CN112816705A - 人心肌钙蛋白i、人生长分化因子15以及人d二聚体的三联检测层析试纸条及其应用 - Google Patents

人心肌钙蛋白i、人生长分化因子15以及人d二聚体的三联检测层析试纸条及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人心肌钙蛋白I(cTnI)、人生长分化因子15(GDF‑15)以及人D二聚体(DD)的三联检测层析试纸条及其应用，所述的试纸条包括底板以及依次设在所述底板上的加样垫、结合垫、检测垫以及吸水垫，所述结合垫上包载有分别标记鼠抗GDF‑15、cTnI以及DD单克隆抗体的免疫荧光微球以及标记兔IgG的免疫荧光微球，所述的检测线上包被有鼠抗GDF‑15、cTnI以及DD的单克隆捕获抗体，所述的质检线上包被有羊抗兔IgG多抗。本发明通过对制备方法进行改进，改善了试纸条在采用荧光定量法检测三种标志物的灵敏度和特异性，为心肌功能的检测提供了新的技术手段。

Description

人心肌钙蛋白I、人生长分化因子15以及人D二聚体的三联检 测层析试纸条及其应用
技术领域
本发明涉及一种荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用，特别涉及一种用于检测人心肌钙蛋白I、人生长分化因子15以及人D二聚体的三联检测层析试纸条及其制备方法和应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
传统心肌功能三项联检(肌红蛋白(Myo)、肌钙蛋白(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB))以其快速、定量、同步检测为主要优势，对于急性心肌梗死(AMI)的辅助诊断及风险分层提供巨大帮助。然而cTnI虽用于急性心肌梗死(AMI)的早期诊断敏感性高，但特异性差，在应激性心肌病、病毒性心肌炎、脓毒症心肌损害等各种原因引起的心肌受损cTnI均有不同程度升高。其次，ACS生物标志物如肌钙蛋白(cTn)、肌酸激酶同工酶(CK-MB) 在敏感性、特异性方面仍存在不足。
公开号为CN108303551A的专利申请公开了一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒及制法，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土Eu3+荧光微球标记的抗人心肌肌钙蛋白I (cTnI)、抗肌红蛋白(MYO)、抗肌酸激酶同工酶(CKMB)三种单克隆抗体-微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为150nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素Eu3+，在基态下稳定，在337nm激发光源作用下发射出波长 615nm的荧光：所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，分别来源于针对2-6个不同人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶等抗原表位的单克隆抗体细胞株。然而，cTnI、CKMB、MYO三项联检试剂盒并不能满足临床需求。直接采用其技术制备cTnI/GDF15/DD三联卡，存在特异性差、重复性差的问题。
为此，本发明提供了一种人心肌钙蛋白I、人生长分化因子15以及人D 二聚体的三联检测层析试纸条及其制备方法，采用最新的心血管疾病生物标志物人生长分化因子-15(GDF-15)替代了特异性较差的肌红蛋白和抗肌酸激酶同工酶，同时增加了筛查肺功能的D二聚体项目，可以作为更为特异的心肺联检产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人心肌钙蛋白I(cTnI)、人生长分化因子15 (GDF-15)以及人D二聚体(DD)的三联检测层析试纸条及其制备方法，该试纸条可以在荧光免疫分析上使用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种人心肌钙蛋白I(cTnI)、人生长分化因子15(GDF-15) 以及人D二聚体(DD)的三联检测层析试纸条，所述的试纸条包括底板以及依次设在所述底板上的加样垫、结合垫、检测垫以及吸水垫，加样垫与结合垫搭接，检测垫与结合垫搭接，吸水垫与检测垫搭接，检测垫上设置有三条检测线和一条质检线，检测线位于加样垫一端，质检线位于远离加样垫一端，所述结合垫上包载有分别标记鼠抗人心肌钙蛋白I单克隆抗体、鼠抗人生长分化因子-15单克隆抗体以及鼠抗人D二聚体单克隆抗体的免疫荧光微球以及标记兔IgG的免疫荧光微球，所述的三条检测线上分别包被有鼠抗人心肌钙蛋白I单克隆捕获抗体、鼠抗人生长分化因子-15单克隆捕获抗体以及鼠抗人 D二聚体单克隆捕获抗体，所述的质检线上包被有羊抗兔IgG多抗，标记免疫荧光微球所使用的单克隆抗体与相应的检测线上包被的单克隆捕获抗体为具有不同抗原识别表位的单克隆抗体，且与相应的检测物能够形成抗体-抗原- 抗体形式的复合物。
