CN117405890B - 胃蛋白酶原ii的化学发光检测试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子检测领域，具体涉及胃蛋白酶原II的化学发光检测试剂盒及方法。该方法中包括酶标试剂的缓冲体系和磁微粒载体的缓冲体系，所述的酶标试剂的缓冲体系和磁微粒载体的缓冲体系中的各组分之间具有协同作用，能显著提高胃蛋白酶原II检测的特异性、准确度和精密度。并且具有检测时间短、检测方法简单等优点，为萎缩性胃炎的诊断提供了技术支持。

Description

胃蛋白酶原II的化学发光检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子检测领域，具体涉及胃蛋白酶原II的化学发光检测试剂盒及方法。
背景技术
萎缩性胃炎也称慢性萎缩性胃炎，以胃黏膜上皮和腺体萎缩，数目减少，胃黏膜变薄，黏膜基层增厚，或伴幽门腺化生和肠腺化生，或有不典型增生为特征的慢性消化系统疾病。常表现为上腹部隐痛、胀满、嗳气，食欲不振，或消瘦、贫血等，无特异性。是一种多致病因素性疾病或癌前病变。
胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体，根据其生化性质和免疫原性将其分成2个亚群，1-5组分的免疫原性相同，称为胃蛋白酶原I，主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；组分6和7被称为胃蛋白酶原II，除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能产生胃蛋白酶原II。通常情况下，约有1%的PG透过胃黏膜毛细血管进入血液循环，进入血液循环的PG在血液中非常稳定。血清PG I和PG II反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。当胃黏膜发生病理变化时，血清PG含量也随之改变。因此，监测血清中PG的浓度可以作为监测胃黏膜状态的手段。
血清胃蛋白酶原水平反映了不同部位胃粘膜的形态和功能：PGI是检测胃泌酸腺细胞功能的指针，胃酸分泌增多PGI升高，分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PGI降低；PGII与胃底粘膜病变的相关性较大（相对于胃窦粘膜），其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增值有关；PGI/II比值进行性降低与胃粘膜萎缩进展相关。因此，联合测定PGI和PGII比值可起到胃底腺粘膜“血清学活检”的作用。
专利CN105372426A公开了一种胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒，该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。本发明还公开了该试剂盒的制备方法与使用该试剂盒检测胃蛋白酶原II(PGII)的方法。该发明以异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体和碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体制备抗试剂，以抗异硫氰酸荧光素抗体偶联羧基磁珠制得磁微粒试剂；所述的磁珠微粒缓冲液的配置方法为：Tris：12.12mg，氯化钠5.82mg，甲基纤维醚50g，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解。该发明的检测试剂盒性能可靠、灵敏度高、线性范围宽，可配合半自动、全自动仪器使用。
专利CN102426236A公开了一种胃蛋白酶原II(PGII)的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含PGII磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，PGII校准品、PGII质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。该发明中公开了磁珠缓冲液配制操作步骤，配制1L：（1）称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g TWEEN-20于20mL容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；（2）用移液器将Proclin-300量取0.2mL于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800mL纯化水，充分搅拌；（3）调节PH，控制PH在7.95-8.05之间；（4）称取BSA 3g倒入上述1L容器中；（5）最后定容至1000mL，用0.2um滤器过滤即得。该发明还公开了该试剂盒的制备方法。该发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系。
