CN106389406B - 一种降糖作用化合物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了丁香亭在制备降糖组合物上的用途，丁香亭能够降低血糖，能用于糖尿病的治疗及预防。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及天然药物降糖领域，尤其涉及抑制α-葡萄糖苷酶作用及促进脂肪细胞葡萄糖吸收的化合物及用途。
背景技术
糖尿病是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合征，系因胰岛素分泌不足或胰岛素作用受损引起机体糖、脂肪、蛋白质、水和电解质等一系列代谢紊乱，临床以高血糖为主要标志。其表现为血液及尿液中葡萄糖浓度异常升高，血糖、尿糖过高时可出现典型的三高一少症状。久病可引起多系统损害，病情严重或应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。
由于α-葡萄糖苷酶抑制剂可与α-葡萄糖苷酶上的碳水化合物的结合点相结合，其亲和力远大于酶的正常底物，因此，当与膳食一起进食后，α-葡萄糖苷酶抑制剂可与小肠上皮细胞刷缘处的寡糖相竞争，占据α-葡萄糖苷酶上寡糖结合位点，使寡糖吸收受阻，减少寡糖在小肠上部的消化，未被消化的碳水化合物被运送至小肠中下段及结肠，导致碳水化合物的消化吸收发生在整个小肠中，延缓和延长了餐后葡萄糖的吸收，从而降低餐后血糖增高。
目前已经被批准为临床治糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要有3种：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，他们都是含氮的生物碱。它们通过减少餐后血糖浓度从而减少蛋白糖基化，延迟或阻止肾、视网膜神经病变发生以及缺血性心肌病的发展。文献报道主要α-葡萄糖苷酶抑制剂有多糖、生物碱、苷类、多肽、糖苷类、黄酮类、皂苷和酚类等。
发明内容
本发明提供丁香亭在制备降糖组合物中的用途，
本发明提供丁香亭制备抑制α-葡萄糖苷酶的组合物中的用途。
本发明提供丁香亭在制备抑制α-葡萄糖苷酶的降糖组合物中的用途。
本发明提供丁香亭在制备抑制α-葡萄糖苷酶的降糖组合物中的用途，其用量范围是1-625-200μM。
本发明提供丁香亭制备促进脂肪细胞葡萄糖吸收的组合物中的用途。
本发明提供丁香亭在制备促进脂肪细胞葡萄糖吸收的降糖组合物中的用途。
本发明提供丁香亭在制备促进脂肪细胞葡萄糖吸收的降糖组合物中的用途，其用量范围是1-20μM。
本发明提供丁香亭在制备抑制和促进脂肪细胞葡萄糖吸收的降糖组合物中的用途。
本发明提供丁香亭在制备降糖组合物中的用途，其制药剂型是：片剂、胶囊剂、注射剂、冻干注射剂。
药效学实验证明，本发明的化合物及其组合物对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用、促进脂肪细胞葡萄糖吸收作用。其中α-葡萄糖苷酶可以是来源于人、酵母、大米、芽胞杆菌的α-葡萄糖苷酶。
本发明提供的化合物及其组合物具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制作用和促进脂肪细胞葡萄糖吸收作用，具有避免现有降糖药物不良反应的潜力，为其应用提供了新的途径。
试验例1
丁香亭的α-葡萄糖苷酶活性测试
4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitropHenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG)是麦芽糖类似物。以pNPG为底物测定中草药提取物或降糖活性成分对α-葡萄糖苷酶抑制活性大小，从中草药中筛选强活性降糖活性因子是目前最常用、最经典的筛选方法。α-葡萄糖苷酶加入酶反应底物(pNPG)后，底物被酶催化分解为对硝基苯酚(PNP)和葡萄糖，PNP是一种有色物质，在400nm左右有最大吸收，可以用酶标仪测定。