其中，优选的，所述的标记免疫荧光微球所使用的鼠抗人心肌钙蛋白I 单克隆抗体以及检测线上包被的鼠抗人心肌钙蛋白I单克隆捕获抗体的货号分别为MA1-20112、MA1-20118，购自Thermo Scientific；所述的标记免疫荧光微球所使用的鼠抗人生长分化因子-15单克隆抗体以及检测线上包被的鼠抗人生长分化因子-15单克隆捕获抗体的货号分别为ab105732，ab106112，购自ABCAM公司；所述的标记免疫荧光微球所使用的鼠抗人D二聚体单克隆抗体以及检测线上包被的鼠抗人D二聚体单克隆捕获抗体的货号分别为ABS 015-22-02、ABS 015-28-02，购自Thermo Scientific。
其中，优选的，所述的免疫荧光微球为表面修饰有羧基的直径为100～ 400nm的荧光微球，优选直径为200nm的荧光微球。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述的三联检测层析试纸条的方法，包括以下步骤：
(1)鼠抗人cTnI、GDF15、DD单克隆抗体与荧光微球的偶联及结合垫的制备
荧光微球经过活化，洗涤后，分别加入鼠抗人cTnI、GDF15或DD的单克隆抗体，进行偶联和封闭，然后洗涤除去未结合的抗体，加入保存液保存，用微球缓冲液稀释后喷涂于聚酯膜上制作为结合垫，烘箱烘干，保存待用；
(2)鼠抗人cTnI、GDF15、DD单克隆捕获抗体的包被及检测垫的制备
将鼠抗人cTnI、GDF15、DD单克隆捕获抗体分别配制成浓度为 0.3mg/ml-0.6mg/ml的cTnI检测线工作液，浓度为0.5mg/ml-1.0mg/ml的GDF15 检测线工作液，浓度为0.6mg/ml-0.9mg/ml的DD检测线工作液；分别取cTnI、 GDF15、DD检测线工作液用划膜仪点在硝酸纤维素膜中央,按照cTnI、 GDF15、DD的顺序划线，每两个项目的检测线之间间隔3-5mm，将划好线的硝酸纤维素膜干燥保存待用；
(3)组装
将检测垫、结合垫、加样垫、吸水纸，按权利要求1中的固定顺序贴在底板上，组装成试纸大板，在干燥条件下储存备用；
(5)切割
将组装好的试纸大板用切条机切割成宽度4mm±0.05mm的试纸条，在干燥条件下储存备用。
所述的方法中，优选的，步骤(1)中所述的保存液中含有NaH2PO4·2H2O 0.0593g/dL、NaH2PO4·12H2O 0.58g/dL、NaCl 0.85g/dL、蔗糖1g/dL、牛血清白蛋白(BSA)0.5g/dL、吐温20(Tween-20)50μl/dL、Proclin-300100μl/dL, pH 7.3。
所述的方法中，优选的，步骤(1)中所述的微球缓冲液为含有TRIS 30-100mM、BSA2-6g/dL、蔗糖10-30g/dL、D海藻糖3-8g/dL，pH值8.0±0.1 的微球缓冲液，或是将TRIS替换为TAPS(三羟甲基甲胺基丙磺酸)、Bicine N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、Tricine N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸中的一种或几种及/或将BSA替换为γ球蛋白、酪蛋白得到的缓冲液，其中，优选的，蔗糖与 D海藻糖的质量比例为1:1～5:1，更优选为3:1。
所述的方法中，优选的，所述的微球缓冲液中含有：TRIS 0.605g/dL、BSA 5g/dL、蔗糖15g/dL、D海藻糖5g/dL，pH值8.0±0.1。
