CN108507962A - 高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，涉及溶菌酶活力检测分析检测技术领域。所述检测方法包括以下步骤：以溶壁微球菌菌液为底物，用比浊法，将待测珍禽蛋蛋清样品溶液加入酶促反应体系，在445‑455nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位计算溶菌酶活力；其中，采用0.05‑0.08mol/L pH＝6.0‑6.5的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品。本发明缓解了盐浓度过高会抑制酶活造成检测结果不准确的问题，该方法适合高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶酶活的检测，在该方法的各条件参数下测得的酶活结果更加准确。

Description

高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法
技术领域
本发明涉及溶菌酶活力检测分析技术领域，具体而言，涉及一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法。
背景技术
溶菌酶(Lysozyme)，又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织，且本身无毒无害，因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，在食品保鲜(特别是奶酪，清酒生产)、医药(眼药水、润喉液)、日化(牙膏、化妆品)、婴儿食品(母乳化奶粉)及科学研究中有着广泛的作用。溶菌酶广泛地存在于高等动物组织及分泌物、植物及各种微生物中，以在新鲜的鸡蛋清中含量最高。前期研究表明，以高原特种养殖珍禽蛋作为原料提取溶菌酶，可制得高活力的优质溶菌酶，在天然防腐剂市场可形成巨大的竞争力。
溶菌酶产品最主要的评价指标是酶活力。酶活力指在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)，温度规定为25度，其他条件取反应的最适条件。溶菌酶的活力检测，较常用的测定方法有琼脂板扩散法、比浊法、比色法、高效液相色谱法等，国外近年来集中在比浊法测定溶菌酶活性。目前，现有的关于溶菌酶活性检的测定方法的规定或声明有以下三种—GBT25879-2010鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定分光光度法，西药部颁标准中溶菌酶检测方法及食品添加剂联合专家委员会(JECFA)发布产品规范中溶菌酶检测方法。三种方法都采用比浊法，但是所采用的磷酸盐缓冲液浓度、计时区间、溶壁微球菌的OD450值区间等不同，由于方法条件各异，结果差异较大，由于高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶含量较高，如果采用传统方法条件会造成检测结果不准确，例如盐浓度过高会抑制酶活而影响结果，需要对测定方法中各条件进行重新探索，因此建立一种适用于高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法十分必要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶酶活的检测方法，缓解了盐浓度过高会抑制酶活造成检测结果不准确的问题，该方法适合高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶酶活的检测，在该方法的各条件参数下测得的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中的溶菌酶酶活结果更加准确。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，包括以下步骤：
酶促反应以溶壁微球菌菌液为底物，用比浊法，将待测珍禽蛋蛋清样品溶液加入酶促反应体系，在445-455nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，根据待测珍禽蛋蛋清样品溶液中溶菌酶浓度，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位计算溶菌酶活力；
其中，采用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液。
优选地，在本发明技术方案的基础上，采用0.06-0.08mol/L pH＝6.0-6.2的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液；
优选地，采用1/15-1/14mol/L pH＝6.0-6.2的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液。
优选地，在本发明技术方案的基础上，在448-452nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，优选在450nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值。
