CN112630430B - 一种定量检测uchl-1的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种定量检测UCHL‑1的试剂盒及其应用，属于生物检测技术领域。所述的试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品、二维码组成；所述的检测试剂条包括试剂A和试剂B；所述的试剂A为以酶标记UCHL‑1抗体偶联物作为原料，使用缓冲液B将其充分混匀配制成的溶液；所述的试剂B为以UCHL‑1抗体磁微粒偶联物作为原料，使用缓冲液C将其充分混匀配制成的溶液，在实施过程中通过控制缓冲液B和缓冲液C的具体组分以及组分之间的质量比，使制备得到的试剂盒的外观、准确度、空白限、检出限、定量限、线性、重复性、校准品和质控品瓶间差等指标的研究符合要求，在全自动化学发光免疫分析仪上验证合格,测定结果满足企业标准要求。

Description

一种定量检测UCHL-1的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种定量检测UCHL-1的试剂盒及其应用。
背景技术
蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5，PGP9.5)，又名泛素羧基端水解酶(Ubiquitincarboxy-terminal hydrolase，UCH-L1)，是由223个氨基酸组成的一类半胱氨酸水解酶，分子量约为24800Da。这些酶通过ATP-依赖的蛋白酶体途径参与细胞中蛋白质的泛素和去泛素化。UCH-L1基因的突变和缺失与家族性帕金森病、轴索营养不良症等都有密切关系。创伤性脑损伤(TBI)是由外力引起的大脑损伤，会破坏大脑正常功能，导致人的认知能力或身体机能受损。在所有类型TBI中，最常见的后遗症为头痛(47.9％)和记忆异常(42％)(《英国神经外科杂志》，2018)，约三成患者需要心理辅导或神经病学治疗。TBI是神经外科中最常见疾病，也是世界范围内主要的死亡原因及致残因素之一，其后遗症对患者健康有永久性影响。有研究表明，全球范围内TBI发生率为790-979人/10万/年(《柳叶刀》，2017)，全球每年估计有5400-6000万人新患TBI。以此估算，中国每年新增TBI患者1100-1370万人。
目前，CT扫描是广泛用于帮助临床医师评估TBI的唯一客观、简单且可靠的选择。然而，CT结果的正确性与CT设备的准确性及医师的阅片水平直接相关，和其他检测方法相比，是一种相对主观的判断方法。约90％轻度TBI(有时被称为“脑震荡”)的CT扫描结果呈阴性(Toth，2015)。这些患者中只有不到1％的人需进行神经外科干预(Papa L，2012)。鉴于这些患者的CT扫描阳性百分比非常低且不必要影像学检测可能会增加辐射诱发癌变的风险，寻找开发其他的脑损伤诊断方法来准确判断颅脑损伤程度和评估预后，具有巨大的临床意义和战略意义。
UCH-L1作为脑中含量最丰富的蛋白质之一，其含量可占脑可溶蛋白的2％。(应天舒，泛素羧基末端水解酶L1的分布及改变，2013)UCH-L1经由泛素相关途径行使对细胞增生、分化和凋亡的调节功能。在TBI中，UCH-L1在1小时内会通过血脑屏障进入血液，导致血清UCH-L1显著升高。对TBI的早期诊断，鉴别诊断和判断预后有重要的意义(刘媛，泛素羧基末端水解酶-1的研究进展，2008)，临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。
中国专利申请201711226300.1中公开了一种磁微粒化学发光定量检测UCHL-1的试剂盒及其制备方法，所述的试剂盒，包括磁分离试剂、抗体试剂、酶标试剂、底物、洗液、校准品、质控品、磁套和吸头。该发明还公开了上述试剂盒的制备方法。但是该申请提供的试剂盒的检测上限、反应速度和检测灵敏度并不满足要求，并且不能提高检测的准确度和重复性，对检出限和线性关系也没有涉及。
本发明的目的是为了能够快速、简便地检测人外周血中脑特异性蛋白产物的含量，而提供的一种操作简便、能为创伤性脑损伤提供辅助诊断的体外诊断试剂盒及其制备方法和应用。该试剂盒在明显提高检测上限、反应速度和检测灵敏度的基础上，提高检测的准确度和重复性，并且检出限较低，线性关系良好。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种定量检测UCHL-1的试剂盒，能够在明显提高检测上限、反应速度和检测灵敏度的基础上，提高检测的准确度和重复性，并且检出限较低，线性关系良好。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种定量检测UCHL-1的试剂盒，所述的试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品、二维码组成；所述的检测试剂条是由一系列溶液和附件组成的整体，可以独立检测一个样本。所述的校准品由含有两个浓度的UCHL-1抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由含有两个浓度的UCHL-1抗原和缓冲液配制而成；所述的二维码中录入了当批次的标准曲线。
所述的检测试剂条由试剂A、试剂B、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成；所述的试剂A为含一定浓度碱性磷酸酶标记的UCHL-1抗体溶液；所述的试剂B为含一定浓度磁微粒标记的UCHL-1抗体溶液；所述的清洗液用于反应过程的清洗；所述的发光底物为ALP催化的发光底物；所述的测读孔用于最终的检测读值。
所述的校准品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合后配制成浓度分别为160pg/mL和1280pg/mL的2种溶液。
所述的质控品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合配制成浓度为320pg/mL的溶液。