所述的方法中，优选的，步骤(2)中是用包被缓冲液将鼠抗人cTnI、 GDF15、DD单克隆捕获抗体分别配制成浓度为0.3mg/ml-0.6mg/ml的cTnI检测线工作液，浓度为0.5mg/ml-1.0mg/ml的GDF15检测线工作液，浓度为 0.6mg/ml-0.9mg/m的lDD检测线工作液，其中所述的包被缓冲液中含有磷酸二氢钠0.01-0.05、磷酸氢二钠0.1-0.5g/dL、D海藻糖1-5g/dL、月桂醇聚氧乙烯醚(Brij-35)0.1-0.5g/dL、NaCl 0.5-1.0g/dL，pH 7.3，或是将其中的Brij35替换为TrionX100、TritonX114、Thesit、Tween20其中一种或几种及/或将海藻糖替换为蔗糖、甘露醇或乳糖其中一种或几种得到的包被缓冲液，更优选的，所述的包被缓冲液中含有磷酸二氢钠0.0296g/dL、磷酸氢二钠0.29g/dL、 D海藻糖1g/dL、月桂醇聚氧乙烯醚(brij-35)0.1g/dL、NaCl 0.88g/dL，pH 7.3；步骤(2)中是将划好线的硝酸纤维素膜胶板放入真空冷冻干燥机中，-40℃预冷2小时后，开启真空泵，在30pa以下持续6小时后取出，然后将经过冷冻干燥的硝酸纤维素膜胶板在湿度不大于40％，温度18～37℃的环境下干燥至少2小时后，在干燥条件下密封储存备用。
所述的方法中，优选的，还包括将切割完成的试纸条嵌入单孔试纸条盒中，轧紧，制成试纸条，每块试纸条装入一个铝箔袋中，同时放入干燥剂一包，用封口机封口。
更进一步的，本发明还提出了所述的三联检测层析试纸条在制备同时检测人心肌钙蛋白I(cTnI)、人生长分化因子15(GDF-15)以及人D二聚体 (DD)试剂中的应用。
本发明的试纸条的检测原理是：当样品滴加到检测卡加样孔后，样本中人生长分化因子15(GDF15)、肌钙蛋白I(cTnI)和D二聚体(DD)和结合垫中的荧光物质标记的GDF-15单克隆抗体、cTnI单克隆抗体、D二聚体结合形成反应复合物，反应复合物随层析作用沿着硝酸纤维(NC)膜前移，被硝酸纤维(NC)膜检测线上的对应单克隆抗体捕获，形成复合物。样本中的cTnI、GDF15、DD的捕获量与检测区信号强度正相关，在激发光源的作用下，荧光物质发射特定波长的荧光信号，荧光免疫分析仪俘获荧光信号，通过信号转化及设定的定标曲线自动转化为定量数值，计算出样本中的cTnI、 GDF15、DD浓度，实现血清、血浆或全血样本中的cTnI、GDF15、DD的定量检测。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、按照常规的制备方法按照上述原理生产荧光检测试纸条，可用于cTnI、 GDF15、DD的检测，但制备的产品特异性和灵敏度均不佳。故本发明采用专门的包被缓冲液用于检测垫的制备，并且通过冷冻干燥的方法，降低了不同检测项目之间检测信号的干扰，提高了产品的检测特异性。
2、基于免疫荧光定量技术制作试纸条，选择检测灵敏度好的羧基荧光微球(激发光365nm，发射光610nm)，通过对荧光微球粒径和制作检测垫时的包被缓冲液的筛选，获得了特异性高、灵敏度好、检测速度快的检测试纸条，可同时实现cTnI、GDF15、DD三个血清标志物的检测，为心肌功能的检测提供了新的技术手段。
附图说明
图1为试纸条组装示意图；
图2为试纸条组装示意图；
图3-9分别采用实施例1以及2制备得到的试纸条对7个样本的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1、人心肌钙蛋白I、人生长分化因子15以及人D二聚体的三联检测层析试纸条的制备
1、实验材料：鼠抗人GDF-15单克隆抗体[23G10.F8]、[7C12.B3.F2](购自ABCAM公司，货号：ab105732，ab106112)，鼠抗人DD单克隆抗体(Thermo Scientific货号ABS 015-22-02、货号ABS 015-28-02)、鼠抗人cTnI单克隆抗体(Thermo Scientific货号MA1-20112、货号MA1-20118)、硝酸纤维素膜、吸水纸、加样垫、6cm×30cm PVC板，兔IgG(SIGMA，货号I5006)，羊抗兔IgG(Thermo Scientific，货号A32731)表面修饰有羧基的200nm荧光微球(1.02g/100g，购于Thermo Scientific，货号93470520010150)、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES，购自SIGMA公司)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，购自SIGMA 公司)，吐温-20(购自BBI公司)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，购自SIGMA公司)。