缓冲体系直接影响胃蛋白酶原II的检测灵敏度和准确性，因此，亟需研发一种缓冲液，进一步提高检测的准确性和灵敏度。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种胃蛋白酶原II的化学发光检测方法，所述的方法中包括磁微粒载体的缓冲体系和酶标试剂的缓冲体系，确定缓冲液组分以及各组分之间的比例，能显著提高检测的准确性。
一方面，本发明提供了一种胃蛋白酶原II检测的试剂盒，所述的试剂盒包括酶标试剂的缓冲体系A，所述的缓冲体系A，由以下成分组成：：Tris-HCl 3.0-30 g/L；氯化钠7-12g/L；牛血清白蛋白1.0-30 g/L；蔗糖30-40g/L；酶水解明胶15-35g/L；酶稳定剂100-200mL/L；羟基磷灰石1.0-5.0g/L；月桂醇聚氧乙烯醚1.0-3.0g/L；1M 氯化镁0.2-10mL/L；1M氯化锌0.2-10mL/L；余量为水；所述缓冲体系pH值7.4-8.2。
优选地，所述的缓冲体系A，由以下成分组成：Tris-HCl 20 g/L；氯化钠9.0 g/L；牛血清白蛋白20 g/L；蔗糖35 g/L；酶水解明胶20g/L；酶稳定剂150mL/L；羟基磷灰石2g/L；月桂醇聚氧乙烯醚1.5g/L；1M 氯化镁5mL/L；1M氯化锌5mL/L；余量为水；所述缓冲体系pH值8。
具体地，所述的酶稳定剂可以是碱性磷酸酶结合物酶稳定剂。
具体地，所述的试剂盒还可以包括磁微粒载体的缓冲体系B，所述的缓冲体系B，由以下成分组成：十二水合磷酸氢二钠5.6-5.9g/L；磷酸二氢钠0.55-0.60g/L；氯化钠5-9g/L；牛血清白蛋白1-10g/L；蔗糖75-135g/L；2-羟乙基纤维素0.5-10 g/L；明胶3-20g/L；羟基磷灰石5-20g/L；0.1%-0.3%吐温；余量为水；所述缓冲体系pH值 7.0-8.0。
优选地，所述的缓冲体系B，由以下成分组成：十二水合磷酸氢二钠5.9 g/L；磷酸二氢钠0.60g/L；氯化钠5g/L；牛血清白蛋白1g/L；蔗糖75g/L；2-羟乙基纤维素6g/L；明胶3g/L；羟基磷灰石5g/L；0.1%吐温；余量为水；所述缓冲体系pH值7.0。
具体地，前述的酶标试剂的缓冲体系A用于混合酶标记胃蛋白酶原II抗体偶联物。
进一步具体地，所述的酶标记胃蛋白酶原II抗体偶联物中的酶可以是碱性磷酸酶。
具体地，前述的磁微粒载体的缓冲体系B用于混合胃蛋白酶原II抗体磁微粒偶联物。
具体地，所述的试剂盒还包括但不限于：校准品和/或质控品。
具体地，所述的试剂盒可以是磁微粒化学发光法定量分析试剂盒。
又一方面，本发明提供了前述的试剂盒在检测胃蛋白酶原II中的应用。
又一方面，本发明提供了一种缓冲体系在制备萎缩性胃炎诊断试剂盒中的应用，所述的应用包括检测胃蛋白酶原II；所述的缓冲体系包括酶标试剂的缓冲液，所述的缓冲体系A，由以下成分组成：Tris-HCl 3.0-30 g/L；氯化钠7-12g/L；牛血清白蛋白1.0-30g/L；蔗糖30-40g/L；酶水解明胶15-35g/L；酶稳定剂100-200mL/L；羟基磷灰石1.0-5.0g/L；月桂醇聚氧乙烯醚1.0-3.0g/L；1M 氯化镁0.2-10mL/L；1M氯化锌0.2-10mL/L；余量为水；所述缓冲体系pH值7.4-8.2。
优选地，所述的缓冲体系A，由以下成分组成：：Tris-HCl 20g/L；氯化钠9.0 g/L；牛血清白蛋白20 g/L；蔗糖35 g/L；酶水解明胶20g/L；酶稳定剂150mL/L；羟基磷灰石2g/L；月桂醇聚氧乙烯醚1.5g/L；1M 氯化镁5mL/L；1M氯化锌5mL/L；余量为水；所述缓冲体系pH值8。
具体地，所述的缓冲体系还可以包括磁微粒载体的缓冲体系B，所述的缓冲体系B，由以下成分组成：十二水合磷酸氢二钠5.6-5.9g/L；磷酸二氢钠0.55-0.60g/L；氯化钠5-9g/L；牛血清白蛋白1-10g/L；蔗糖75-135g/L；2-羟乙基纤维素0.5-10g/L；明胶3-20g/L；羟基磷灰石5-20g/L；0.1%-0.3%吐温；余量为水；所述缓冲体系pH值 7.0-8.0。
优选地，所述的缓冲体系B，由以下成分组成：十二水合磷酸氢二钠5.9g/L；磷酸二氢钠0.60g/L；氯化钠5g/L；牛血清白蛋白1g/L；蔗糖75g/L；2-羟乙基纤维素6g/L；明胶3 g/L；羟基磷灰石5g/L；0.1%吐温；余量为水；所述缓冲体系pH值7.0。
具体地，所述的的试剂盒还包但不限于：括校准品和/或质控品。
具体地，所述的萎缩性胃炎为胃窦为主萎缩性胃炎、胃体为主萎缩性胃炎、多灶性萎缩性胃炎或胃萎缩全胃炎。
具体地，所述的萎缩性胃炎为胃窦为主萎缩性胃炎、胃体为主萎缩性胃炎、多灶性萎缩性胃炎或胃萎缩全胃炎。
