
乳酸脱氢酶 0.10 KU/L
吐温-20 9 g/L
苯甲酸钠 1 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
AMP缓冲液 20 mmol/L
NADH 10 mmol/L
神经氨酸醛缩酶 3.0KU/L
聚乙二醇-2000 8 g/L
苯甲酸钠 1 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
AMP缓冲液 5 mmol/L
神经氨酸苷酶 8 KU/L
乳酸脱氢酶 0.30 KU/L
吐温-20 3 g/L
苯甲酸钠 0.1 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
AMP缓冲液 5 mmol/L
NADH 18 mmol/L
神经氨酸醛缩酶 0.5KU/L
聚乙二醇-2000 15g/L
苯甲酸钠 0.1 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
AMP缓冲液 20 mmol/L
神经氨酸苷酶 5 KU/L
乳酸脱氢酶 0.10 KU/L
吐温-20 9 g/L
苯甲酸钠 1 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
AMP缓冲液 20 mmol/L
NADH 10 mmol/L
神经氨酸醛缩酶 3.0KU/L
聚乙二醇-2000 8g/L
苯甲酸钠 1 g/L
其溶剂为纯化水；
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长340nm，副波长405nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：负反应；
3、检测步骤
（a）取180ul试剂R1与6μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入60μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化值ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中唾液酸（SA）的活性（mg/dL）= CS × （mg/dL）计算出样本中的唾液酸的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
AMP缓冲液 5 mmol/L
神经氨酸苷酶 8 KU/L
乳酸脱氢酶 0.30 KU/L
吐温-20 3 g/L
苯甲酸钠 0.1 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
AMP缓冲液 5 mmol/L
NADH 18 mmol/L
神经氨酸醛缩酶 0.5 KU/L
聚乙二醇-2000 15 g/L
苯甲酸钠 0.1 g/L
其溶剂为纯化水；
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长340nm，副波长405nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：负反应；
3、检测步骤
（a）取180ul试剂R1与6μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入60μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化值ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中唾液酸（SA）的活性（mg/dL）= CS × （mg/dL）计算出样本中的唾液酸的浓度。
表1为实施例1所制得的测定唾液酸的试剂盒以及实施例2所制得的测定唾液酸的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的唾液酸的浓度为 25.0 mg/dL，测定结果见表1：
表1
| 第1次（mg/dL） | 第2次（mg/dL） | 第3次（mg/dL） | 均值（mg/dL） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 25.7 | 25.4 | 25.1 | 25.4 | 1.60 |
| 实施例2 | 25.9 | 26.0 | 25.8 | 25.9 | 3.60 |
由表1可知，本发明所制得的测定唾液酸的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定唾液酸的试剂盒以及实施例2所制得的测定唾液酸的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的唾液酸的浓度为 46.0 mg/dL，测定结果见表2：
表2
| 第1次（mg/dL） | 第2次（mg/dL） | 第3次（mg/dL） | 均值（mg/dL） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 46.1 | 45.9 | 45.6 | 45.87 | 0.28 |
| 实施例2 | 45.4 | 45.3 | 46.4 | 45.70 | 0.65 |
由表2可知，本发明所制得的测定唾液酸的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定唾液酸的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定唾液酸的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定唾液酸的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (5)
1.一种测定唾液酸的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
AMP缓冲液 5~35 mmol/L
神经氨酸苷酶 2~8 KU/L
乳酸脱氢酶 0.01~0.30 KU/L
吐温-20 3~15 g/L
苯甲酸钠 0.1~2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
AMP缓冲液 5~35 mmol/L
NADH 2~18 mmol/L
神经氨酸醛缩酶 0.5~5.5 KU/L
聚乙二醇-2000 1~15 g/L
苯甲酸钠 0.1~2 g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定唾液酸的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
AMP缓冲液 20 mmol/L
神经氨酸苷酶 5 KU/L
乳酸脱氢酶 0.10 KU/L
吐温-20 9 g/L
苯甲酸钠 1 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
AMP缓冲液 20 mmol/L
NADH 10 mmol/L
神经氨酸醛缩酶 3.0KU/L
聚乙二醇-2000 8 g/L
苯甲酸钠 1 g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定唾液酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
AMP缓冲液 5~35 mmol/L
神经氨酸苷酶 2~8 KU/L
乳酸脱氢酶 0.01~0.30 KU/L
吐温-20 3~15 g/L
苯甲酸钠 0.1~2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
AMP缓冲液 5~35 mmol/L
NADH 2~18 mmol/L
神经氨酸醛缩酶 0.5~5.5 KU/L
聚乙二醇-2000 1~15 g/L
苯甲酸钠 0.1~2 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的唾液酸的浓度。
4.根据权利要求3所述的一种测定唾液酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为3:1。
5.根据权利要求3所述的一种测定唾液酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:10到1:50之间。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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