2、鼠抗人心肌钙蛋白I、人生长分化因子15以及人D二聚体单抗与荧光微球的偶联及结合垫的制备
利用EDC/NHS制备检测GDF-15的免疫荧光微球悬浮液，包括活化、偶联、封闭、保存几个步骤，流程如下：
(1)标记GDF-15单克隆抗体的荧光微球的制备
荧光微球初洗：
取100μl固含物为1％的0.2μm荧光微球(Thermo)加入离心管中，并向离心管中加入900μl活化缓冲液(MES 1.95g/dL)，使用漩涡混合器震荡混匀 30s。4℃13000rpm离心10min，吸去上清。
荧光微球活化：
加入1ml活化缓冲液(MES 1.95g/dL)，超声重悬后加入50μl(20mg/ml) EDC和50μl(20mg/ml)NHS，使用漩涡混合器震荡混匀后室温旋转反应30min，将活化后的微球4℃13000rpm离心10min，吸去上清。
鼠抗人生长分化因子15单克隆抗体标记：
加入1ml标记缓冲液(硼酸0.62g/dL、十水硼砂0.955g/L，pH 8.0)超声重悬活化后的微球，4℃13000rpm离心10min，吸去上清。再加入1ml标记缓冲液超声重悬后，加入80ug鼠抗人GDF15单克隆抗体[23G10.F8]，室温旋转反应2小时。
荧光微球封闭：
加入100μl封闭液(BSA0.5g/dL、乙醇胺0.2ml/dL、Proclin-3000.2ml/dL)，室温旋转反应30min。4℃13000rpm离心10min，去上清液。
荧光微球终洗：
加入1ml清洗液(BSA0.5g/dL、吐温20100ul/dL、Proclin-300100ul/dL) 超声重悬封闭后的微球，4℃13000rpm离心10min，吸去上清。重复上述步骤(共两次)。沉淀中加入100μl保存缓冲液(NaH2PO4·2H2O 0.0593g/dL、 Na2HPO4·12H2O 0.58g/dL、NaCl 0.85g/dL、蔗糖1g/dL、牛血清白蛋白(BSA) 0.5g/dL、吐温20(Tween-20)50μl/dL、Proclin-300100μl/dL,pH 7.3)，超声重悬后冰箱2～8℃冷藏待用。
(2)标记cTnI单克隆抗体的荧光微球的制备
荧光微球的洗涤、活化步骤同(1)。
cTnI单克隆抗体的标记
加入1ml标记缓冲液(硼酸0.62g/dL、十水硼砂0.955g/L，pH 8.0)超声重悬活化后的微球，4℃13000rpm离心10min，吸去上清。再加入1ml标记缓冲液超声重悬后，加入60ug鼠抗人cTnI单克隆抗体(货号MA1-20112)，室温旋转反应2小时。
荧光微球封闭、终洗同(1)。
(3)D二聚体单克隆抗体标记
荧光微球的洗涤、活化步骤同(1)。
D二聚体单克隆抗体的标记
加入1ml标记缓冲液(硼酸0.62g/dL、十水硼砂0.955g/L，pH 8.0)超声重悬活化后的微球，4℃13000rpm离心10min，吸去上清。再加入1ml标记缓冲液超声重悬后，加入80ug鼠抗人D二聚体单克隆抗体(货号ABS 015-22-02)，室温旋转反应2小时。
荧光微球封闭、终洗同(1)。
(4)标记兔IgG的荧光微球的制备
荧光微球的洗涤、活化步骤同(1)。
兔IgG标记：
加入1ml标记缓冲液(硼酸0.62g/dL、十水硼砂0.955g/L，pH 8.0)超声重悬活化后的微球，4℃13000rpm离心10min，吸去上清。再加入1ml标记缓冲液超声重悬活化后的微球后加入80ug兔IgG抗体，室温旋转反应2 小时。
荧光微球封闭、终洗同(1)。
(5)结合垫的制作
取50μl标记好的鼠抗人cTnI单克隆抗体、50ul标记好的鼠抗人GDF-15 单克隆抗体、50ul标记好的鼠抗人D二聚体单克隆抗体和40μl标记好的兔IgG 加入到4810μl微球缓冲液中，使用漩涡混合器震荡混匀。用点金标机以合适的量(点金标机参数为喷量5.0μl/cm，长度300mm)喷在聚酯膜上，在湿度不大于40％，温度18～37℃环境下干燥至少2小时后，在干燥条件下密封储存备用。
微球缓冲液配方为：TRIS 0.605g/dL、BSA5g/dL、蔗糖15g/dL、D海藻糖5g/dL，pH值8.0±0.1。
3、鼠抗人心肌钙蛋白I、人生长分化因子15以及人D二聚体单抗包被及检测垫的制备
(1)检测线工作液的配制
用包被缓冲液(磷酸二氢钠0.0296g/dL、磷酸氢二钠0.29g/dL、D海藻糖1g/dL，pH7.3)将鼠抗人cTnI单克隆抗体(货号MA1-20118)稀释至 0.4mg/mL，冷藏备用。