进一步具体地，所述的胃窦为主萎缩性胃炎是以胃窦黏膜病变为主，胃酸分泌增加，十二指肠溃疡的风险增加；
所述的胃体为主萎缩性胃炎是有自身免疫病引起，胃酸分泌减少，同时有幽门螺杆菌感染，胃癌的发生风险增加；
所述的多灶性萎缩性胃炎是指胃窦和胃体黏膜多出萎缩（化生性）改变，胃窦为萎缩性胃炎和多灶性萎缩性胃炎是同一疾病的不同阶段；
所述的胃萎缩全胃炎是指胃窦、胃体萎缩程度相似，可能为多灶性萎缩性胃炎的发展阶段。
本发明所取得的技术效果：
（1）本发明的检测方法准确度高、简单，相对于现有影像学检测手段能有效减少给病人带来的痛苦和伤害，并缩短等待时间。
（2）本发明的检测方法只需要少量的血清样本即可获得准确的检测结果。
（3）缓冲液7和缓冲液8中的各组分间具有协同作用，能显著提高蛋白酶原II检测的准确度和精确度。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
基础实施例
参考现有技术中的方法设置基础实施例，其为实现本发明技术方案的背景方法，本发明在基础实施例的基础上进行进一步改进得到实施例的技术方案。
1材料
1.1设备
蛋白纯化仪、低温高速离心机、分析天平、PH计、磁力搅拌器、磁分离架等。
1.2缓冲液配方（配制量均为1L）
1.2.1缓冲液1
称取14.8-15.1g的乙醇胺、5.8-6.0g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试PH值在7.3-7.6之间并定容至1000mL，见表1。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表1 缓冲液1配方
1.2.2缓冲液2
称取75g的甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，定容至1000mL，见表2。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表2 缓冲液2配方
1.2.3缓冲液3
称取7.0-10.0g的Na2B4O7·10H2O加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试PH值在9.0-11.0之间并定容至1000mL，见表3。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表3 缓冲液3配方
原料名称 称取量 实施例具体用量
十水合四硼酸钠 7.0-10.0 g 8g
PH值 9.0-11.0 10
纯化水 定容至1000mL 定容至1000mL
1.2.4缓冲液4
称取470-530g的K2HPO4加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试PH值在9.0-11.0之间并定容至1000mL，见表4。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表4 缓冲液4配方
原料名称 称取量 实施例具体用量
磷酸氢二钾 470-530 g 500g
PH值 9.0-11.0 10
纯化水 定容至1000mL 定容至1000mL
1.2.5缓冲液5
称取7.5-8.0g的Tris、9.0g的NaCl、3.0-10.0g的牛血清白蛋白加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取5-20mL吐温20加入上述容器中，调试PH值在7.3-7.8之间并定容至1000mL，见表5。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表5 缓冲液5配方
原料名称 称取量 实施例具体用量
三羟甲基氨基甲烷 7.5-8.0 g 7.8g
氯化钠 9.0 g 9.0 g
牛血清白蛋白 3.0-10.0 g 5g
吐温20 5-20mL 10mL
PH值 7.3-7.8 7.5
纯化水 定容至1000mL 定容至1000mL
1.2.6缓冲液6
称取12.0-15.0g的Tris、5.0-50g的牛血清白蛋白、1.0-30g甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试PH值在7.6-8.8之间并定容至1000mL，见表6。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表6 缓冲液6配方
原料名称 称取量 实施例具体用量
三羟甲基氨基甲烷 12.0-15.0 g 14.0g
牛血清白蛋白 5.0-50 g 30g
甘氨酸 1.0-30 g 20g
PH值 7.6-8.8 8
纯化水 定容至1000mL 定容至1000mL
1.2.7缓冲液7