优选地，在本发明技术方案的基础上，待测珍禽蛋蛋清样品溶液中溶菌酶浓度为100-200μg/mL；
优选地，待测珍禽蛋蛋清样品用磷酸盐缓冲液稀释200-400倍，优选稀释200-300倍，进一步优选稀释250-300倍。
优选地，在本发明技术方案的基础上，将待测珍禽蛋蛋清样品溶液加入酶促反应体系前将溶壁微球菌菌液在445-455nm波长下的吸光度值调至0.45-0.77，优选0.55-0.75，进一步优选0.65-0.75。
优选地，在本发明技术方案的基础上，高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，包括以下步骤：
(a)配制溶壁微球菌菌液：将溶壁微球菌于液体LB培养基中，37-38℃培养9-10h至菌体繁殖，将培养液离心，收集沉淀菌体，加入甘油溶液置于-60℃保存；使用前，用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌，得到溶壁微球菌菌液，并将菌液调至OD450吸光度值至0.70±0.05，4℃放置备用；
(b)配制试样溶液：取待测珍禽蛋蛋清样品用3-5层纱布过滤，取过滤试样，用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液稀释200-300倍，得到试样溶液；
(c)试样测定：先测定试样溶液中溶菌酶浓度，再用比浊法，以溶壁微球菌菌液为底物，将试样溶液加入酶促反应体系，在450nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，根据试样溶液中溶菌酶浓度，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位计算溶菌酶活力。
优选地，在本发明技术方案的基础上，步骤(c)包括以下步骤：先测定试样溶液中溶菌酶浓度c，再用比浊法，以磷酸盐缓冲液为空白液调零，将菌液置于1cm比色池中，每3mL菌液加入0.15mL试样溶液，从加入试样溶液开始计时，记录在450nm波长处反应15s和75s共间隔60s时间点的读数A1、A2，根据试样溶液中溶菌酶浓度c，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位，试样中溶菌酶活力按公式(1)计算：
式中：
EA——溶菌酶活力，U/mg；
△E450——在两时间点测定的吸光度A1、A2之差；
c——试样溶液中溶菌酶的浓度，μg/mL。
优选地，在本发明技术方案的基础上，步骤(c)中测定试样溶液中溶菌酶浓度包括以下步骤：
(A)溶菌酶标准品溶液的配制：取适量溶菌酶干品，用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至浓度为300-600μg/mL；
(B)建立溶菌酶标准曲线：采用所述磷酸盐缓冲液将溶菌酶标准品溶液稀释成不同浓度梯度，通过紫外分光光度法在281nm波长处测定吸光度值，建立溶菌酶标准曲线；
(C)测定试样溶液中溶菌酶浓度：将试样溶液按照与标准品相同的分析方式测定试样溶液的吸光度值，根据所述吸光度值由标准曲线计算试样溶液中溶菌酶含量。
优选地，在本发明技术方案的基础上，磷酸盐缓冲液的配制包括以下步骤：
每15-25mL的1/15-1/14mol/L Na2HPO4溶液与75-85mL的1/15-1/14mol/L NaH2PO4溶液混合。
优选地，在本发明技术方案的基础上，步骤(a)中甘油溶液为灭菌的质量百分比为15-25％的甘油溶液；
优选地，步骤(a)中液体LB培养基中包含质量百分比0.8-1.2％的蛋白胨、0.4-0.6％的酵母提取物和0.8-1.2％的氯化钠；液体LB培养基的pH为7.2-7.4。
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明以溶壁微球菌为底物，用比浊法，以445-455nm内一定波长处菌液单位时间内吸光度降低程度为依据，测定溶菌酶活力，其中采用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，采用该较低范围内的盐浓度体系能够减缓盐浓度过高对酶活性造成的影响，缓解了采用现有方法条件测出的溶菌酶活力结果不准确，存在较大误差的缺陷。采用本发明方法测得的溶菌酶活力结果更加精准，更接近于真实值，准确度高，且更加适合于高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的测定，方法重复性好，在相同条件下获得的三次独立测试结果的变异系数≤5％。
本发明检测方法操作简单、耗时短、针对性强，适于实际应用，适合于高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测，检测结果准确度高。
附图说明
图1为不同浓度磷酸盐缓冲液对珍禽蛋清中溶菌酶活力的影响；
图2为不同浓度珍禽蛋蛋清溶液对溶菌酶活力的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，包括以下步骤：
