CN109323996A - 一种真菌检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种显色法真菌1,3‑β‑D‑葡聚糖检测试剂盒，所述试剂盒包括反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、多肽显色基质、显色液A、显色液B、多肽显色基质溶解液、显色液A溶解液以及显色液B溶解液，所述显色液A的原料选自1‑萘酚‑4‑磺酸钠、1‑萘酚‑2‑磺酸钠和1‑萘酚‑5‑磺酸钠中的一种或多种。本发明提供的试剂盒操作简便，灵敏度高，检测浓度范围广。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种检测真菌1,3-β-D-葡聚糖的试剂盒。
背景技术
随着抗生素、免疫抑制剂和皮质类固醇激素在临床的广泛使用，临床中发生深部真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的机会也越来越多，而且深部真菌感染患者的死亡率近年来仍是居高不下，原因之一就是深部真菌感染的早期诊断困难，而传统的诊断方法通常周期长，敏感性差，且组织病理学检查和深部组织培养对于危重患者并不适用。
内毒素(endotoxin)是存在于革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的脂多糖(LPS)。在临床诊断中，血浆内毒素水平的测定主要用于革兰氏阴性细菌感染的诊断、治疗效果的确定以及治疗革兰氏阴性细菌感染的预后、早期诊断等。已知内毒素为有效的热原，因此内毒素的检测在注射药物中是极为重要的。在美国，日本和其它国家的药典中已经描述了内毒素的测试方法。内毒素被认为是革兰氏阴性细菌感染休克的主要原因。
β-葡聚糖存在于天然谷物中，细菌和真菌的细胞壁中包含一组β-D-葡聚糖多糖。根据来源不同，这些葡聚糖具有显著不同的物理化学性质。通常β-葡聚糖形成具有1-3个β-糖苷键的线性骨架，但其在分子量、溶解度、粘度、分支结构和凝胶化性质方面的变化会在动物中引起多种生理作用。
β-葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，占其干燥重量的80％-90％。其中1-3-β-D葡聚糖占真菌壁成分50％以上，尤其在酵母样真菌中其含量可更高，其形式以糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状1-6-β-D葡糖糖残基作为侧链。由于1-3-β-D葡聚糖广泛存在于真菌的细胞壁中，当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，1-3-β-D葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其他体液(如尿、脑脊液，腹水，胸水等)中1-3-β-D葡聚糖含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫可迅速清除1-3-β-D葡聚糖。因此，在临床诊断中，血浆或血清中β-葡聚糖水平的测定被用于早期诊断真菌感染，并且确定治疗效果和预后。
显色法真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的检测原理为：革兰氏阴性细菌内毒素能特异性地激活鲎血细胞中G因子，被激活的酶水解显色基质释放出显色基团，显色基团与显色液在高碘酸钠存在下生成蓝色缩和物，蓝色缩合物在675nm波长处的吸光度与内毒素浓度在一定范围内成线性关系，所以通过检测该波长下经处理后的检测样本的吸光度可确定该样本中内毒素的含量。