称取9.0-30g的Tris-HCl、9.0g的NaCl、1.0-30g的牛血清白蛋白、30-40g的蔗糖、15-35g的酶水解明胶（蛋白来源可以是牛、羊、猪、驴等哺乳动物或鱼类中的一种或多种）、100-200mL酶稳定剂（碱性磷酸酶结合物酶稳定剂，郑州赛润生物技术有限公司，货号EAS05）、羟基磷灰石1.0-5.0g（Sigma，677418）、月桂醇聚氧乙烯醚1.0-3.0g（Sigma，STS0212）、0.2-10mL 1M氯化镁（1000mL纯化水中溶解95g氯化镁）、.2-10mL 1M氯化锌（1000mL纯化水中溶解136g氯化锌）加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试PH值在7.4-8.2之间并定容至1000mL，见表7。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表7 缓冲液7配方
原料名称 称取量
Tris-HCl 3.0-30 g
氯化钠 9.0 g
牛血清白蛋白 1.0-30 g
蔗糖 30-40 g
酶水解明胶 15-35g
酶稳定剂 100-200mL
羟基磷灰石 1.0-5.0g
月桂醇聚氧乙烯醚 1.0-3.0g
1M 氯化镁 0.2-10mL
1M氯化锌 0.2-10mL
PH值 7.4-8.2
纯化水 定容至1000mL
1.2.8缓冲液8
称取5.6-5.9g的Na2HPO4·12H2O、0.55-0.60g的 NaH2PO4、5.0-9.0g的NaCl、1.0-10g的牛血清白蛋白、70-135g蔗糖、0.5-10.0g 2-羟乙基纤维素、3-20g明胶（蛋白来源可以是牛、羊、猪、驴等哺乳动物或鱼类中的一种或多种）、5-20g 羟基磷灰石、0.1%-0.3%吐温（吐温20、吐温40、吐温60或吐温80）加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试PH值在6.2-8.0之间并定容至1000mL，见表8。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表8 缓冲液8 配方
原料名称 称取量
十二水合磷酸氢二钠 5.6-5.9 g
磷酸二氢钠 0.55-0.60 g
氯化钠 5.0-9.0 g
牛血清白蛋白 1.0-10 g
蔗糖 75-135 g
2-羟乙基纤维素 0.5-10.0 g
明胶 3.0-20 g
羟基磷灰石 5.0-20.0g
吐温 0.1%-0.3%
PH值 6.2-8.0
纯化水 定容至1000mL
2方法
2.1酶标记抗体及纯化
2.1.1抗体1的活化
抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4-8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐 （2-IT），用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2-IT与抗体1摩尔比15:1-30:1的比例（即：1mg抗体1加入10-20μL 2-IT溶液）将2-IT溶液加入抗体1溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg抗体1加入5-20μL 缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体1溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体1。
2.1.2碱性磷酸酶（ALP）的活化
ALP的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取2-4mg (N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC），用二甲基甲酰胺（DMF）溶解至6.69mg/mL。按SMCC与ALP摩尔比15:1-60:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液（即：1mg ALP加入8.5-34.5μL SMCC溶液）。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg ALP加入10-50μL 缓冲液2的比例，将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP。
2.1.3抗体1和ALP的连接
抗体1和ALP的连接需在十万级洁净厂房内进行。按抗体1与ALP质量比1:2-1:1的比例在抗体1溶液中的加入ALP溶液（即：1.0mg抗体加入1.0-2.0mg ALP）。震荡混匀后，将混合物在2℃-8℃环境中反应12-18小时。
2.1.4抗体1偶联物的终止和纯化
抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。称取1-10mg马来酰亚胺，用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体加入10μL 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体1加入10-50μL 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至0.5~2mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级 2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为酶标抗体偶联物。
2.2抗体2偶联磁微粒
将磁微粒用缓冲液3清洗后，重悬至5mg/mL。按磁微粒与抗体2质量比100:1-100:10的比例在磁微粒溶液中加入抗体2，按缓冲液3与磁微粒体积质量比100:1-100:10的比例在上述混合物中加入缓冲液3，室温反应10min。按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:1-1000:10的比例在上述混合物中加入缓冲液4，在37℃环境中反应16-24小时。
用缓冲液5清洗磁微粒偶联物，重悬至5mg/mL。在37℃环境中反应16-24小时。用缓冲液7清洗清洗磁微粒偶联物，重悬至10mg/mL。制成物为抗体磁微粒偶联物。
本发明采用双抗体夹心法测定PGII的含量。样本中PGII和试剂A中的PGII抗体1（medix，货号100098）及试剂B中的PGII抗体2（medix，货号100121）结合，形成“三明治”夹心结构。经洗涤，发光底物被复合物中的酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子。产生的光子数与样本中PGII的浓度成正相关。
PGII试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品、二维码组成，见表9。其中检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本。校准品由含有两个浓度的PGII抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由含有两个浓度的PGII抗原和缓冲液配制而成；二维码中录入了当批次的标准曲线。
表9 试剂盒主要组分
试剂盒主要组分 装量
检测试剂条 10条
质控品1 200μL×1
质控品2 200μL×1
校准品1 200μL×1
校准品2 200μL×1
盒签二维码 1个
检测试剂条由试剂A、试剂B、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成，见表10。试剂A为含一定浓度碱性磷酸酶标记的PGII抗体1溶液；试剂B为含一定浓度磁微粒标记的PGII抗体2溶液；清洗液用于反应过程的清洗；发光底物为ALP催化的发光底物；测读孔用于最终的检测读值。
表10试剂条主要组分
位置 检测试剂条组分 装量/数量
1 【无】样本孔位 /
2 吸头 1个
3 洗脱套 1个
4 清洗液 2.0mL
5 发光底物 180μL
6 试剂B 60μL
7 【无】 /
8 试剂A 80μL
9 【无】 /
10 【无】 /
11 【无】反应孔位 /
12 【无】清洗孔位 /
13 【无】清洗孔位 /
14 【无】清洗孔位 /
15 测读孔 1个
3生产工艺
3.1校准品、质控品的生产
将PGII重组蛋白作为校准品的原料。以缓冲液6将其溶解，充分混合后配制成2个校准品，浓度为5ng/mL、50ng/mL。
将PGII重组蛋白作为质控品的原料。以缓冲液6将其溶解，充分混合后配制成2个质控品。浓度为10ng/mL、35ng/mL。
3.2试剂A的生产
将酶标记PGII抗体偶联物作为试剂A的原料。以缓冲液7将其充分混匀配制成试剂A。
3.3试剂B的生产
将PGII抗体磁微粒偶联物作为试剂B的原料。以缓冲液8将其充分混匀配制成试剂B。
4检测方法
采用北京美联泰科生物技术有限公司自研的全自动化学发光免疫分析仪进（MS-Fast 系列80A，pro80、pro160、pro240）行检测。反应所需样本量为30μL，自动检验流程为：
（1）免疫反应：将30uL样本、50uL试剂B、50uL试剂A依次加入11号孔位，在37℃条件下反应20min。
（2）磁分离及清洗：在12号孔位加入300μL清洗液，将含磁微粒的混合物用磁力吸出11号孔位，在12号孔位脱磁。清洗2min后。 在13、14号孔位分别进行1次磁分离及清洗。
（3）读值：在15号孔位加入150uL发光底物，将含磁微粒的混合物用磁力吸出14号孔位，在15号孔位脱磁。碱性磷酸酶催化的发光底物发光后用自研仪器检测相对发光强度（RLU）。
（4）根据检测的校准品数值可获得一条PGII浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合。
