CN105372428B - 糖链抗原125的定量检测试剂盒 - Google Patents

糖链抗原125的定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于医疗检测领域，具体涉及一种CA125的定量检测试剂盒，其由以下成分组成CA125单克隆抗体包被微孔反应板、CA125校准品、CA125质控品、酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B。

Description

糖链抗原125的定量检测试剂盒
技术领域
本发明属于医疗检测领域，具体涉及糖链抗原125的定量检测试剂盒。
背景技术
糖链多肽抗原125(CA125)，又称糖类抗原125、癌抗原125，其是一种糖类肿瘤相关抗原，是一种大分子的多聚糖，主要存在于上皮性卵巢癌组织和病人血液中。糖链多肽抗原检测主要用于辅助诊断恶性浆液性卵巢癌、卵巢上皮癌，糖链多肽抗原125与卵巢癌患者的病变大小密切相关。同时也是手术切除、化疗后疗效观察和判断有无复发的指标。
CA125是上皮性卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、肺癌等多种癌症的肿瘤标志物。其Cutoff值一般为35KU/L，卵巢癌、肺癌、子宫颈癌等患者该指标明显明显升高，但因目前为止尚未发现100％特异性和100％灵敏度的肿瘤标志物，肿瘤与肿瘤标志物之间不是一一对应关系，而只是相关性，因此不能仅仅从该指标阳性就确诊是否是癌症，需要紧密结合临床及其他检查手段综合判断。另外，也有假阳性存在，如某些妊娠期前三个月、行经期、子宫内膜异位、子宫纤维变性、急性输卵管炎、肝病、胸腹膜感染、心包感染等患者该指标也会呈阳性。
利用CA125还可以判断残存肿瘤情况，CA125估计再手术的敏感性为50％，特异性为96％。第一个化疗期后，CA125水平可提示疾病的预后，如能降至原来水平的1/10，表明病情转归良好；三个化疗周期后，CA125水平持续升高预后较差。CA125预测肿瘤复发、转移的精确度为75％。从CA125升高到出现临床症状有3～4个月。80％～90％病例中，CA125与疾病的预后和转轨有关。
专利CN200910201292以及专利201310582689分别公开了CA125相关的化学发光检测试剂盒，虽然专利声称上述试剂盒具有较高的稳定性以及灵敏度，但是其试剂盒中的试剂组分不是十分明确，并且在实际应用中，稳定性不佳。
发明内容
本发明的第一方面是提供一种CA125的定量检测试剂盒，其由以下成分组成CA125单克隆抗体包被微孔反应板、CA125校准品、CA125质控品、酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B。
所述的校准品为不同浓度的CA125标准品溶液，其分别含有5、15、50、100、300和600U/ml的CA125标准品的15mmol/l PBS缓冲液(pH7.4)，并且每升标准品溶液中含有1g酪蛋白和2g明胶。
CA125质控品的制备：用含有1g/L酪蛋白和2g/L明胶的15mmol/l PBS缓冲液(pH7.4)稀释CA125配制质控品1和2；CA125浓度分别为31.2U/ml和120.6U/ml。
所述的酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)标记的CA125抗体溶液为含1μg/ml的辣根过氧化物酶标记的CA125单克隆抗体，含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mL PEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液。
所述的浓缩洗涤液为含有吐温20的20％NaCl溶液，吐温20含量为0.1％。
所述的发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。
本发明的第二方面是提供所述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：
(1)CA125单克隆抗体的制备：将表达CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞(保藏号为CCTCC NO：C201318)体外培养；接种细胞数2×105/ml；培养液组成为97％DMEM/F12:RPMI1640＝1:1；3％FBS；滚速0.5rpm；每隔96个小时全数换液一次，共进行两次换液，收获三次；并且细胞培养时，在培养基中加入10IU/10ml LIF(白细胞抑制因子)，2IU/10ml HCG，2IU/10ml牛胰岛素；培养上清经过过滤澄清，纯化，收集抗体即得；
(2)所述的CA125单克隆抗体包被微孔反应板的制备方法如下：
a.包被：取1mol/l Na2HPO4 77.4ml和1mol/l NaH2PO4 22.6ml混匀，加入去离子水定容至1000ml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入1mg/L的抗CA125单抗混匀，然后加入到微孔板板孔中，100μl/孔，4℃，16小时；
b.封闭：弃去包被液，在吸水纸纸上拍干，加入含有3％BSA和0.05％明胶的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，200μl/孔，37℃2小时；