所述的试剂A为以酶标记UCHL-1抗体偶联物作为原料，使用缓冲液B将其充分混匀配制成的溶液；
所述的试剂B为以UCHL-1抗体磁微粒偶联物作为原料，使用缓冲液C将其充分混匀配制成的溶液。
其中，所述的缓冲液A，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷12.0-15.0g、牛血清白蛋白20.0-60g、NaCl 2.0-10.0g、蔗糖10.0-100g，pH为7.5-10.0；
所述的三羟甲基氨基甲烷和蔗糖的质量比为0.2-1.5：1；优选为0.5-1.2。1；再优选为0.5：1。
所述的缓冲液A的制备方法为：称取12.0-15.0g的三羟甲基氨基甲烷、20.0-60g的牛血清白蛋白、2.0-10.0g的NaCl和10.0-100g的蔗糖加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值在7.5-10.0之间并定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即可得到。
所述的缓冲液B，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷12.0-15.0g、NaCl 9.0g、牛血清白蛋白1.0-50g、甘油5.0-20.0g、甘氨酸5.0-40g，pH为7.5-9.5；
所述的三羟甲基氨基甲烷、甘油和甘氨酸的质量比为0.6-3：1：0.5-8；优选为0.8-2：1：1-5；再优选为1-2：1：3-5；进一步优选为1：1：5。
所述的缓冲液B的制备方法为：称取12.0-15.0g的三羟甲基氨基甲烷、9.0g的NaCl、1.0-50g的牛血清白蛋白、5.0-20.0g甘油和5.0-40g甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值在7.5-9.5之间并定容至1000ml,用0.22μm的滤膜进行过滤，即可得到。
所述的缓冲液C，包括以下组分：Na2HPO4·12H2O 5.6-5.9g、NaH2PO40.55-0.60g、NaCl 9.0g、牛血清白蛋白1.0-50g、蔗糖80.0-140g、纤维素盐或纤维素衍生物1.0-5.0g、明胶5.0-50g；pH为6.2-8.0。
所述的蔗糖、纤维素盐或纤维素衍生物与明胶的质量比为20-100：1：5-30；优选为50-80：1：10-20；再优选为60：1：20。
所述的缓冲液C的制备方法为：称取5.6-5.9g的Na2HPO4·12H2O、0.55-0.60g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、1.0-50g的牛血清白蛋白、80.0-140g蔗糖、1.0-5.0g纤维素盐或纤维素衍生物和5.0-50g明胶加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值在6.2-8.0之间并定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即可得到。
在缓冲液A中，适当的缓冲体系盐浓度(三羟甲基氨基甲烷)和相对低的蔗糖浓度可以保证UCHL-1重组抗原的稳定性。在缓冲液B中，高浓度的甘氨酸、合适的甘油/甘氨酸配比和偏碱性的pH值保证了UCHL-1抗体偶联物的稳定性。在缓冲液C中，合适的纤维素或纤维素衍生物/明胶配比是UCHL-1抗体磁微粒偶联物可以长时间有效发挥功能的关键。
本发明提供了上述酶标记UCHL-1抗体偶联物和UCHL-1抗体磁微粒偶联物的制备方法，包括以下步骤：
S1、酶标抗体偶联物的制备
S1.1、抗体的活化：
S1.1.1活化步骤：称取4-8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-IT)，用缓冲液1溶解至13.76mg/mL，按2-IT与抗体摩尔比15-30:1的比例将2IT溶液加入抗体溶液中进行活化(即：1mg抗体加入10-20μL的2IT溶液)，震荡混匀后在室温下反应30分钟，得到活化抗体预产物；
S1.1.2终止活化步骤：按1mg抗体加入5-20μL缓冲液2的比例将缓冲液2加入活化抗体预产物溶液中，室温反应10min，使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体，得到活化抗体，将活化抗体加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化抗体。
S1.2、碱性磷酸酶(ALP)的活化
S1.2.1活化步骤：称取2-4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mL，按SMCC与ALP摩尔比15-60:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液(即：1mg ALP加入8.5-34.5μL SMCC溶液)。震荡混匀后室温下反应30分钟，得到碱性磷酸酶(ALP)活化预产物；
S1.2.2终止活化步骤：按1mg ALP加入10-50μl缓冲液2的比例将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min，使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP，得到活化ALP，将活化后的ALP加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化ALP。
S1.3、活化抗体和活化ALP的连接
将步骤S1.1.2中得到的浓缩的活化抗体与步骤S1.2.2中得到的浓缩的活化ALP按质量比1:2-1的比例混合(即：1.0mg抗体加入1.0-2.0mg ALP)，震荡混匀后，将混合物在2℃-8℃环境中反应12-18小时，即得到抗体偶联物预产物。