（5）样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应，从而实现对未知样本的浓度检测。
5检测指标
5.1准确度
将浓度约为100ng/mL(允许偏差±10%)的胃蛋白酶原II（PGII）液（A）加入到浓度范围0ng/mL-0.5ng/mL的样本B中，所加入PGII抗原与样本B之间的体积比例为1:9，根据公式（1）计算回收率R，其回收率应在85%-115%范围内。
R=（1）
式中：
R — 回收率；
V — 样品A液的体积；
V0— 血清样品B液的体积；
C — 血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；
C0— 血清样品B液的3次测量平均值；
CS— 样品A液的浓度。
5.2空白限
将不含任何分析物的样本重复测试20次，得到20次测试结果的浓度值，计算其平均值和标准差（SD）。平均值/>+2SD即为空白限，结果应≤0.5ng/mL。
5.3线性区间
将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值（）。以稀释浓度（/>）为自变量，以测定结果均值（/>）为因变量求出线性回归方程。按公式（2）计算线性回归的相关系数（r），在1-100ng/mL的线性区间内，相关系数r应≥0.990。
（2）
式中：
— 相关系数；
— 稀释比例；
— 各个样本测定结果均值；
— 稀释比例的均值；
— 样本测定结果总均值。
5.4重复性
同批号试剂盒重复测试质控品10次，计算10次测试结果的平均值和标准差SD。按公式（3）计算变异系数(CV)，结果CV≤10%。
（3）
式中：
SD — 样本测试值的标准差；
— 样本测试值的平均值。
5.5批间差
用3个批号的试剂盒分别重复测试质控品10次，计算30次测试结果的平均值和标准差SD，根据公式（3）得出变异系数（CV），结果CV≤15%。
5.6特异性
在不含任何分析物的样本中加入不低于200ng/mL的胃蛋白酶原I，测3次取均值，测定结果不高于0.5ng/mL。
实施例1
参照基础实施例设置实施例1，实施例1中的缓冲液7和缓冲液8的配方分别见表11和表12，其他条件同基础实施例。
表11 实施例1的缓冲液7配方
原料名称 称取量
Tris-HCl 20g
氯化钠 9.0 g
牛血清白蛋白 20g
蔗糖 35g
酶水解明胶 20g
酶稳定剂 150mL
羟基磷灰石 2g
月桂醇聚氧乙烯醚 1.5g
1M 氯化镁 5mL
1M氯化锌 5mL
PH值 8
纯化水 定容至1000mL
表12 实施例1的缓冲液8配方
原料名称 称取量
十二水合磷酸氢二钠 5.9 g
磷酸二氢钠 0.60 g
氯化钠 5 g
牛血清白蛋白 1.0 g
蔗糖 75 g
2-羟乙基纤维素 6 g
明胶 3.0 g
羟基磷灰石 5.0g
吐温-20 0.1%
PH值 7.0
纯化水 定容至1000mL
实施例2
参照基础实施例设置实施例2，实施例2中的缓冲液7和缓冲液8的配方分别见表13和表14，其他条件同基础实施例。
表13 实施例2的缓冲液7配方
原料名称 称取量
Tris-HCl 3g
氯化钠 9.0 g
牛血清白蛋白 30g
蔗糖 40g
酶水解明胶 15g
酶稳定剂 100mL
羟基磷灰石 5g
月桂醇聚氧乙烯醚 1g
1M 氯化镁 10mL
1M氯化锌 0.2mL
PH值 8.2
纯化水 定容至1000mL
表14 实施例2的缓冲液8配方
原料名称 称取量
十二水合磷酸氢二钠 5.9 g
磷酸二氢钠 0.60 g
氯化钠 8.0 g
牛血清白蛋白 5 g
蔗糖 100 g
2-羟乙基纤维素 10.0g
明胶 10.0 g
羟基磷灰石 8.0g
吐温-20 0.2%
PH值 7.0
纯化水 定容至1000mL
实施例3
参照基础实施例设置实施例3，实施例3中的缓冲液7和缓冲液8的配方分别见表15和表16，其他条件同基础实施例。
表15 实施例3的缓冲液7配方
原料名称 称取量
Tris-HCl 30g
氯化钠 9.0 g
牛血清白蛋白 1g
蔗糖 30g
酶水解明胶 35g
酶稳定剂 200mL
羟基磷灰石 1g
月桂醇聚氧乙烯醚 3g
1M 氯化镁 0.2mL
1M氯化锌 10mL
PH值 7.4
纯化水 定容至1000mL
表16 实施例3的缓冲液8配方
原料名称 称取量
十二水合磷酸氢二钠 5.6 g
磷酸二氢钠 0.55 g
氯化钠 9 g
牛血清白蛋白 10 g
蔗糖 135 g
2-羟乙基纤维素 0.5 g
明胶 20 g
羟基磷灰石 10.0g
吐温20 0.3%
PH值 8.0
纯化水 定容至1000mL
对比例1-6
参照实施例2设置对比例，具体见表17：
表17
对比例6
将专利CN 116990513 A实施例3中的缓冲液7替换为本发明实施例1的缓冲液7，用于检测胃蛋白酶原1。
效果数据：
参照基础实施例对实施例1-3和对比1-6的检测效果进行验证，具体结果见表18：