c.封袋：弃去封闭液，在吸水纸上拍干，室温下于真空干燥箱中抽5小时，立即进行真空封袋，检查有无漏气，如有重新封袋，贴上标签后于2～8℃保存。
(3)酶结合物制备：
a.将10mg HRP溶于1ml蒸馏水中并加入新鲜配制的0.06mol/LNaIO41ml，混匀于4℃放置30分钟；
b.加入0.16mol/L乙二醇水溶液1ml，室温放置30分钟；
c.加入含5mg抗CA125抗体的水溶液2ml，然后于4℃下，对0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)透析过夜；
d.吸出透析袋内溶液，加入0.5ml NaBH4，4℃下放置2小时；
e.滴加等体积饱和(NH4)2SO4溶液，4℃下放置30分钟；
f.上述溶液2500rpm离心10分钟，去除上清液，沉淀用少许0.02mol/LpH7.4的PBS溶解，并于4℃下对此缓冲液透析过夜；
g.吸出透析袋内溶液，离心除去不溶物，上清液过Superose 6层析柱，用0.02mol/L pH7.4的PBS洗脱，收集第一峰，即为纯化的酶标记抗体；
h.将收集的酶标记抗体除菌过滤，再用含0.05g/mL酪蛋白和0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液溶解至抗体终浓度0.5mg/L。
(4)所述的校准品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B，按照本领域常规的溶液配制方法制备。
具体实施方式
下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1
(1)CA125单克隆抗体的制备：将表达CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞(保藏号为CCTCC NO：C201318)体外培养；接种细胞数2×105/ml；培养液组成为97％DMEM/F12:RPMI1640＝1:1；3％FBS；滚速0.5rpm；每隔96个小时全数换液一次，共进行两次换液，收获三次；并且细胞培养时，在培养基中加入10IU/10ml LIF(白细胞抑制因子)，2IU/10ml HCG，2IU/10ml牛胰岛素；培养上清经过过滤澄清，纯化，收集抗体即得；
(2)所述的CA125单克隆抗体包被微孔反应板的制备方法如下：
a.包被：取1mol/l Na2HPO4 77.4ml和1mol/l NaH2PO4 22.6ml混匀，加入去离子水定容至1000ml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入适量抗CA125单抗混匀，然后加入到微孔板板孔中，100μl/孔，4℃，16小时；
b.封闭：弃去包被液，在吸水纸纸上拍干，加入含有3％BSA和0.05％明胶的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，200μl/孔，37℃2小时；
c.封袋：弃去封闭液，在吸水纸上拍干，室温下于真空干燥箱中抽5小时，立即进行真空封袋，检查有无漏气，如有重新封袋，贴上标签后于2～8℃保存。
(3)酶结合物制备：
a,将10mg HRP溶于1ml蒸馏水中并加入新鲜配制的0.06mol/LNaIO4 1ml,混匀于4℃放置30分钟；
b，加入0.16mol/L乙二醇水溶液1ml，室温放置30分钟；
c,加入含5mg抗CA125抗体的水溶液2ml,然后于4℃下，对0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)透析过夜；
d，吸出透析袋内溶液，加入0.5ml NaBH4，4℃下放置2小时；
e，滴加等体积饱和(NH4)2SO4溶液，4℃下放置30分钟；
f，上述溶液2500rpm离心10分钟，去除上清液，沉淀用少许0.02mol/LpH7.4的PBS溶解，并于4℃下对此缓冲液透析过夜；
g,吸出透析袋内溶液，离心除去不溶物，上清液过Superose 6层析柱，用0.02mol/L pH7.4的PBS洗脱，收集第一峰，即为纯化的酶标记抗体；
h，将收集的酶标记抗体除菌过滤，再用含0.05g/mL酪蛋白和0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液溶解至抗体终浓度0.5mg/L。
(4)所述的校准品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B，按照本领域常规的溶液配制方法制备。
校准品为不同浓度的CA125标准品溶液，其分别含有5、15、50、100、300和600U/ml的CA125标准品的15mmol/l PBS缓冲液(pH7.4)，并且每升标准品溶液中含有1g酪蛋白和2g明胶。
CA125质控品的制备：用含有1g/L酪蛋白和2g/L明胶的15mmol/l PBS缓冲液(pH7.4)稀释CA125配制质控品1和2；CA125浓度分别为31.2U/ml和120.6U/ml。
浓缩洗涤液为含有吐温20的20％NaCl溶液，吐温20含量为0.1％。
发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。
实施例2试剂盒灵敏度测定
分别配制CA125标准品不同浓度的PBS缓冲液，浓度分别为0.1U/L，0.5U/L，1U/L，5U/L，10U/L，20U/L，采用实施例1制备的试剂盒进行检测，以对照缓冲液作为空白对照，并且同时使用对比例试剂盒进行同样检测，对比例为专利CN200910201292实施例1制备的化学发光检测试剂盒，具体检测方法如下：