由于产物的量与样品中被测物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅测得不同的OD值，由此得出样品的抑制活性。通过对不同浓度抑制剂和相应抑制率作回归方程，可得半数抑制浓度(IC50)。
试剂与耗材：
α-葡萄糖苷酶(美国Sigma公司)、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(美国Sigma公司)、DMSO(美国Sigma公司)、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O(江苏南京化学试剂有限公司)、96孔板(美国Coming公司)
仪器：
BioTek多功能酶标仪、KH-500DB型数控超声波清洗器、SPX智能型生化培养箱、Thermo十二通道移液器
缓冲液配制：
磷酸盐缓冲液(PBS)
取NaH2PO4·2H2O 3.978g，Na2HPO4·12H2O 8.771g，用1000ml蒸馏水定容，即得pH＝6.8，0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)。
用酶标仪进行凝血酶抑制活性测试的一般步骤如下：于96孔板中依次加入50μL磷酸盐缓冲液(0.05mol/L)，40μLα-葡萄糖苷酶溶液(3.0U/ml)和10μL不同浓度的样品溶液，在37℃条件下孵育半小时。然后加入100μL pNPG溶液(1.0mM)，再次反应半小时后再405nm下测定反应混合物随时间变化的吸光度值。每组实验均重复3次，IC50值取其平均值。取阿卡波糖做为阳性对照。
α-葡萄糖苷酶可以是来源于人、酵母、大米、芽胞杆菌的α-葡萄糖苷酶。
抑制率(％)＝(Acontrol-Asample)/Acontrol×100
本实验采取阿卡波糖为阳性对照，测得IC50值为93.91μM，如表1所示，2009年，LiYQ等用pNPG为底物体外筛选α-葡萄糖苷酶活性，测得阿卡波糖抑制率为91μM，实验结果与文献报道相近(Li YQ et al，J Agric Food Chem.2009；57(24)：11463-8.)，证明测试体系可靠。
表1：阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
| 浓度(μM) | 抑制率(％) | SD |
| 6.25 | 6.504505 | 3.562524 |
| 12.5 | 14.99099 | 4.07278 |
| 31.25 | 26.03119 | 1.221194 |
| 62.5 | 43.96436 | 2.123262 |
| 125 | 58.46296 | 1.066958 |
| 250 | 68.93452 | 0.424652 |
| 500 | 79.50993 | 1.831187 |
| 1000 | 86.23113 | 0.92715 |
本实验称取丁香亭粉末溶于二甲基亚砜中，制成200mM的母液贮存，使用时稀释1000倍，至终浓度为200μM，再依次稀释至终浓度100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.625μM，测定α-葡萄糖苷酶抑制率。
表2：丁香亭对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
| 浓度(μM) | 抑制率(％) | SD |
| 1.625 | 5.292434 | 3.28735 |
| 3.125 | 1.90593 | 0.844875 |
| 6.25 | 5.783231 | 2.200576 |
| 12.5 | 8.368098 | 1.194162 |
| 25 | 25.54601 | 2.469643 |
| 50 | 68.04908 | 4.024041 |
| 100 | 96.86503 | 3.920237 |
| 200 | 98.32808 | 2.320103 |