目前市面上销售的真菌检测试剂盒大多操作繁琐，检测步骤线路长，引入干扰物的几率大，导致检测时间较长，灵敏度较差，检测浓度范围较窄。因此，亟需一种操作简单，灵敏度好，可适应各类检测浓度的真菌检测试剂盒。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种显色法真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，所述试剂盒包括反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、多肽显色基质、显色液A、显色液B、多肽显色基质溶解液、显色液A溶解液以及显色液B溶解液。
优选的，所述反应主剂以鲎血细胞为主要原料。
优选的，所述主剂复溶液包括Tris-HCl和MgCl2溶液。
优选的，所述样本处理液包括KOH和KCl的水溶液。
优选的，所述多肽显色基质的原料为Boc-Thr-Gly-Arg-DEA(N,N’-二乙基苯胺)。
优选的，所述显色液A的原料选自1-萘酚-4-磺酸钠、1-萘酚-2-磺酸钠和1-萘酚-5-磺酸钠中的一种或多种。
更优选的，所述显色液A的原料为1-萘酚-4-磺酸钠和1-萘酚-2-磺酸钠的混合物，两者的摩尔比为1:1。
优选的，所述显色液B的原料为高碘酸钠。
优选的，所述多肽显色基质溶解液、显色液A溶解液以及显色液B溶解液均为无热原水。
优选的，所述反应主剂的制备方法为：将活体鲎清洗消毒，不锈钢针采血，2000rpm离心，去除上清液，收集鲎血细胞；向收集的鲎血细胞中加入等体积的裂解液重悬细胞，-20℃冷冻过夜，解冻后即得鲎血细胞溶解物；在鲎血细胞溶解物中加入等体积的氯仿，搅拌条件下充分混合，低温6000rpm下离心15分钟得上清液；将上清液分装至西林瓶中，真空冷冻干燥，即得反应主剂。
优选的，所述主剂复溶液的制备方法为：分别称取处方量的Tris-HCl和MgCl2，添加蒸馏水至配制量，使得每ml溶液含Tris-HCl0.5mol和MgCl20.2mol，混合均匀后，用稀盐酸调pH至7.0，0.22μm滤膜过滤，分装至西林瓶，即得主剂复溶液。
优选的，所述样本处理液的制备方法为：采用蒸馏水配制0.2mol/mL KOH和1mol/mL KCl，再将已配制的两种溶液等体积混合，0.22μm滤膜过滤，分装至西林瓶，即得样本处理液。
优选的，所述多肽显色基质的制备方法为：将上述多肽显色基质原料用灭菌注射用水溶解，配成6mM浓度，使用0.22μm滤膜过滤，将滤液分装至西林瓶中，真空冷冻干燥，即得多肽显色基质。
优选的，所述显色液A的制备方法为：使用pH为8.5浓度为0.05mol/L的硼酸缓冲液将上述显色液A原料配制成6mM，分装至西林瓶中，真空冷冻干燥，即得显色液A。
优选的，所述显色液B的制备方法为：使用蒸馏水配制成质量百分比为2％的高碘酸钠溶液，分装至西林瓶中，真空冷冻干燥，即得显色液B。
优选的，所述多肽显色基质溶解液、显色液A溶解液以及显色液B溶解液的制备方法为：将处方量的无热原水装入西林瓶中，封盖，即得多肽显色基质溶解液、显色液A溶解液和显色液B溶解液。
优选的，所述试剂盒测定样本中1,3-β-D-葡聚糖的浓度范围为1-1000pg/mL，优选1-500pg/mL，最优选1-200pg/mL。
本发明提供的人体液的显色法真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的检测原理为：鲎血细胞中G因子被待检测样本中1,3-β-D-葡聚糖激活，形成活化G因子，活化G因子使凝固酶原转化为凝固酶，凝固酶酶切多肽显色基质产生游离的N,N’-二乙基苯胺(DEA)，DEA与1-萘酚-2-磺酸钠在高碘酸钠存在下生成的蓝色缩和物在675nm波长处的吸光度与待测样本中1,3-β-D-葡聚糖的含量在一定浓度范围内成线性关系，所以通过检测该波长下经处理后的检测样本的吸光度可确定该样本中1,3-β-D-葡聚糖的含量。
本发明产生的有益效果：与常规方法相比，本发明的检测方法操作简便、检测方法灵敏度高。更重要的是，在试剂盒研发过程中，发明人意外发现，当反应主剂中使用特定种类的多肽显色基质时，前述反应生成的蓝色缩合物的吸光度与待测样本中1,3-β-D-葡聚糖含量在较宽范围内均呈现线性关系，这一效果极大扩展了试剂盒的对待测样本浓度的检测范围，丰富了试剂盒的使用范围。