用包被缓冲液(磷酸二氢钠0.0296g/dL、磷酸氢二钠0.29g/dL、D海藻糖1g/dL，pH7.3)将鼠抗人GDF-15单克隆抗体[7C12.B3.F2]稀释至 0.6mg/mL，冷藏备用。
用包被缓冲液(磷酸二氢钠0.0296g/dL、磷酸氢二钠0.29g/dL、D海藻糖1g/dL，pH7.3)将鼠抗人D二聚体单克隆抗体(货号ABS 015-28-02)稀释至0.7mg/mL，冷藏备用。
(2)质检线工作液的配制
用包被缓冲液(磷酸二氢钠0.0296g/dL、磷酸氢二钠0.29g/dL、D海藻糖1g/dLpH7.3)将羊抗兔IgG稀释至1mg/mL，冷藏备用。
(3)检测垫的制备
将硝酸纤维素膜贴在PVC底板上，形成复合好的硝酸纤维素膜胶板。取检测线工作液和质检线工作液用划膜仪分别点在同一张膜中央，使用标准板校准，质检线(C)距离底板上端32mm，DD检测线(T1)距离底板上端36mm，cTnI检测线(T2)距离底板上端40mm、GDF-15检测线(T3)距离底板上端 44mm(PVC板空白较宽一侧为上端)。点样量均为1.0μl/cm。两条线间距为 4mm，当场标明检测线和质检线位置并标示不好的线条；将硝酸纤维素膜胶板在湿度不大于40％，温度18～37℃的环境下干燥至少2小时后，在干燥条件下密封储存备用。
4、组装，制备检测试纸条
(a)样品垫为未处理过的玻璃纤维。取规格为200×300mm的样品垫，裁成规格为20mm×300mm的长条
(b)取规格为200×300mm的吸水垫，裁成规格为28mm×300mm的长条。
(c)取结合垫，裁成规格为6.5mm×305mm的长条。
(d)取包被好的检测膜板(PVC板空白较宽一侧为上方，PVC板空白较窄一侧为下方)，将上方的防粘纸揭掉，取28mm×300mm的长条吸水垫贴于检测膜板的上方，其上端与底板上边缘齐平，下端压于反应膜上，重叠2mm。将中底板下方的防粘纸揭掉，规格为9mm×305mm的结合垫贴于底板下方，且上压于检测垫，重叠1mm。取规格为20mm×300mm的样品垫，贴于底板下方，下端与底板下边缘齐平，上端压于结合垫的下端，重叠1mm。组装示意图如图1所示。
(5)切割，制备单条检测试纸条
将组装好的试纸大板用切条机切割成宽度4mm(±0.05mm)的检测试纸条，在干燥条件下储存备用。
(6)装卡，制备试纸条
将切割好的试纸条嵌入单孔试纸条盒中，加样垫(A区)放在试纸条外壳有加样孔的一端。轧紧，制成试纸条。每块试纸条装入一个铝箔袋中，同时放入干燥剂一包，用封口机封口。试纸条示意图如图2所示。
将制备好的检测试纸放入试纸条内，加样垫(A区)放在试纸条外壳有加样孔的一端。
当样品滴加到试纸条加样区的小孔后，样本中cTnI、GDF15、DD在层析作用下泳动到B区，在B区和结合垫中的包被在荧光微球表面的鼠抗抗人 cTnI、GDF15、DD单克隆抗体结合形成反应复合物，反应复合物随层析作用进入C区，沿着C区的硝酸纤维(NC)膜前移，被硝酸纤维(NC)膜检测线上的对应单克隆抗体捕获，形成复合物。样本中的cTnI、GDF15、DD的捕获量与检测区信号强度正相关，在激发光源的作用下，荧光微球发射特定波长的荧光信号，荧光免疫分析仪俘获荧光信号，通过信号转化及设定的定标曲线自动转化为定量数值，计算出样本中cTnI、GDF15、DD的浓度，实现血清、血浆或全血样本中的cTnI、GDF15、DD的定量检测。
实施例2、人心肌钙蛋白I、人生长分化因子15以及人D二聚体的三联检测层析试纸条的制备
除检测垫的制作外，其余步骤与实施例1相同
检测垫的制备：
(a)检测线工作液的配制
同实施例1，但将原包被缓冲液变更为含有磷酸二氢钠0.0296g/dL、磷酸氢二钠0.29g/dL、D海藻糖1g/dL、月桂醇聚氧乙烯醚(brij-35)0.1g/dL、 NaCl 0.88g/dL，pH 7.3的包被缓冲液。
(b)质检线工作液的配制
同实施例1，但将原包被缓冲液变更为含有磷酸二氢钠0.0296g/dL、磷酸氢二钠0.29g/dL、D海藻糖1g/dL、月桂醇聚氧乙烯醚(brij-35)0.1g/dL、 NaCl 0.88g/dL，pH 7.3的包被缓冲液。
(c)检测垫的制备
将硝酸纤维素膜贴在PVC底板上，形成复合好的硝酸纤维素膜胶板。