数据处理使用GrapHPad Prism 6.02软件。丁香亭对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线见图1，IC50为36.81μM。
附图说明
图1：丁香亭的IC50曲线图。
图2：丁香亭能促进正常脂肪细胞对葡萄糖的吸收利用
图1的坐标的具体解释
图1的横坐标的中文含义：丁香亭的浓度(μM)的对数值
图1的纵坐标的中文含义：丁香亭的抑制百分数，单位(％)
图2的坐标的具体解释
图2的横坐标的中文含义：给药浓度(μM)
图2的纵坐标的中文含义：葡萄糖的吸收量(mM)
试验例2
脂肪组织、肝脏、骨骼肌是利用葡萄糖的主要组织，脂肪细胞对葡萄糖的吸收利用可有效降低血液中的葡萄糖，脂肪细胞对葡萄糖的吸收能力是衡量药物降糖作用的重要指标。本实验以二甲双胍作为阳性药，验证丁香亭能促进正常脂肪细胞对葡萄糖的吸收利用。
试剂与耗材：
二甲双胍、HEPES、地塞米松、胰岛素(美国Sigma公司)、牛血清白蛋白(BSA)(美国罗氏制药有限公司)DMEM培养基(美国Gibco公司)、葡萄糖、NaCl、KCl、CaCl2、KH2PO4、MgSO4·7H2O(国药集团化学试剂有限公司)。
仪器：
thermo二氧化碳培养箱、BioTek多功能酶标仪、SPX智能型生化培养箱
缓冲液配制：
KRHB缓冲液：
Krebs-Ringer pHospHate-HEPES buffer：NaCl 118mmol/L，KCl 5mmol/L，CaCl21.3mmol/L，KH2PO41.2mmol/L，MgSO4·7H2O 1.2mmol/L，HEPES 30mmol/L and 0.5％BSA，pH 7.4。
细胞株3T3-L1，前脂肪细胞，中国科学院上海生命科学院细胞库。
3T3-L1细胞的培养、传代
1.培养条件：3T3-L1前脂肪细用含10％FBS的DMEM高糖培养基复苏传代后，接种于75mL培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中静置培养。
2.更换培养基：每1-2天以肉眼和倒置显微镜观察脂肪细胞及培养基，若有特征性变化，例如pH降低，培养基颜色发生明显改变，则要更换新鲜的培养基，再将脂肪细胞重新放入温箱中培养。
3.细胞传代：接种后3-5天后，细胞单层密集生长至80％-90％融合时，用0.25％的胰蛋白酶消化至胞质回缩、细胞间隙增大，立即倒胰酶，加入2mL的10％FBS的DMEM培养基终止消化，轻柔的吹散并收集悬浮细胞，离心、重悬、计数、均匀的接种于新培养瓶中。
3T3-L1细胞的冻存、复苏
1.细胞冻存：选用生长良好的脂肪细胞，致密度为80％-90％时冻存，在冻存前一天要更换新鲜的含10％FBS的高糖DMEM。用0.25％的胰蛋白酶把脂肪细胞消化并收集于离心管中，按浓度加入配制好的冻存液(DMEM∶FBS∶DMSO＝6∶3∶1)重悬，均匀分装入无菌冻存管中，于-70℃中冻存。
2.细胞复苏：将冻存管从-70℃低温冰箱中取出来，迅速投入37-38℃水浴中，轻摇使其在1min内快速融化。然后加入10倍体积的10％FBS的高糖DMEM培养基与之混合稀释，低速离心收集悬浮细胞。加入适当体积的用培养基稀释，置于37℃培养箱中培养，次日换液。
3T3-L1细胞的分化
细胞分化：在3T3-L1前脂肪细胞生长至细胞融合时，将10％FBS的高糖DMEM换成分化液(含0.5μM的IBMX，1M地塞米松，10μg/mL胰岛素，10％FBS的高糖DMEM培养基)培养2d，更换新鲜分化液(含10μg/mL胰岛素)再分化2d，随后以含10％FBS的高糖DMEM培养基继续培养，每2d更换一次培养基，诱导分化8～12天后，待3T3-L1细胞呈成熟脂肪细胞表形即可用于试验。
丁香亭对生理状态下脂肪细胞糖消耗的影响
选用生长状态良好且分化好的脂肪细胞，以2×105cell/孔接种于48孔培养板，待细胞生长至80％-90％融合时，换用不含糖的KRHB液培养4h，使细胞同步化。PBS轻洗两遍后，每孔加入200μLKRHB。实验分组如下：空白组，丁香亭组(0.1、1、10、20μM)和Metformin(1mM)温育30min后，加入葡萄糖(终浓度为11mM)于37℃继续孵育4h。孵育4h后，用葡萄糖测定试剂盒测定加入葡萄糖4h后细胞上清液中剩余葡萄糖的含量，通过计算葡萄糖浓度差值即为脂肪细胞对葡萄糖的消耗量。