酶促反应以溶壁微球菌菌液为底物，用比浊法，将待测珍禽蛋蛋清样品溶液加入酶促反应体系，在445-455nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，根据待测珍禽蛋蛋清样品溶液中溶菌酶浓度，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位计算溶菌酶活力；
其中，采用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液。
高原特种养殖珍禽蛋指在高原地区(例如中国青海等地区)所散养并饲喂纯天然植物饲料的中华黑白凤乌骨鸡、贵妃鸡、珍珠鸡、鹌鹑或大雁等的蛋类产品。
蛋清指位于鸡蛋蛋壳内膜和蛋黄膜之间的半流动胶体物质。
溶菌酶(Lysozyme)是一种专门作用于微生物细胞壁的糖苷水解酶，广泛地存在于高等动物组织及分泌物、植物及各种微生物中，以在新鲜的鸡蛋清中含量最高。
溶菌酶通过溶解G+菌的细胞壁使细菌溶解，菌液在可见光范围内的吸光度降低。酶的活力表示为在特定条件下单位时间内转化底物的速度。根据该原理，以溶壁微球菌为底物，用比浊法，以一定波长处菌液单位时间内吸光度降低程度为依据，测定溶菌酶的活力。
GBT 25879-2010提供了一种普适的检测鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力的方法，该方法中在测定酶活力时采用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，经测定，在该缓冲液浓度下会抑制高原特种养殖珍禽蛋蛋清中的溶菌酶酶活力，导致测出的酶活力数值偏低，影响准确性。
本发明方法采用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，测定体系磷酸盐缓冲液浓度为0.05-0.08mol/L，pH为6.0-6.5。
磷酸盐缓冲液的浓度典型但非限制性的例如为0.05mol/L、0.06mol/L、0.07mol/L或0.08mol/L。
磷酸盐缓冲液的pH例如为6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。
本发明方法在445-455nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值。吸光度降低值与酶活力呈正比，结合酶浓度计算酶活力。
例如在445nm下测定菌液单位时间内吸光度降低值或在450nm下测定菌液单位时间内吸光度降低值或在455nm下测定菌液单位时间内吸光度降低值，优选450nm。
本发明采用0.05-0.08mol/L浓度较低的磷酸盐体系能够减缓盐浓度过高对酶活性造成的影响，缓解了采用现有国标方法条件测出的溶菌酶活力结果不准确，存在较大误差的缺陷。采用本发明方法测得的溶菌酶活力结果更加精准，更接近于真实值，准确度高，且针对性强，适合对高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的测定。方法重复性好，在相同条件下获得的三次独立测试结果的变异系数≤5％。本发明方法操作简单、耗时短、针对性强，适于实际应用，检测结果准确度高。
在一种优选的实施方式中，采用0.06-0.08mol/L pH＝6.0-6.2的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液。
在一种进一步优选的实施方式中，采用1/15-1/14mol/L pH＝6.0-6.2的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液。
通过对磷酸盐缓冲液的浓度及pH进行进一步优化，能够保证检测体系对酶活力的影响最小，体系稳定性好，酶活力检测的准确度更好。
在一种优选的实施方式中，在448-452nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，优选在450nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值。
通过选择菌液的最大吸收波长，灵敏度最高，在此区域内波长偏差Δλ对应的吸光度偏差ΔA比其他区域小，可以减小实验误差。
在酶活测定时，应控制待测样品中溶菌酶的含量，将溶菌酶浓度控制在100-200μg/mL区间内，可保证酶活力测定结果的准确性。
在一种优选的实施方式中，待测珍禽蛋蛋清样品用磷酸盐缓冲液稀释200-400倍，优选稀释200-300倍，进一步优选稀释250-300倍。
待测样品用磷酸盐缓冲液稀释倍数例如为200倍、300倍或400倍。
由于来源于高原特种养殖的珍禽蛋中的溶菌酶含量更高，采用国标方法中的稀释倍数测出的含量和活力数值会超出线性范围，偏差较大，通过采用合适的稀释倍数能够保证测出的溶菌酶含量和活力不超过线性范围，稀释倍数过少或过多会造成测出的结果不准确。
在一种优选的实施方式中，将待测珍禽蛋蛋清样品溶液加入酶促反应体系前将溶壁微球菌菌液在445-455nm波长下的吸光度值调至0.45-0.77，优选0.55-0.75，进一步优选0.65-0.75。