S1.4、抗体偶联物的终止和纯化
称取1-10mg马来酰亚胺，用DMF溶解至9.7mg/mL，按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液；按1mg抗体加入10μL 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入马来酰亚胺溶液，在室温下反应15分钟；量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM，即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1，按1mg抗体加入10-50μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入乙醇胺溶液，震荡混匀；使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至0.5-2mg/mL；使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2，纯化后得到酶标抗体偶联物。
S2、UCHL-1抗体磁微粒偶联物
将磁微粒用缓冲液4清洗后，重悬至5mg/mL，按磁微粒与抗体质量比100:1-10的比例在磁微粒溶液中加入抗体，得到混合液；按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:1-10的比例在上述混合液中加入缓冲液4，室温反应10min；按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:1-1000:10的比例在上述混合液中加入缓冲液5，在37℃环境中反应16-24小时，得到磁微粒偶联物预产物；用缓冲液6清洗磁微粒偶联物预产物，重悬至5mg/mL；在37℃环境中反应16-24小时；用缓冲液8清洗清洗磁微粒偶联物，重悬至10mg/mL，制成物为抗体磁微粒偶联物。
所述的缓冲液1的制备方法：称取14.8-15.1g的乙醇胺、5.8-6.0g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值在7.3-7.6之间并定容至1000ml,用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
上述步骤S2中所述的磁微粒为甲苯磺酰基磁珠。
所述的缓冲液2的制备方法：称取75g的甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
所述的缓冲液3的制备方法：称取203.3g的MgCl2·6H2O加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
所述的缓冲液4的制备方法：称取7.0-10.0g的Na2B4O7·10H2O加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值在9.0-11.0之间并定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
所述的缓冲液5的制备方法：称取470-530g的K2HPO4加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值在9.0-11.0之间并定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
所述的缓冲液6的制备方法：称取7.5-8.0g的Tris、9.0g的NaCl、3.0-10.0g的牛血清白蛋白加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取5-20mL吐温20加入上述容器中，调节pH值在7.3-7.8之间并定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
本发明还提供了上述试剂盒在在测定血清UCH-L1含量中的应用。
本发明还提供了一种使用上述试剂盒进行检测的方法，所述的检测方法为：
(1)免疫反应：将30uL样本、50uL试剂B、50uL试剂A依次加入反应孔位中，在37℃条件下反应20min；
(2)磁分离及清洗：在清洗孔位M1加入300μL清洗液，将含磁微粒的混合物用磁力吸出反应孔位，在清洗孔位M1脱磁；清洗2min后，在清洗孔位M2、清洗孔位M3分别进行1次磁分离及清洗；
(3)读值：在测读孔加入150uL发光底物，将含磁微粒的混合物用磁力吸出清洗孔位M3孔位，在测读孔脱磁，碱性磷酸酶催化的发光底物发光后用仪器检测相对发光强度(RLU)；
(4)根据检测的校准品数值可获得一条UCHL-1的浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合；
(5)样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应，从而实现对未知样本的浓度检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明使用免疫学检测手段对创伤性脑损伤进行血液检测，与影像学检测手段(主要为CT)相比，本专利更能客观的反映样本的真实情况，减少了因主观判断造成的误判和漏判；
(2)本发明使用的磁微粒化学发光法，并控制校准品、质控品，以及试剂盒A和试剂盒B的具体组分，使用特定的缓冲溶液进行稀释，可以使检测灵敏度达到皮克级别(10-12g/mL)，即便在CT为阴性的情况下，也可以对正常人和轻度TBI患者进行有效区分；
(3)本发明使用全自动仪器进行检测，只需加入血清样本，30分钟即可得到准确结果。而CT检测时间较长，至少需要等待4小时才可能取得检测结果；
(4)本发明使用浓度数值进行判断，取得结果即可得知患者是否患病，客观性较强，不容易造成漏判、误判；