统计学分析
采用GrapHPad Prism-6.02统计软件(GrapHPad Software，USA)进行统计分析和图表处理。假手术与模型两组均数比较采用双尾t检验，其余各组两均数间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以Dunnett’s post-hot检验进一步检测组间显著性差异。以P＜0.05作为具有显著性差异，P＜0.001为具有非常显著性差异。
实验结果
脂肪细胞对葡萄糖的吸收利用可有效降低血液中的葡萄糖，脂肪细胞对葡萄糖的吸收能力是衡量药物降糖作用的重要指标。由图2及表3可知，阳性药二甲双胍可显著促进脂肪细胞的葡萄糖吸收(P＜0.001)，说明模型稳定可靠。由图2和表3可知，丁香亭在1μM、10μM、20μM时可剂量依耐性地促进脂肪细胞对葡萄糖的吸收，与空白对照组比具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.001)。说明丁香亭在1-20μM时能促进脂肪细胞对葡萄糖的吸收，有很好的降糖作用。
表3：丁香亭促进脂肪细胞对葡萄糖的吸收
具体实施方式
实施例1
一种含有丁香亭的溶液：丁香亭2.0g，亚硫酸钠4.0g，聚维酮10.0g，乙醇50ml，加水定容只1000mL；制备工艺：将丁香亭分散在乙醇中，亚硫酸钠溶于水中，在超声或搅拌条件下将拿硫酸钠溶液逐渐加入丁香亭中，使成澄清透明溶液；加聚维酮，搅拌使溶剂，补加水定容至足量；经0.22μM微孔滤膜过滤，分装封口。
实施例2
一种含有丁香亭的溶液：丁香亭1.0g，烟酰胺2.0g，乙醇200ml，加水定容至1000ml；制备工艺：将丁香亭和烟酰胺溶于乙醇中，在超声或搅拌下逐渐加入注射用水混匀使成澄清透明溶液；经0.22μM微孔滤膜过滤，分装封口。
实施例3
一种含有丁香亭的冻干粉：丁香亭2.0g，亚硫酸钠4.0g，聚维酮10.0g，乙醇50ml，加水定容只1000mL；制备工艺：将丁香亭分散在乙醇中，亚硫酸钠溶于水中，在超声或搅拌条件下将拿硫酸钠溶液逐渐加入丁香亭中，使成澄清透明溶液；加聚维酮，搅拌使溶剂，补加水定容至足量；经0.22μM微孔滤膜过滤，冷冻干燥得到。
实施例4
一种含有丁香亭的冻干粉：丁香亭1.0g，烟酰胺2.0g，乙醇200ml，加水定容至1000ml；制备工艺：将丁香亭和烟酰胺溶于乙醇中，在超声或搅拌下逐渐加入注射用水混匀使成澄清透明溶液；经0.22μM微孔滤膜过滤，冷冻干燥得到。
实施例5
一种含有丁香亭的片剂：丁香亭20mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g；制备工艺：取丁香亭，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。
实施例6
一种含有丁香亭的胶囊：丁香亭20mg，淀粉88g，硬脂酸镁2g；制备工艺：取丁香亭，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，装胶囊，即得。
实施例7：
一种含有丁香亭的软胶囊：丁香亭20mg，大豆卵磷脂100g；制备工艺：取丁香亭，加大豆软磷脂，胶体磨混匀，抽真空，压制，即得软胶囊。
除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (3)
1.丁香亭用作α-葡萄糖苷酶抑制剂的医药用途。
2.丁香亭在制备促进脂肪细胞吸收葡萄糖的药物中的应用。
3.丁香亭在制备降糖药物中的应用。
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| 菝葜降血糖活性成分及对相关酶的抑制作用;沈忠明等;《中药材》;20081130;第31卷(第11期);第1717-1720页 |
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