将菌液吸光度值调至0.45-0.77，例如0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75或0.77。
试验发现，菌液的吸光度值在0.45～0.77(OD450)之间时具有良好的线性关系，用于酶活测定较为合适，测定结果更加准确。
优选地，一种典型的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，包括以下步骤：
(a)配制溶壁微球菌菌液：将溶壁微球菌于液体LB培养基中，37-38℃培养9-10h至菌体繁殖，将培养液离心，收集沉淀菌体，加入甘油溶液置-60℃保存；使用前，用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌，得到溶壁微球菌菌液，并将菌液调至OD450吸光度值至0.70±0.05，4℃放置备用；
(b)配制试样溶液：取待测珍禽蛋蛋清样品用3-5层纱布过滤，取过滤试样，用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液稀释200-300倍，得到试样溶液；
(c)试样测定：在25℃下，先测定试样溶液中溶菌酶浓度，再用比浊法，以溶壁微球菌菌液为底物，将试样溶液加入酶促反应体系，在450nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，根据试样溶液中溶菌酶浓度，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位计算溶菌酶活力。
优选地，步骤(c)包括以下步骤：测定试样溶液中溶菌酶浓度c，用比浊法，以磷酸盐缓冲液为空白液调零，将菌液置于1cm比色池中，每3mL菌液加入0.15mL试样溶液，从加入试样溶液开始计时，记录在450nm波长处反应间隔60s时间点的读数A1、A2，根据试样溶液中溶菌酶浓度c，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位，试样中溶菌酶活力按公式(1)计算：
式中：
EA——溶菌酶活力，U/mg；
△E450——在两时间点测定的吸光度A1、A2之差；
c——试样溶液中溶菌酶的浓度，μg/mL。
步骤(c)中试样溶液中溶菌酶浓度的测定可以采用常规方法。
优选地，步骤(c)中测定试样溶液中溶菌酶浓度包括以下步骤：
(A)溶菌酶标准品溶液的配制：取适量溶菌酶干品，用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至浓度为300-600μg/mL；
(B)建立溶菌酶标准曲线：用所述磷酸盐缓冲液将溶菌酶标准品溶液稀释成不同浓度梯度，通过紫外分光光度法在281nm波长处测定吸光度值，建立溶菌酶标准曲线；
(C)测定试样溶液中溶菌酶浓度：将试样溶液按照与标准品相同的分析方式测定试样溶液的吸光度值，根据所述吸光度值由标准曲线计算试样溶液中溶菌酶含量。
优选地，步骤(A)和(B)具体包括以下步骤：
(A)配制溶菌酶标准品溶液：称取溶菌酶标准品，用上述磷酸盐缓冲液溶解成400-500μg/mL的溶菌酶标准品溶液，于4-6℃密封保存备用；
(B)建立溶菌酶标准曲线：采用上述磷酸盐缓冲液将溶菌酶标准品溶液分别稀释20倍、10倍、20/3倍、5倍、4倍和10/3倍，得到不同浓度梯度工作液，以磷酸盐缓冲液为参比液，通过紫外分光光度法在281nm波长处测定吸光度值，以工作液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出标准曲线回归方程。
步骤(B)将试样溶液按照绘制标准曲线的操作步骤，在波长281nm处测定试样溶液吸光度值，平行测定三次，取结果的算术平均值，由标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度。
优选地，控制待测珍禽蛋蛋清样品溶液(试样溶液)中溶菌酶浓度为100-200μg/mL。
在一种优选的实施方式中，磷酸盐缓冲液的配制包括以下步骤：
每15-25mL的1/15-1/14mol/L Na2HPO4溶液与75-85mL的1/15-1/14mol/L NaH2PO4溶液混合。
采用的Na2HPO4溶液的浓度例如为1/15mol/L或1/14mol/L，混合配制时Na2HPO4溶液的体积例如为15mL、20mL或25mL。
采用的NaH2PO4溶液的浓度例如为1/15mol/L或1/14mol/L，混合配制时NaH2PO4溶液的体积对应例如为85mL、80mL或75mL。
例如1/15mol/L pH＝6.2的磷酸盐缓冲液的配制过程如下：称取十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)23.88g，用蒸馏水溶解定容至1000mL；称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)10.40g，蒸馏水溶解定容至1000mL，取Na2HPO4溶液20mL与NaH2PO4溶液80mL混合，即得1/15mol/L pH为6.2的磷酸盐缓冲液。
在一种优选的实施方式中，步骤(a)中甘油溶液为灭菌的质量百分比为15-25％的甘油溶液。