取检测线工作液和质检线工作液用划膜仪分别点在同一张膜中央，使用标准板校准，质检线距离底板上端32mm，DD检测线距离底板上端36mm， cTnI检测线距离底板上端40mm，GDF15检测线距离底板上端44mm。(PVC 板空白较宽一侧为上端)，点样量均为1.0μl/cm。两条线间距为4mm，当场标明检测线和质检线位置并标示不好的线条；将划好线的硝酸纤维素膜胶板放入真空冷冻干燥机中。-40度预冷2小时后，开启真空泵，在30pa以下持续6小时后取出。将经过冷冻干燥的硝酸纤维素膜胶板在湿度不大于40％，温度18～37℃的环境下干燥至少2小时后，在干燥条件下密封储存备用。
实施例3人心肌钙蛋白I、人生长分化因子15以及人D二聚体的三联检测层析试纸条的性能评估
1、实验材料及检测设备
重组人GDF-15(购自ABCAM公司，货号：ab50077)、重组人cTnI(购自ABCAM公司，ab207624))、人DD(购自ABCAM公司，ab98311)。
干式荧光免疫分析仪(AFS-1000)广州蓝勃生物科技有限公司。
2、检测方法
吸取100μl待测样本(血清、血浆)加入测试卡的加样孔里。取样时注意不要吸入气泡，在室温下放置15min。
将测试卡插入到荧光免疫分析仪的测试卡槽架中，按测试键，仪器将自动对测试卡进行扫描(注意确保测试卡方向正确并将其完全推入)。
从荧光免疫分析仪的显示荧幕上读取/打印检测结果。
取出用过的试纸条，按潜在生物危害的物品来处理。
3、检测峰的观察
实验材料：利用PBS+BSA稀释，制备以下样品：获得终浓度为cTnI 40ng/mL、GDF155000pg/ml、DD 15mg/L的样品，如下表1所示。
表1样品制作
GDF15 cTnI DD
样本1 0 40ng/mL 0
样本2 5000pg/ml 0 0
样本3 0 0 15mg/L
样本4 5000pg/ml 40ng/mL 0
样本5 0 40ng/mL 15mg/L
样本6 5000pg/ml 0 15mg/L
样本7 5000pg/ml 40ng/mL 15mg/L
在干式荧光免疫分析仪(AFS-1000)上用实施1和实施例2制备的试纸条测定上述样本的荧光信号，结果如图3-9所示：
X轴为仪器步进，即三个检测峰由下而上的位置。纵坐标为荧光值。其中从左向右峰1为GDF15检测峰，峰2为cTnI的检测峰，峰3为DD检测峰，峰4为质控检测峰。
实施例1制作的试纸条，检测峰跨度较宽，测定单一项目时效果尚可，但当样本中三种待测物均存在时存在相互干扰，各峰之间存在相互干扰。采用实施例2的试纸条后，各检测峰可明显区分，可以用于同时测定三个项目的含量。其原因可能有二。一是包被缓冲液成分的优化减少了反应过程中的 NC膜对蛋白的非特异性吸附，二是划线后的NC膜干燥方法的改进，减少了检测线和质检线在干燥过程中的扩散，使检测峰收窄，减少了彼此之间的相互干扰。
4、实施例2试纸条的性能测定
对实施例2制作的试纸条进行性能测定，具体如下：
(1)实验方法
将cTnI标准品利用PBS+BSA稀释，得到终浓度分别为0.05、0.1、1、5、10、25、40ng/mL的标准品溶液，分别取上述标准品溶液100μL加样至试纸条的加样孔，放置15分钟内后进行检测。用仪器检测检测线和控制线上的荧光信号。以荧光信号和cTnI浓度为参数，做定量检测标准曲线，检测样品浓度。
将GDF-15标准品利用PBS+BSA稀释，得到终浓度分别为100、250、500、 1000、2500和5000pg/ml的标准品溶液，分别取上述标准品溶液100μL加样至试纸条的加样孔，放置15分钟内后进行检测。用仪器检测检测线和控制线上的荧光信号。以荧光信号和GDF-15浓度为参数，做定量检测标准曲线，检测样品浓度。
将DD标准品利用PBS+BSA稀释，得到终浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、 2、5、10、15mg/L的标准品溶液，分别取上述标准品溶液100μL加样至试纸条的加样孔，放置15分钟内后进行检测。用仪器检测检测线和控制线上的荧光信号。以荧光信号和DD浓度为参数，做定量检测标准曲线，检测样品浓度。
(2)校准曲线
各浓度cTnI标准品的检测结果如下表2所示：
表2 cTnI校准曲线
Figure BDA0002877012470000121
Figure BDA0002877012470000131
X1：检测线荧光信号值X2:质检线荧光信号值
得到的各浓度值对应的荧光值结果如下表3所示：
表3
Figure BDA0002877012470000142
校准方程：
y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D
A＝319.44442
B＝-0.80188
C＝28919.82132
D＝0.00131