具体实施方式
下面结合实施例以血液中1,3-β-D-葡聚糖含量检测为例对本发明做进一步的说明。
实施例1、以1-萘酚-4-磺酸钠作为显色剂A的真菌检测试剂盒
一种显色法真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，包括如下组成部分：(1)反应主剂、(2)主剂复溶液、(3)样本处理液、(4)多肽显色基质、(5)显色液A、(6)显色液B、(7)多肽显色基质溶解液、(8)显色液A溶解液以及(9)显色液B溶解液。上述各组分的制备方法如下：
(1)反应主剂的制备
将活体鲎清洗消毒，不锈钢针采血，2000rpm离心，去除上清液，收集鲎血细胞；向20g收集的鲎血细胞中加入等体积的裂解液重悬细胞，-20℃冷冻过夜，解冻后即得鲎血细胞溶解物；在鲎血细胞溶解物中加入等体积的氯仿，搅拌条件下充分混合，低温6000rpm下离心15分钟得上清液；将上清液分装至西林瓶中，真空冷冻干燥，即得反应主剂。
(2)主剂复溶液的制备
分别称取处方量的Tris-HCl和MgCl2，添加蒸馏水至配制量，使得每ml溶液含Tris-HCl 0.5mol和MgCl20.2mol，混合均匀后，用稀盐酸调pH至7.0，过滤分装至西林瓶，即得主剂复溶液。
(3)样本处理液的制备
采用蒸馏水配制0.2mol/mL KOH和1mol/mL KCl，再将已配制的两种溶液等体积混合，过滤后分装至西林瓶，即得样本处理液。
(4)多肽显色基质的制备
将多肽显色基质原料Boc-Thr-Gly-Arg-DEA(其中DEA为N,N’-二乙基苯胺)用灭菌注射用水溶解，配成6mM浓度，使用0.22μm滤膜过滤，将滤液分装至西林瓶中，真空冷冻干燥，即得多肽显色基质。使用时，用多肽显色基质溶解液稀释至6mM使用。
(5)显色液A的制备
使用pH为8.5浓度为0.05mol/L的硼酸缓冲液将上述显色液A原料1-萘酚-4-磺酸钠配制成6mM，分装至西林瓶中，真空冷冻干燥，即得显色液A。使用时，用显色液A溶解液稀释至6mM使用。
(6)显色液B的制备
使用蒸馏水配制成质量百分比为2％的高碘酸钠溶液，分装至西林瓶中，真空冷冻干燥，即得显色液B。使用时，用显色液B溶解液稀释至高碘酸钠的质量百分比为2％使用。
(7)多肽显色基质溶解液、显色液A溶解液及显色液B溶解液的制备
将处方量的无热原水分别装入西林瓶中，封盖，即得多肽显色基质溶解液、显色液A溶解液和显色液B溶解液。
实施例2、以1-萘酚-2-磺酸钠作为显色剂A的真菌检测试剂盒
使用6mM的1-萘酚-2-磺酸钠代替6mM的1-萘酚-4-磺酸钠作为显色剂A，其余与实施例1相同。
实施例3、以1-萘酚-4-磺酸钠和1-萘酚-2-磺酸钠作为显色剂A的真菌检测试剂盒
使用1-萘酚-4-磺酸钠和1-萘酚-2-磺酸钠的混合物代替6mM的1-萘酚-4-磺酸钠作为显色剂A，混合物中1-萘酚-4-磺酸钠和1-萘酚-2-磺酸钠的浓度均为3mM，其余与实施例1相同。
试验例1、检测试剂盒的标准曲线测定
(1)标准品稀释溶液系列的配制
取1,3-β-D-葡聚糖标准品加入无热原水溶解，配制成200pg/mL，混合均匀，然后将1,3-β-D-葡聚糖标准品用无热原水梯度稀释到100pg/mL、50pg/mL、10pg/mL、5pg/mL、1pg/mL，即得标准品稀释溶液系列。另将无热原水作为阴性对照。
(2)测试样品的配制
使用实施例1中的各试剂配制测定样品，具体方法为：取试剂盒中的反应主剂0.1mL，加入0.1mL主剂复溶液复溶，充分振荡溶解。然后分别加入上述步骤配制的标准品稀释溶液系列(200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、10pg/mL、5pg/mL、1pg/mL)和阴性对照各0.1ml，40℃保温1小时，再加入0.1ml多肽显色基质，继续保温0.5小时，取出混匀后再依次加入50μl的显色剂A和0.1ml的显色剂B，充分混匀反应，室温静置10分钟，然后分别在波长675nm检测吸光度，每个样品重复测定三次，以三次测定的平均吸光度为该样品在波长675nm下检测的最终测定吸光度(y1)。