甘油溶液的质量百分比为15-25％，例如15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％，配制后对甘油溶液灭菌。
例如20％的甘油溶液的配制过程如下：称取甘油20.0g，溶解于蒸馏水中，定容至100mL，121℃高压灭菌30min。
在一种优选的实施方式中，步骤(a)中液体LB培养基中包含质量百分比0.8-1.2％的蛋白胨、0.4-0.6％的酵母提取物和0.8-1.2％的氯化钠；液体LB培养基的pH为7.2-7.4。
优选地，液体LB培养基的配制过程如下：
将蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g和氯化钠1.0g溶解于100mL水中，用1mol/l氢氧化钠调整pH至7.2～7.4，分装在试管里，121℃高压蒸汽灭菌30min。
在制备菌液的过程中，优选将溶壁微球菌于液体LB培养基中，37℃摇床培养至菌体繁殖，培养9-10h，将培养液离心，收集沉淀菌体，加入3倍体积灭菌的0.9％氯化钠溶液悬浮，离心，收集沉淀的菌体，重复3次，再加入20％甘油溶液，置于-60℃保存，半年内使用。
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例及对比例作进一步详细的说明。
所用的仪器如下：
紫外可见分光光度计；
电子分析天平(感量0.1mg，1mg)；
摇床(控温范围0℃～100℃，转速振幅：0r/min～300r/min)；
pH计(精密度±0.01)；
离心机(最大离心力2325g)；
高压灭菌锅；
超低温冰箱。
实施例1
一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，包括以下步骤：
(1)试剂配制
20％甘油溶液：称取甘油20.0g，溶解于蒸馏水中，定容至100mL，121℃高压灭菌30min。
1/15mol/L pH＝6.2的磷酸盐缓冲液：称取十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)23.88g，用蒸馏水溶解定容至1000mL；称取二水磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)10.40g，蒸馏水溶解定容至1000mL，取Na2HPO4溶液20mL与NaH2PO4溶液80mL混合，即得1/15mol/L pH为6.2的磷酸盐缓冲液。
液体LB培养基：蛋白胨1.0g，酵母提取物0.5g，氯化钠1.0g溶解于100mL水中，用1mol/L氢氧化钠调整pH至7.2～7.4，分装在试管里，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)分析步骤
1)菌液的制备
将溶壁微球菌于液体LB培养基中，37℃摇床培养至菌体繁殖，培养9-10h，将培养液1310g离心10min，收集沉淀菌体，加入3倍体积灭菌的0.9％氯化钠溶液悬浮，1310g离心10min，收集沉淀的菌体，重复3次，再加入20％甘油溶液，置于-60℃保存，半年内使用。
使用前，用磷酸盐缓冲液溶解溶壁微球菌，调至OD450吸光度值至0.70±0.05，4℃放置。
2)样液的配制
珍禽蛋蛋清溶液的制备：珍禽蛋蛋清用4层纱布过滤，取过滤试样1mL，用磷酸盐缓冲液稀释定容至250mL，混匀。
溶菌酶标准品溶液的配制：取适量溶菌酶干品，用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为400～500μg/mL。
(3)试样测定
珍禽蛋蛋清溶液溶菌酶酶活测定：
在281nm波长处测定鸡蛋清溶液的吸光度，根据溶菌酶标准曲线计算蛋清溶液中的溶菌酶浓度c。鸡蛋清溶液和菌液于25℃水浴中保温，在450nm波长处测定酶活力，试样测定体系见表1。
表1试样测定反应体系
加入物 测定液/mL 空白液/mL
菌液 3.0 0.0
蛋清溶液 0.15 0.0
磷酸盐缓冲液 0.0 3.15
用磷酸盐缓冲液空白液调零，精密量取25±0.1℃的底物悬浮液(菌液)3mL，置1cm比色池中，从加入0.15mL蛋清溶液开始计时，记录在450nm波长处反应15s和75s时的读数为A1、A2。按每分钟OD450值下降0.001为一个活力单位(U)的定义，蛋清中溶菌酶的活力按公式(1)计算：
式中：
EA—溶菌酶活力，U/mg；
△E450—在两时间点测定的吸光度A1、A2之差；
c—试样溶液中溶菌酶的浓度，μg/mL。
实施例2
一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，包括以下步骤：
(1)试剂配制
20％甘油溶液：同实施例1。
1/15mol/L pH＝6.0的磷酸盐缓冲液：称取十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)23.88g，用蒸馏水溶解定容至1000mL；称取二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)10.40g，蒸馏水溶解定容至1000mL，取Na2HPO4溶液12.3mL与NaH2PO4溶液87.7mL混合，即得1/15mol/L pH为6.0的磷酸盐缓冲液。