r^2＝0.99667
各浓度GDF-15标准品的检测结果如下表4所示：
表4 GDF-15标准品的检测结果
Figure BDA0002877012470000141
Figure BDA0002877012470000151
X1：检测线荧光信号值X2:质检线荧光信号值
得到的各浓度值对应的荧光值结果如下表5所示：
表5
浓度值(pg/mL) 100 250 500 1000 2500 5000
荧光值 0.01121 0.0146 0.07767 0.31348 0.69776 1.10999
校准方程：
方程:y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D
A＝1.69968
B＝-1.35488
C＝3103.57660
D＝-0.02608
r^2＝0.99710
各浓度DD标准品的检测结果如下表6所示：
表6 DD标准品的检测结果
Figure BDA0002877012470000152
Figure BDA0002877012470000161
X1：检测线荧光信号值X2:质检线荧光信号值
得到的各浓度值对应的荧光值结果如下表7所示：
表7
Figure BDA0002877012470000162
校准方程：
y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D
A＝8.72224
B＝-0.87014
C＝178.18134
D＝0.00558
r^2＝0.99987
(3)人血浆样本检测
用上述校准曲线检测160例正常人血浆样本，95百分位点确定参考范围，故确定cTnI在血浆中的参考范围为小于1ng/mL，GDF15在血浆的参考范围为小于900pg/mL。DD在血浆中的参考范围为小于0.5mg/L。
检测原始数据如下表8所示：
表8正常人血浆中cTnI(ng/ml)、GDF15(pg/mL)、DD(mg/L)的浓度
Figure BDA0002877012470000171
Figure BDA0002877012470000181
Figure BDA0002877012470000191

Claims (10)

1.一种人心肌钙蛋白I(cTnI)、人生长分化因子15(GDF-15)以及人D二聚体(DD)的三联检测层析试纸条，其特征在于，所述的试纸条包括底板以及依次设在所述底板上的加样垫、结合垫、检测垫以及吸水垫，加样垫与结合垫搭接，检测垫与结合垫搭接，吸水垫与检测垫搭接，检测垫上设置有三条检测线和一条质检线，检测线位于加样垫一端，质检线位于远离加样垫一端，所述结合垫上包载有分别标记鼠抗人心肌钙蛋白I单克隆抗体、鼠抗人生长分化因子-15单克隆抗体以及鼠抗人D二聚体单克隆抗体的免疫荧光微球以及标记兔IgG的免疫荧光微球，所述的三条检测线上分别包被有鼠抗人心肌钙蛋白I单克隆捕获抗体、鼠抗人生长分化因子-15单克隆捕获抗体以及鼠抗人D二聚体单克隆捕获抗体，所述的质检线上包被有羊抗兔IgG多抗，标记免疫荧光微球所使用的单克隆抗体与相应的检测线上包被的单克隆捕获抗体为具有不同抗原识别表位的单克隆抗体，且与相应的检测物能够形成抗体-抗原-抗体形式的复合物。
2.如权利要求1所述的三联检测层析试纸条，其特征在于，所述的标记免疫荧光微球所使用的鼠抗人心肌钙蛋白I单克隆抗体以及检测线上包被的鼠抗人心肌钙蛋白I单克隆捕获抗体的货号分别为MA1-20112、MA1-20118，购自Thermo Scientific；所述的标记免疫荧光微球所使用的鼠抗人生长分化因子-15单克隆抗体以及检测线上包被的鼠抗人生长分化因子-15单克隆捕获抗体的货号分别为ab105732，ab106112，购自ABCAM公司；所述的标记免疫荧光微球所使用的鼠抗人D二聚体单克隆抗体以及检测线上包被的鼠抗人D二聚体单克隆捕获抗体的货号分别为ABS 015-22-02、ABS 015-28-02，购自Thermo Scientific。
3.如权利要求1所述的三联检测层析试纸条，其特征在于，所述的免疫荧光微球为表面修饰有羧基的直径为100～400nm的荧光微球，优选直径为200nm的荧光微球。
4.一种制备权利要求1-3任一项所述的三联检测层析试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)鼠抗人cTnI、GDF15、DD单克隆抗体与荧光微球的偶联及结合垫的制备