(5)本领域技术人员公知，磁微粒是有一定质量的颗粒，成分主要为FeO及Fe2O3，其直径在1-4微米之间且不溶于水，磁微粒抗体偶联物由于连接了蛋白有一定的亲水性，由于重力作用，磁微粒抗体偶联物会在水介质中快速下沉，并且在一定时间后会出现板结，板结后再次混匀的难度很大，而本发明改进了磁微粒发光法中磁微粒载体的缓冲体系(缓冲液C)，合理控制具体组分，并控制蔗糖、纤维素盐或纤维素衍生物与明胶的质量比为20-100：1：5-30，能够保证磁微粒抗体偶联物在第14个月的重复性结果CV小于8％、与第0月的准确度结果偏差不超过10％，而对比组在第14个月的结果的重复性结果CV大于30％、与第0月的准确度结果偏差超过70％。
附图说明
图1免疫反应流程图；
图2UCHL-1检测试剂条示意图；
附图标记：A-反应孔位、M1-清洗孔位、M2-清洗孔位、M3-清洗孔位、B-测读孔。
具体实施方式
以下实施例中使用的全自动化学发光免疫分析仪，型号为MS-Fast。
基础实施例1
酶标记UCHL-1抗体偶联物和UCHL-1抗体磁微粒偶联物的制备方法，包括以下步骤：
S1、酶标抗体偶联物的制备
S1.1、抗体的活化：
S1.1.1活化步骤：称取4-8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-IT)，用缓冲液1溶解至13.76mg/mL，按2-IT与抗体摩尔比15-30:1的比例将2IT溶液加入抗体溶液中进行活化(即：1mg抗体加入10-20μL的2IT溶液)，震荡混匀后在室温下反应30分钟，得到活化抗体预产物；
S1.1.2终止活化步骤：按1mg抗体加入5-20μL缓冲液2的比例将缓冲液2加入活化抗体预产物溶液中，室温反应10min，使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体，得到活化抗体，将活化抗体加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化抗体。
S1.2、碱性磷酸酶(ALP)的活化
S1.2.1活化步骤：称取2-4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mL，按SMCC与ALP摩尔比15-60:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液(即：1mg ALP加入8.5-34.5μL SMCC溶液)。震荡混匀后室温下反应30分钟，得到碱性磷酸酶(ALP)活化预产物；
S1.2.2终止活化步骤：按1mg ALP加入10-50μl缓冲液2的比例将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min，使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP，得到活化ALP，将活化ALP加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化ALP。
S1.3、活化抗体和活化ALP的连接
将步骤S1.1.2中得到的活化抗体与步骤S1.2.2中得到的活化ALP按质量比1:2-1的比例混合(即：1.0mg抗体加入1.0-2.0mg ALP)，震荡混匀后，将混合物在2℃-8℃环境中反应12-18小时，即得到抗体偶联物预产物。
S1.4、抗体偶联物的终止和纯化
称取1-10mg马来酰亚胺，用DMF溶解至9.7mg/mL，按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液；按1mg抗体加入10μL 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入马来酰亚胺溶液，在室温下反应15分钟；量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM，即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1，按1mg抗体加入10-50μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入乙醇胺溶液，震荡混匀；使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至0.5-2mg/mL；使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2，纯化后得到酶标抗体偶联物。
S2、UCHL-1抗体磁微粒偶联物
将甲苯磺酰基磁珠用缓冲液4清洗后，重悬至5mg/mL，按磁微粒与抗体质量比100:1-10的比例在磁微粒溶液中加入抗体，得到混合液；按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:1-10的比例在上述混合液中加入缓冲液4，室温反应10min；按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:1-1000:10的比例在上述混合液中加入缓冲液5，在37℃环境中反应16-24小时，得到磁微粒偶联物预产物；用缓冲液6清洗磁微粒偶联物预产物，重悬至5mg/mL；在37℃环境中反应16-24小时；用缓冲液8清洗清洗磁微粒偶联物，重悬至10mg/mL，制成物为抗体磁微粒偶联物。
所述的缓冲液1的制备方法：称取14.8-15.1g的乙醇胺、5.8-6.0g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值在7.3-7.6之间并定容至1000ml,用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
所述的缓冲液2的制备方法：称取75g的甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
所述的缓冲液3的制备方法：称取203.3g的MgCl2·6H2O加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