液体LB培养基：同实施例1。
(2)分析步骤
1)菌液的制备
同实施例1。
2)样液的配制
同实施例1。
(3)试样测定
同实施例1。
对比例
一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，将实施例1所使用的1/15mol/L pH＝6.2的磷酸盐缓冲液，调换为0.2mol/L pH＝6.2的磷酸盐缓冲液，其余与实施例1相同。
试验例1不同浓度的磷酸盐缓冲液对珍禽蛋蛋清溶液中溶菌酶活力的影响
采用同一浓度的珍禽蛋蛋清溶液作为试样溶液，考察酶活力测定体系中不同浓度磷酸盐缓冲液对溶菌酶活力测定的影响。试验方法如下：
将两份同一浓度的珍禽蛋蛋清溶液作为试样溶液，分别采用实施例1和对比例的方法对两份珍禽蛋蛋清试样溶液的酶活力进行测定，测定时将试样溶液和菌液于25℃水浴中保温，在450nm波长处测定酶活力，用磷酸盐缓冲液空白液调零，精密量取25±0.1℃的底物悬浮液(菌液)3mL，置1cm比色池中，从加入0.15mL试样溶液开始计时，记录在450nm波长处反应15s和75s时的读数为A1、A2。按每分钟OD450值下降0.001为一个活力单位(U)的定义，试样溶液中溶菌酶活力按公式(1)计算，结果如图1所示。
由图1可见，采用0.2mol/L磷酸盐缓冲液测得的酶活明显低于采用1/15mol/L的磷酸盐缓冲液测得的酶活，说明盐浓度过高会抑制酶活，造成检测结果不准确。本发明采用较低浓度的磷酸盐缓冲液体系能够减缓盐浓度过高对酶活性造成的影响，在此体系下进行酶活测定使得测得的溶菌酶活力结果更加精准，更接近于真实值，准确度更高。
试验例2不同浓度的珍禽蛋蛋清溶液对溶菌酶活力的影响
在相同浓度缓冲液中，进一步考察珍禽蛋蛋清溶液浓度对酶活力测定结果的影响，考察100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL三个不同配制浓度的珍禽蛋蛋清溶液对溶菌酶测定结果的影响。试验方法如下：
1、将三份不同浓度(100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)的珍禽蛋蛋清溶液作为试样溶液，采用实施例1的方法对三份珍禽蛋蛋清溶液的酶活力进行测定；
2、将三份不同浓度(100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)的珍禽蛋蛋清溶液作为试样溶液，采用对比例1的方法对三份珍禽蛋蛋清溶液的酶活力进行测定。
测定时将试样溶液和菌液于25℃水浴中保温，在450nm波长处测定酶活力，用磷酸盐缓冲液空白液调零，精密量取25±0.1℃的底物悬浮液(菌液)3mL，置1cm比色池中，从加入0.15mL试样溶液开始计时，记录在450nm波长处反应15s和75s时的读数为A1、A2。按每分钟OD450值下降0.001为一个活力单位(U)的定义，试样溶液中溶菌酶活力按公式(1)计算，结果如图2所示。
由图2可见，100-200μg/mL范围内，随着珍禽蛋蛋清溶液浓度的增加，溶菌酶活力测定结果反而降低。通常，在底物足够，其它条件固定的条件下，反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其它不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速度与酶浓度成正比，高浓度溶菌酶溶液具有较高的反应速度。溶菌酶作用于底物时，底物浓度的降低与时间呈非线性关系，曲线趋向于凹曲线，当加入溶菌酶溶液后，高浓度溶菌酶酶促反应速度快，在计时开始时，底物浓度已极大降低，随着底物浓度的降低，酶促反应速率也随之降低，故高浓度溶菌酶溶液中酶活测定得到结果反而较低。因此，在酶活测定时，应控制待测样品中溶菌酶的含量，能进一步保证酶活力测定结果的准确性。
试验例3方法重复性试验
以青海绿杰特种养殖种植有限公司养殖的珍禽鸡蛋为对象，分别采用实施例1和实施例2的方法对珍禽蛋蛋清中的溶菌酶活力进行检测。
结果显示，采用实施例1方法在相同条件下对同一样品溶液重复独立测定3次，测试结果的变异系数为4.3％。采用实施例2方法在相同条件下对同一样品溶液重复独立测定3次，测试结果的变异系数为8.2％。
由此可见，本发明方法重复性好，在相同条件下获得的三次独立测试结果的变异系数≤5％。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
酶促反应以溶壁微球菌菌液为底物，用比浊法，将待测珍禽蛋蛋清样品溶液加入酶促反应体系，在445-455nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，根据待测珍禽蛋蛋清样品溶液中溶菌酶浓度，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位计算溶菌酶活力；
其中，采用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液。
2.按照权利要求1所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，采用0.06-0.08mol/L pH＝6.0-6.2的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液；