a.向微孔板加入CA125标准品，每孔50μl，充分混匀，置37℃恒温箱孵育90分钟；
b.手工洗涤：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔、静置5秒，甩干，重复5此后拍干。或者洗板机洗涤：每孔350μl，重复4次，洗涤后拍干。
c.加入酶结合物，每孔50μl，充分混匀，置37℃恒温箱孵育60分钟。
d.重复步骤b。
e.加发光底物A、B每孔各50μl，充分混匀，立刻加入化学发光仪中检测信号值。
f.制作标准曲线：以标准品浓度的lg值为横坐标，标准品测定的OD的值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；
计算CA125标准品与空白对照的比值，当比值大于2时，说明试剂盒可以测定该浓度的CA125标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度，平行试验五次取平均值，具体结果如下：
结果表明本发明实施例1制备的试剂盒其灵敏度可以达到0.1U/L，而对比例的灵敏度为0.5U/L。并且根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归，得回归方程为y＝0.79X+0.013；R2＝0.99。
实施例3
采用HPLC方法测定实施例1步骤1(单克隆抗体制备)中纯化前上清液中以及对比试验上清液中的CA125单克隆抗体含量，而在对比试验中不加入10IU/10ml LIF(白细胞抑制因子)，2IU/10ml HCG，2IU/10ml牛胰岛素，结果表明：本发明实施例1收获的上清液中抗体含量为13.4mg/L，而对比试验上清液中抗体含量为4.4mg/L。
实施例4试剂盒稳定性考察
将实施例1制备的试剂盒在37℃分别放置1个月，按照实施例2的方法测定试剂盒的灵敏度，并对实施例1中试剂盒中校准品测定数据进行回归分析，计算R2值。
本实施例中对比例设定如下：
对比例1：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的CA125单克隆抗体溶液中不添加PEG200。
对比例2：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的抗CA125抗体溶液中PEG200替换为胎牛血清(FBS)，浓度同PEG200。
对比例3：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于标准品溶液中，含1g/L的酪蛋白和2g/L的蔗糖。
对比例4：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于标准品PBS溶液中，含2g/L的酪蛋白和4g/L的明胶。
对比例5：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于标准品PBS溶液中，含0.5g/L的酪蛋白和0.5g/L的明胶。
具体结果如下：
另外，在4℃下保存36个月后，试剂盒灵敏度及线性良好，与刚制备的试剂盒无明显差别。
实施例5
应用本发明实施例1制备的酶联免疫定量检测试剂盒的质量检测精密度：随机抽取50盒不同批次试剂盒，用同一份患者血清按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV为1.4％。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (5)

1.一种CA125的定量检测试剂盒，其由以下成分组成：CA125单克隆抗体包被微孔反应板、CA125校准品、CA125质控品、酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B；所述的校准品为不同浓度的CA125标准品溶液，其分别含有5、15、50、100、300和600U/ml的CA125标准品的15mmol/l pH7.4的PBS缓冲液，并且每升标准品溶液中含有1g酪蛋白和2g明胶。
2.根据权利要求1所述的定量免疫检测试剂盒，其特征在于，CA125质控品的制备：用含有1g/L酪蛋白和2g/L明胶的15mmol/l pH7.4的PBS缓冲液稀释CA125配制质控品1和2；CA125浓度分别为31.2U/ml和120.6U/ml。
3.根据权利要求1所述的定量免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)标记的CA125抗体溶液，所述的辣根过氧化物酶(HRP)标记的CA125抗体溶液为含0.5mg/L的辣根过氧化物酶标记的CA125单克隆抗体、0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的定量免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液为含有吐温20的20％NaCl溶液，吐温20含量为0.1％。
5.根据权利要求1所述的定量免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。
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