所述的缓冲液4的制备方法：称取7.0-10.0g的Na2B4O7·10H2O加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值在9.0-11.0之间并定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
所述的缓冲液5的制备方法：称取470-530g的K2HPO4加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值在9.0-11.0之间并定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
所述的缓冲液6的制备方法：称取7.5-8.0g的Tris、9.0g的NaCl、3.0-10.0g的牛血清白蛋白加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取5-20mL吐温20加入上述容器中，调节pH值在7.3-7.8之间并定容至1000ml，用0.22μm的滤膜进行过滤，即得。
基础实施例2一种使用试剂盒进行检测的方法
所述的检测方法为：
(1)免疫反应：将30uL样本、50uL试剂B、50uL试剂A依次加入反应孔位中，在37℃条件下反应20min；
(2)磁分离及清洗：在清洗孔位加入300μL清洗液，将含磁微粒的混合物用磁力吸出反应孔位，在清洗孔位M1脱磁；清洗2min后，在清洗孔位M2、清洗孔位M3分别进行1次磁分离及清洗；
(3)读值：在测读孔加入150uL发光底物，将含磁微粒的混合物用磁力吸出清洗孔位M3孔位，在测读孔脱磁，碱性磷酸酶催化的发光底物发光后用仪器检测相对发光强度(RLU)；
(4)根据检测的校准品数值可获得一条UCHL-1的浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合；
(5)样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应，从而实现对未知样本的浓度检测。
实施例1一种定量检测UCHL-1的试剂盒
试剂盒主要组分 装量
检测试剂条 10条
质控品 200μL×1
校准品1 200μL×1
校准品2 200μL×1
盒签二维码 1个
所述的检测试剂条由试剂A、试剂B、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成；
所述的试剂A为以酶标记UCHL-1抗体偶联物作为原料，使用缓冲液B将其充分混匀配制成的溶液；
Figure BDA0002780942940000101
Figure BDA0002780942940000111
所述的试剂B为以UCHL-1抗体磁微粒偶联物作为原料，使用缓冲液C将其充分混匀配制成的溶液。
缓冲液C组分 称取量
十二水合磷酸氢二钠 5.6g
磷酸二氢钠 0.55g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 1.0g
蔗糖 80.0g
纤维素盐或纤维素衍生物 1.0g
明胶 5.0g
PH值 6.2
纯化水 定容至1000mL
所述的校准品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合后配制成浓度分别为160pg/mL和1280pg/mL的2种溶液。
缓冲液A组分 称取量
三羟甲基氨基甲烷 12.0g
牛血清白蛋白 20.0g
氯化钠 2.0g
蔗糖 30.0g
PH值 7.5
纯化水 定容至1000mL
所述的质控品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合配制成浓度为320pg/mL的溶液。
Figure BDA0002780942940000112
Figure BDA0002780942940000121
实施例2一种定量检测UCHL-1的试剂盒
试剂盒主要组分 装量
检测试剂条 10条
质控品 200μL×1
校准品1 200μL×1
校准品2 200μL×1
盒签二维码 1个
所述的检测试剂条由试剂A、试剂B、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成；
所述的试剂A为以酶标记UCHL-1抗体偶联物作为原料，使用缓冲液B将其充分混匀配制成的溶液；
缓冲液B组分 称取量
三羟甲基氨基甲烷 15.0g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 50g
甘油 20.0g
甘氨酸 40g
PH值 9.5
纯化水 定容至1000mL
所述的试剂B为以UCHL-1抗体磁微粒偶联物作为原料，使用缓冲液C将其充分混匀配制成的溶液。
Figure BDA0002780942940000122
Figure BDA0002780942940000131
所述的校准品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合后配制成浓度分别为160pg/mL和1280pg/mL的2种溶液。
缓冲液A组分 称取量
三羟甲基氨基甲烷 15.0g
牛血清白蛋白 60g
氯化钠 10.0g
蔗糖 100g
pH值 10.0
纯化水 定容至1000mL
所述的质控品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合配制成浓度为320pg/mL的溶液。
缓冲液A组分 称取量
三羟甲基氨基甲烷 15.0g
牛血清白蛋白 60g
氯化钠 10.0g
蔗糖 100g
pH值 10.0
纯化水 定容至1000mL
实施例3一种定量检测UCHL-1的试剂盒
Figure BDA0002780942940000132
Figure BDA0002780942940000141