优选地，采用1/15-1/14mol/L pH＝6.0-6.2的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌和待测珍禽蛋蛋清样品，得到菌液和珍禽蛋蛋清样品溶液。
3.按照权利要求1所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，在448-452nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，优选在450nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值。
4.按照权利要求1-3任一项所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，
待测珍禽蛋蛋清样品溶液中溶菌酶浓度为100-200μg/mL；
待测珍禽蛋蛋清样品用所述磷酸盐缓冲液稀释200-400倍，优选稀释200-300倍，进一步优选稀释250-300倍。
5.按照权利要求1-3任一项所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，将待测珍禽蛋蛋清样品溶液加入酶促反应体系前将溶壁微球菌菌液在445-455nm波长下的吸光度值调至0.45-0.77，优选0.55-0.75，进一步优选0.65-0.75。
6.按照权利要求1-3任一项所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)配制溶壁微球菌菌液：将溶壁微球菌于液体LB培养基中，37-38℃培养9-10h至菌体繁殖，将培养液离心，收集沉淀菌体，加入甘油溶液保存；使用前，用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解和/或稀释溶壁微球菌，得到溶壁微球菌菌液，并将菌液调至OD450吸光度值至0.70±0.05，备用；
(b)配制试样溶液：取待测珍禽蛋蛋清样品用3-5层纱布过滤，取过滤试样，用0.05-0.08mol/L pH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液稀释200-300倍，得到试样溶液；
(c)试样测定：先在281nm波长处测定试样溶液中溶菌酶浓度，再用比浊法，以溶壁微球菌菌液为底物，将试样溶液加入酶促反应体系，在450nm波长下测定菌液单位时间内吸光度降低值，根据试样溶液中溶菌酶浓度，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位计算溶菌酶活力。
7.按照权利要求6所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，步骤(c)包括以下步骤：先测定试样溶液中溶菌酶浓度c，再用比浊法，以所述磷酸盐缓冲液为空白液调零，将菌液置于1cm比色池中，每3mL菌液加入0.15mL试样溶液，从加入试样溶液开始计时，记录在450nm波长处反应间隔60s时间点的读数A1、A2，根据试样溶液中溶菌酶浓度c，按每分钟吸光度降低值下降0.001为一个活力单位，试样中溶菌酶活力按公式(1)计算：
式中：
EA——溶菌酶活力，U/mg；
△E450——在两时间点测定的吸光度A1、A2之差；
c——试样溶液中溶菌酶的浓度，μg/mL。
8.按照权利要求6所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，步骤(c)中测定试样溶液中溶菌酶浓度包括以下步骤：
(A)溶菌酶标准品溶液的配制：取适量溶菌酶干品，用0.05-0.08mol/LpH＝6.0-6.5的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至浓度为300-600μg/mL；
(B)建立溶菌酶标准曲线：用所述磷酸盐缓冲液将溶菌酶标准品溶液稀释成不同浓度梯度，通过紫外分光光度法在281nm波长处测定吸光度值，建立溶菌酶标准曲线；
(C)测定试样溶液中溶菌酶浓度：将试样溶液按照与标准品相同的分析方式测定试样溶液的吸光度值，根据所述吸光度值由标准曲线计算试样溶液中溶菌酶含量。
9.按照权利要求1-3任一项所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液的配制包括以下步骤：
每15-25mL的1/15-1/14mol/L Na2HPO4溶液与75-85mL的1/15-1/14mol/L NaH2PO4溶液混合。
10.按照权利要求6所述的高原特种养殖珍禽蛋蛋清中溶菌酶活力的检测方法，其特征在于，步骤(a)中甘油溶液为灭菌的质量百分比为15-25％的甘油溶液；
优选地，步骤(a)中液体LB培养基中包含质量百分比0.8-1.2％的蛋白胨、0.4-0.6％的酵母提取物和0.8-1.2％的氯化钠；液体LB培养基的pH为7.2-7.4。
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