表18
以上结果表明，本发明实施例1-3的缓冲液在检测胃蛋白酶原II中具有更高的准确度和精密度，由对比例1-3可知，缓冲液内各组分之间具有一定的协同作用；由对比例4可知，缓冲液7和缓冲液8之间也具有协同作用。由对比例6可知，实施例1的缓冲液7用于检测胃蛋白酶原1的效果较差。

Claims (13)

1.一种胃蛋白酶原II检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括酶标试剂的缓冲体系A，所述的缓冲体系A，由以下成分组成：Tris-HCl 3.0-30 g/L；氯化钠7-12g/L；牛血清白蛋白1.0-30g/L；蔗糖30-40g/L；酶水解明胶15-35g/L；酶稳定剂100-200mL/L；羟基磷灰石1.0-5.0g/L；月桂醇聚氧乙烯醚1.0-3.0g/L；1M 氯化镁0.2-10mL/L；1M氯化锌0.2-10mL/L；余量为水；所述缓冲体系pH值7.4-8.2；所述的缓冲体系A用于混合酶标记胃蛋白酶原II抗体偶联物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的缓冲体系A，由以下成分组成：Tris-HCl 20 g/L；氯化钠9.0 g/L；牛血清白蛋白20 g/L；蔗糖35 g/L；酶水解明胶20g/L；酶稳定剂150mL/L；羟基磷灰石2g/L；月桂醇聚氧乙烯醚1.5g/L；1M 氯化镁5mL/L；1M氯化锌5mL/L；余量为水；所述缓冲体系pH值8。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶稳定剂为碱性磷酸酶结合物酶稳定剂。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括磁微粒载体的缓冲体系B，所述的缓冲体系B，由以下成分组成：十二水合磷酸氢二钠5.6-5.9g/L；磷酸二氢钠0.55-0.60g/L；氯化钠5-9g/L；牛血清白蛋白1-10g/L；蔗糖75-135g/L；2-羟乙基纤维素0.5-10g/L；明胶3-20g/L；羟基磷灰石5-20g/L；0.1%-0.3%吐温；余量为水；所述缓冲体系pH值 7.0-8.0。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的缓冲体系B，由以下成分组成：十二水合磷酸氢二钠5.9g/L；磷酸二氢钠0.60g/L；氯化钠5g/L；牛血清白蛋白1g/L；蔗糖75g/L；2-羟乙基纤维素6g/L；明胶3g/L；羟基磷灰石5g/L；0.1%吐温；余量为水；所述缓冲体系pH值7.0。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标记胃蛋白酶原II抗体偶联物中的酶为碱性磷酸酶。
7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述的缓冲体系B用于混合胃蛋白酶原II抗体磁微粒偶联物。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括校准品和/或质控品。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为磁微粒化学发光法定量分析试剂盒。
10.一种缓冲体系在制备萎缩性胃炎诊断试剂盒中的应用，所述的应用包括检测胃蛋白酶原II；所述的缓冲体系包括酶标试剂的缓冲液A，所述的缓冲体系A，由以下成分组成：Tris-HCl 3.0-30g/L；氯化钠7-12 g/L；牛血清白蛋白1.0-30 g/L；蔗糖30-40g/L；酶水解明胶15-35g/L；酶稳定剂100-200mL/L；羟基磷灰石1.0-5.0g/L；月桂醇聚氧乙烯醚1.0-3.0g/L；1M 氯化镁0.2-10mL/L；1M氯化锌0.2-10mL/L；余量为水；所述缓冲体系pH值7.4-8.2；所述的缓冲体系A用于混合酶标记胃蛋白酶原II抗体偶联物。
11.根据权利要求10所述的应用，所述的缓冲体系还包括磁微粒载体的缓冲体系B，所述的缓冲体系B，由以下成分组成：十二水合磷酸氢二钠5.6-5.9g/L；磷酸二氢钠0.55-0.60g/L；氯化钠5-9g/L；牛血清白蛋白1-10 g/L；蔗糖75-135g/L；2-羟乙基纤维素0.5-10g/L；明胶3-20g/L；羟基磷灰石5-20g/L；0.1%-0.3%吐温；余量为水；所述缓冲体系pH值7.0-8.0。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒还包括校准品和/或质控品。
13.根据权利要求10-12任一项所述的应用，其特征在于，所述的萎缩性胃炎为胃窦为主萎缩性胃炎、胃体为主萎缩性胃炎、多灶性萎缩性胃炎或胃萎缩全胃炎。
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