所述的检测试剂条由试剂A、试剂B、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成；
所述的试剂A为以酶标记UCHL-1抗体偶联物作为原料，使用缓冲液B将其充分混匀配制成的溶液；
缓冲液B组分 称取量
三羟甲基氨基甲烷 15.0g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 30g
甘油 5.0g
甘氨酸 40g
pH值 8.2
纯化水 定容至1000mL
所述的试剂B为以UCHL-1抗体磁微粒偶联物作为原料，使用缓冲液C将其充分混匀配制成的溶液。
缓冲液C组分 称取量
十二水合磷酸氢二钠 5.8g
磷酸二氢钠 0.57g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 35g
蔗糖 100g
纤维素盐或纤维素衍生物 1.0g
明胶 30g
PH值 7.0
纯化水 定容至1000mL
所述的校准品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合后配制成浓度分别为160pg/mL和1280pg/mL的2种溶液。
缓冲液A组分 称取量
三羟甲基氨基甲烷 15g
牛血清白蛋白 40g
氯化钠 8g
蔗糖 100g
PH值 8.1
纯化水 定容至1000mL
所述的质控品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合配制成浓度为320pg/mL的溶液。
缓冲液A组分 称取量
三羟甲基氨基甲烷 15g
牛血清白蛋白 40g
氯化钠 8g
蔗糖 100g
PH值 8.1
纯化水 定容至1000mL
实施例4一种定量检测UCHL-1的试剂盒
试剂盒主要组分 装量
检测试剂条 10条
质控品 200μL×1
校准品1 200μL×1
校准品2 200μL×1
盒签二维码 1个
所述的检测试剂条由试剂A、试剂B、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成；
所述的试剂A为以酶标记UCHL-1抗体偶联物作为原料，使用缓冲液B将其充分混匀配制成的溶液；
缓冲液B组分 称取量
三羟甲基氨基甲烷 14g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 40g
甘油 7.0g
甘氨酸 21g
PH值 9.0
纯化水 定容至1000mL
所述的试剂B为以UCHL-1抗体磁微粒偶联物作为原料，使用缓冲液C将其充分混匀配制成的溶液。
缓冲液C组分 称取量
十二水合磷酸氢二钠 5.7g
磷酸二氢钠 0.56g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 45g
蔗糖 100g
纤维素盐或纤维素衍生物 2.0g
明胶 40g
PH值 7.5
纯化水 定容至1000mL
所述的校准品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合后配制成浓度分别为160pg/mL和1280pg/mL的2种溶液。
Figure BDA0002780942940000161
Figure DA00027809429459586121
所述的质控品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合配制成浓度为320pg/mL的溶液。
缓冲液A组分 称取量
三羟甲基氨基甲烷 36.0g
牛血清白蛋白 50g
氯化钠 6g
蔗糖 30.0g
PH值 8.5
纯化水 定容至1000mL
实施例5一种定量检测UCHL-1的试剂盒
试剂盒主要组分 装量
检测试剂条 10条
质控品 200μL×1
校准品1 200μL×1
校准品2 200μL×1
盒签二维码 1个
所述的检测试剂条由试剂A、试剂B、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成；
所述的试剂A为以酶标记UCHL-1抗体偶联物作为原料，使用缓冲液B将其充分混匀配制成的溶液；
Figure BDA0002780942940000171
Figure BDA0002780942940000181
所述的试剂B为以UCHL-1抗体磁微粒偶联物作为原料，使用缓冲液C将其充分混匀配制成的溶液。
缓冲液C组分 称取量
十二水合磷酸氢二钠 5.7g
磷酸二氢钠 0.56g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 45g
蔗糖 120g
纤维素盐或纤维素衍生物 2.0g
明胶 40g
PH值 7.5
纯化水 定容至1000mL
所述的校准品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合后配制成浓度分别为160pg/mL和1280pg/mL的2种溶液。
缓冲液A组分 称取量
三羟甲基氨基甲烷 22.0g
牛血清白蛋白 50g
氯化钠 6g
蔗糖 44g
PH值 8.5
纯化水 定容至1000mL
所述的质控品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合配制成浓度为320pg/mL的溶液。
Figure BDA0002780942940000182
Figure BDA0002780942940000191
对比例1
与实施例5的区别在于：缓冲液A中三羟甲基氨基甲烷与蔗糖的质量比为0.1：1，即三羟甲基氨基甲烷6g、蔗糖60g，其他组分及含量与实施例5相同。
对比例2
与实施例5的区别在于：缓冲液A中三羟甲基氨基甲烷与蔗糖的质量比为3：1，即三羟甲基氨基甲烷49.5g、蔗糖16.5g，其他组分及含量与实施例5相同。
对比例3
与实施例5的区别在于：缓冲液B中三羟甲基氨基甲烷、甘油与甘氨酸的质量比为0.2：1：10，三羟甲基氨基甲烷1.75g、甘油8.75g、甘氨酸87.5g，其他组分及含量与实施例5相同。
对比例4