荧光微球经过活化，洗涤后，分别加入鼠抗人cTnI、GDF15或DD的单克隆抗体，进行偶联和封闭，然后洗涤除去未结合的抗体，加入保存液保存，用微球缓冲液稀释后喷涂于聚酯膜上制作为结合垫，烘箱烘干，保存待用；
(2)鼠抗人cTnI、GDF15、DD单克隆捕获抗体的包被及检测垫的制备
将鼠抗人cTnI、GDF15、DD单克隆捕获抗体分别配制成浓度为0.3mg/ml-0.6mg/ml的cTnI检测线工作液，浓度为0.5mg/ml-1.0mg/ml的GDF15检测线工作液，浓度为0.6mg/ml-0.9mg/ml的DD检测线工作液；分别取cTnI、GDF15、DD检测线工作液用划膜仪点在硝酸纤维素膜中央,按照cTnI、GDF15、DD的顺序划线，每两个项目的检测线之间间隔3-5mm，将划好线的硝酸纤维素膜干燥保存待用；
(3)组装
将检测垫、结合垫、加样垫、吸水纸，按权利要求1中的固定顺序贴在底板上，组装成试纸大板，在干燥条件下储存备用；
(4)切割
将组装好的试纸大板用切条机切割成宽度4mm±0.05mm的试纸条，在干燥条件下储存备用。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的保存液中含有NaH2PO4·2H2O 0.0593g/dL、NaH2PO4·12H2O 0.58g/dL、NaCl 0.85g/dL、蔗糖1g/dL、牛血清白蛋白(BSA)0.5g/dL、吐温20(Tween-20)50μl/dL、Proclin-300100μl/dL,pH 7.3。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的微球缓冲液为含有TRIS30-100mM、BSA2-6g/dL、蔗糖10-30g/dL、D海藻糖3-8g/dL，pH值8.0±0.1的微球缓冲液，或是将TRIS替换为TAPS(三羟甲基甲胺基丙磺酸)、Bicine N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、TricineN-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸中的一种或几种及/或将BSA替换为γ球蛋白、酪蛋白得到的缓冲液，其中，优选的，蔗糖与D海藻糖的质量比例为1:1～5:1，更优选为3:1。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的微球缓冲液中含有：TRIS 0.605g/dL、BSA5g/dL、蔗糖15g/dL、D海藻糖5g/dL，pH值8.0±0.1。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中是用包被缓冲液将鼠抗人cTnI、GDF15、DD单克隆捕获抗体分别配制成浓度为0.3mg/ml-0.6mg/ml的cTnI检测线工作液，浓度为0.5mg/ml-1.0mg/ml的GDF15检测线工作液，浓度为0.6mg/ml-0.9mg/m的lDD检测线工作液，其中所述的包被缓冲液中含有磷酸二氢钠0.01-0.05、磷酸氢二钠0.1-0.5g/dL、D海藻糖1-5g/dL、月桂醇聚氧乙烯醚(Brij-35)0.1-0.5g/dL、NaCl 0.5-1.0g/dL，pH 7.3，或是将其中的Brij35替换为TrionX100、TritonX114、Thesit、Tween20其中一种或几种及/或将海藻糖替换为蔗糖、甘露醇或乳糖其中一种或几种得到的包被缓冲液，优选的，所述的包被缓冲液中含有磷酸二氢钠0.0296g/dL、磷酸氢二钠0.29g/dL、D海藻糖1g/dL、月桂醇聚氧乙烯醚(brij-35)0.1g/dL、NaCl 0.88g/dL，pH 7.3；步骤(2)中是将划好线的硝酸纤维素膜胶板放入真空冷冻干燥机中，-40℃预冷2小时后，开启真空泵，在30pa以下持续6小时后取出，然后将经过冷冻干燥的硝酸纤维素膜胶板在湿度不大于40％，温度18～37℃的环境下干燥至少2小时后，在干燥条件下密封储存备用。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括将切割完成的试纸条嵌入单孔试纸条盒中，轧紧，制成试纸条，每块试纸条装入一个铝箔袋中，同时放入干燥剂一包，用封口机封口。
10.权利要求1-3任一项所述的三联检测层析试纸条在制备同时检测人心肌钙蛋白I(cTnI)、人生长分化因子15(GDF-15)以及人D二聚体(DD)试剂中的应用。
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