(3)标准曲线的绘制
将每个标准品浓度下样品的最终测定吸光度(y1)扣除阴性对照组的最终吸光度(y0)，即得该标准品浓度下的样品实际吸光度(y)。将各组标准品浓度值(x)与样品实际吸光度(y)进行线性回归分析，并计算标准曲线的线性系数(r)。
参照实施例1，绘制实施例2和3试剂盒的标准曲线，计算相应的线性系数。
(4)试验结果
将实施例1-3测得的试验结果汇总，具体参见表1所示。
表1不同实施例的标准曲线及其线性系数(浓度范围1-200pg/mL)
从上述表格数据可知，在待测品浓度在1-200pg/mL的范围内，三个实验组均获得较佳的线性系数，证实本发明的试剂盒满足低浓度、宽范围1,3-β-D-葡聚糖含量测定的要求。值得注意的是，使用本发明实施例3的试剂盒测得的线性系数r最佳(0.9940)，证实采用实施例3特定组成显色剂的试剂盒在极低浓度条件下，仍然可以确保含量测定的准确性，产生了出乎预料的优异效果。
试验例2、使用试剂盒测定人血浆中1,3-β-D-葡聚糖含量
(1)检测样本的采集
使用含有肝素的采血管收集人静脉血2ml，混匀后3000r/min离心10分钟，取分离后上清液血浆备用。
(2)检测样本的处理
取上述血浆上清液0.1ml，加入实施例1试剂盒中的样本处理液0.9ml，充分混匀后，70℃孵育10分钟，取出后冷却至10分钟，即得待测样本。
(3)待测样本的测定
取实施例1试剂盒中的反应主剂0.1mL，加入0.1mL主剂复溶液复溶，充分振荡溶解。然后加入上述处理后的待测样本和阴性对照(样本处理液)各0.1ml，40℃保温1小时，再加入0.1ml多肽显色基质，继续保温0.5小时，取出混匀后再依次加入50μl的显色剂A和0.1ml的显色剂B，充分混匀反应，室温静置10分钟，然后分别在波长675nm检测吸光度。将扣除阴性对照后的样本吸光度值带入试验例1绘制的标准曲线中，计算待测样本中1,3-β-D-葡聚糖的实际含量。
参照上述实施例1的方法，使用实施例2和3制备的试剂盒测定待测样本中1,3-β-D-葡聚糖的含量。
Claims (8)
1.一种显色法真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、多肽显色基质、显色液A、显色液B、多肽显色基质溶解液、显色液A溶解液以及显色液B溶解液，所述显色液A的原料选自1-萘酚-4-磺酸钠、1-萘酚-2-磺酸钠和1-萘酚-5-磺酸钠中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液A的原料为1-萘酚-4-磺酸钠和1-萘酚-2-磺酸钠的混合物，两者的摩尔比为1:1。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应主剂以鲎血细胞为主要原料。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述主剂复溶液包括Tris-HCl和MgCl2溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样本处理液包括KOH和KCl的水溶液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多肽显色基质的原料为Boc-Thr-Gly-Arg-DEA。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液B的原料为高碘酸钠。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多肽显色基质溶解液、显色液A溶解液以及显色液B溶解液均为无热原水。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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