与实施例5的区别在于：缓冲液B中三羟甲基氨基甲烷、甘油与甘氨酸的质量比为5：1：10，三羟甲基氨基甲烷30.625g、甘油6.125g、甘氨酸61.25g，其他组分及含量与实施例5相同。
对比例5
与实施例5的区别在于：缓冲液C中蔗糖、纤维素盐或纤维素衍生物和明胶的质量比为20：2：5，即蔗糖120g、纤维素盐或纤维素衍生物12g和明胶30g，其他组分及含量与实施例5相同。
对比例6
与实施例5的区别在于：缓冲液C中蔗糖、纤维素盐或纤维素衍生物和明胶的质量比为158：1：3，即蔗糖158g、纤维素盐或纤维素衍生物1g和明胶3g，其他组分及含量与实施例5相同。
效果实验
1、对泛素羧基端水解酶L1(UCHL-1)检测试剂盒外观检测
实施例1-5制备的试剂盒均组分齐全、完整；检测试剂条无漏液、无破损、无污染；中文包装标签清晰，易识别，符合要求。
2、准确度检测
实验要求：回收率应在85％-115％范围内。
实验方法
将浓度约为3ng/mL(允许偏差±10％)的泛素羧基端水解酶L1(UCHL-1)液(A)加入到0浓度样本B中，所加入泛素羧基端水解酶L1抗原与样本B之间的体积比例为1:9，根据公式(1)计算回收率R，结果应符合实验的要求，具体检测结果见下表1。
Figure BDA0002780942940000201
式中：
R—回收率；
V-样本A液的体积；
V0-样本B液的体积；
C-样本B液加入A液后的3次测量平均值；
C0-样本B液的3次测量平均值；
CS-样本A液的浓度。
表1准确度检测结果
实例 回收率
实施例1 89.12％
实施例2 110.96％
实施例3 96.35％
实施例4 102.74％
实施例5 107.18％
对比例1 75.33％
对比例2 122.51％
对比例3 80.56％
对比例4 118.48％
对比例5 81.09％
对比例6 66.96％
由实验结果可见，使用实施例1-5制备的试剂盒进行检测，将已知浓度的泛素羧基端水解酶L1(UCHL-1)加入到低值样本中，其回收率在85％-115％范围内，符合要求；而对比例1-6中改变缓冲液的质量比不在本发明要求保护的范围内时试剂盒的准确度明显降低，回收率低于85％或高于115％，不符合要求。
3、空白限检测
实验要求：≤0.08ng/mL
实验方法：
将零浓度校准品作为样本，重复测试20次，得到20次测试结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值x和标准差(SD)。根据试剂盒所用校准品的定标曲线方程，将平均值x+2SD所对应的RLU值代入四参数Logistic方程Y＝((A-B)/(1+((|X|/C)^D)))+(B)中，其中ABCD为4个参数，求出对应的浓度值，即为空白限，结果应符合实验要求，具体检测结果见下表2。
表2空白限检测结果
Figure BDA0002780942940000211
Figure BDA0002780942940000221
由表2的实验结果可见，使用实施例1-5制备的试剂盒进行检测空白限实验结果不高于0.08ng/mL，符合要求，而使用对比例1-6制备的试剂盒进行检测，由于改变缓冲液的质量比不在本发明要求保护的范围内时试剂盒的空白限明显升高，空白限实验结果高于0.08ng/mL，不符合要求。
4、检出限检测
实验要求：检出限不高于0.1ng/mL。
实验方法
将1ng/mL的样本分别稀释4、6、7、8、10倍。对5份浓度近似LOD的低值样本进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，如果低于生产企业提供的空白限数值的检测结果的数量应小于或等于3个，即可认为空白限(0.08ng/mL)和检出限的设置基本合理，具体检测数据见下表3。
表3检出限检测结果
实例 低于空白限(0.08ng/mL)数量
实施例1 3
实施例2 3
实施例3 2
实施例4 2
实施例5 0
对比例1 5
对比例2 6
对比例3 4
对比例4 5
对比例5 8
对比例6 4
由表3的实验结果可见，使用本发明实施例1-5制备的试剂盒检测时低于生产企业提供的空白限数值的检测结果的数量小于或等于3个，实施例5制备的试剂盒检测时低于生产企业提供的空白限数值的检测结果的数量为0个，检出限设置合理，符合要求；而使用对比例1-6制备的试剂盒进行检测，由于改变缓冲液的质量比不在本发明要求保护的范围内时试剂盒检测时低于生产企业提供的空白限数值的检测结果的数量大于3个，检出限设置不合理，不符合要求。
5、定量限检测
实验要求：定量限不高于0.1ng/mL。
实验方法
将近似检出限的低值样本进行20次重复测定，计算20次检测结果的重复性，若CV≤20％，即可认为定量限的设置合理；若CV＞20％，取检出限之上浓度点的低值样本再次检测，直至20次检测结果的重复性不高于20％，即CV≤20％，该浓度点即为定量限，具体检测结果见下表4。
表4定量限检测结果
Figure BDA0002780942940000241
Figure BDA0002780942940000251
由上表4的实验结果可见，使用本发明实施例1-5制备的试剂盒分别检测20次检测结果的重复性不高于20％，定量限设置合理，符合要求；而使用对比例3-6制备的试剂盒进行检测20次检测结果的重复性高于20％，定量限设置不合理，不符合要求。
6、线性
实验要求：在80-2560pg/mL的线性范围内，相关系数r应≥0.990。
实验方法
将接近线性范围上限的高值样本(2560pg/mL)与零浓度样本混合成6个稀释浓度，理论浓度分别为2560pg/mL、1280pg/mL、640pg/mL、320pg/mL、160pg/mL、80pg/mL。对每一浓度的样本各重复测试3次得到浓度值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(2)计算线性回归的相关系数(r)，应符合实验的要求，检测数据见下表5。
Figure BDA0002780942940000252
式中：
r-相关系数；
xi-稀释比例；
yi-各个样本测定结果均值；
Figure BDA0002780942940000261
-稀释比例的均值；
Figure BDA0002780942940000262
-样本测定结果总均值。
表5相关系数r检测结果
实例 相关系数r
实施例1 0.9992
实施例2 0.9971
实施例3 0.9979
实施例4 0.9985
实施例5 0.9996
对比例1 0.9805
对比例2 0.9826
对比例3 0.9781
对比例4 0.9865
对比例5 0.9631
对比例6 0.9883
由实验结果可见，线性相关系数(r)实验结果不低于0.9900。因此可以定义试剂盒的线性范围为80-2560pg/mL；而使用对比例3-6制备的试剂盒进行检测，线性相关系数(r)实验结果低于0.9900，线性关系不好，不符合要求。
7、重复性
实验要求：对高浓度样本和低浓度样本各测试10次，CV≤10％。
实验方法
同批号试剂盒重复测试高浓度样本(1-1.6ng/mL)、低浓度样本(0.12-0.2ng/mL)各10次，计算10次测试结果的平均值
Figure BDA0002780942940000263
和标准差SD。按公式(3)计算变异系数(CV)，结果应符合实验要求，检测结果见下表6。
Figure BDA0002780942940000271
式中：
SD-样本测试值的标准差；
Figure BDA0002780942940000272
-样本测试值的平均值。
表6重复性检测结果
Figure BDA0002780942940000273
Figure BDA0002780942940000281
由上表6的实验结果可见，实施例1-5制备的试剂盒的重复性不高于10％，符合要求；而使用对比例3-6制备的试剂盒进行检测，由于改变缓冲液的质量比不在本发明要求保护的范围内时试剂盒检测时试剂盒的重复性高于10％，不符合要求。
8、校准品和质控品瓶间差
实验要求：校准品和质控品瓶间差CV＜10％。
实验方法
检测同一批号10瓶校准品(或质控品)各1次，按公式(5)计算，测定结果的均值
Figure BDA0002780942940000282
与标准差(SD1)。另取上述10瓶校准品(或质控品)中的1瓶连续测定5次，计算结果的均值
Figure BDA0002780942940000283
和标准差(SD2)，按照公式(6)、(7)计算瓶间重复性CV％，测量结果应满足实验要求，检测数据见下表7。
Figure BDA0002780942940000284
Figure BDA0002780942940000285
Figure BDA0002780942940000286
(说明：当SD1<SD2时，令CV瓶间＝0)
式中：SD-标准差。
表7校准品和质控品瓶间差检测结果
Figure BDA0002780942940000287
Figure BDA0002780942940000291
Figure BDA0002780942940000301
根据上表7的检测数据可知，实施例1-5制备的试剂盒检测校准品和质控品瓶间差CV均＜10％，符合要求，而使用对比例1-2制备的试剂盒进行检测，由于改变缓冲液的质量比不在本发明要求保护的范围内时试剂盒检测时校准品和质控品瓶间差CV均大于等于10％，不符合要求。
根据以上检测结果可见，本发明实施例1-5制备的试剂盒的外观、准确度、空白限、检出限、定量限、线性、重复性、校准品和质控品瓶间差等指标的研究符合要求，在全自动化学发光免疫分析仪上验证合格,测定结果满足企业标准要求。

Claims (3)

1.一种定量检测UCHL-1的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品、二维码组成；
所述的检测试剂条包括试剂A和试剂B；所述的试剂A为含碱性磷酸酶标记的UCHL-1抗体溶液；所述的试剂B为含磁微粒标记的UCHL-1抗体溶液；
所述的试剂A为以酶标记UCHL-1抗体偶联物作为原料，使用缓冲液B将其充分混匀配制成的溶液；
所述的试剂B为以UCHL-1抗体磁微粒偶联物作为原料，使用缓冲液C将其充分混匀配制成的溶液；
所述的质控品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合配制成浓度为320pg/mL的溶液；
所述的缓冲液A，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷12.0-15.0g、牛血清白蛋白20.0-60g、NaCl 2.0-10.0g、蔗糖10.0-100g，pH为7.5-10.0；所述的三羟甲基氨基甲烷和蔗糖的质量比为0.2-1.5：1；
所述的缓冲液B，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷12.0-15.0g、NaCl 9.0g、牛血清白蛋白1.0-50g、甘油5.0-20.0g、甘氨酸5.0-40g，pH为7.5-9.5；所述的三羟甲基氨基甲烷、甘油和甘氨酸的质量比为0.6-3：1：0.5-8；
所述的缓冲液C，包括以下组分：Na2HPO4·12H2O 5.6-5.9g、NaH2PO40.55-0.60g、NaCl9.0g、牛血清白蛋白1.0-50g、蔗糖80.0-140g、纤维素盐或纤维素衍生物1.0-5.0g、明胶5.0-50g；pH为6.2-8.0；所述的蔗糖、纤维素盐或纤维素衍生物与明胶的质量比为20-100：1：5-30。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的校准品为以UCHL-1重组蛋白作为原料，使用缓冲液A将其溶解，充分混合后配制成浓度分别为160pg/mL和1280pg/mL的2种溶液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的蔗糖、纤维素盐或纤维素衍生物与明胶的质量比为60：1：20。
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