CN111638364A - Gdf15快速定量荧光微球检测装置及其制备方法 - Google Patents

Gdf15快速定量荧光微球检测装置及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111638364A
CN111638364A CN202010370054.2A CN202010370054A CN111638364A CN 111638364 A CN111638364 A CN 111638364A CN 202010370054 A CN202010370054 A CN 202010370054A CN 111638364 A CN111638364 A CN 111638364A
Authority
CN
China
Prior art keywords
concentration
gdf15
antibody
immunofluorescence
polyethylene glycol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010370054.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111638364B (zh
Inventor
杨小军
李欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Grist Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jilin Grist Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Grist Biotechnology Co ltd filed Critical Jilin Grist Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010370054.2A priority Critical patent/CN111638364B/zh
Publication of CN111638364A publication Critical patent/CN111638364A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111638364B publication Critical patent/CN111638364B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明涉及一种GDF15快速定量荧光微球检测装置及其制备方法，属于医疗检测领域。由固相有GDF15抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸附有荧光微球标记GDF15抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。采用聚乙二醇丙三醇处理液对硝酸纤维素膜进行预处理，将GDF15抗体先与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合再吸附到硝酸纤维素膜上，并配制合适的缓冲液和样品垫处理液，在保证免疫荧光微球释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫荧光微球的用量，节约成本，又没有增加生产操作的复杂度。检测试纸灵敏度高、特异性强、操作简便省时、实用性强。

Description

GDF15快速定量荧光微球检测装置及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗检测设备领域，特别涉及GDF15快速定量荧光微球检测装置及其制备方法，利用荧光免疫层析技术以及竞争法原理定量检测全血、血清、血浆和相关液体标本中GDF15含量的检测装置及其制备方法，可实现GDF15的快速检测，且灵敏度高、特异性强。
背景技术
在医学领域，对机体发生的异常情况进行精准预警和评估，一直是医学工作者研究和攻克的主要课题之一；比如正常生理情况下，人体会发生什么风险；比如病理情况下，如何及早精准预警、如何精准评估疾病转归或者发展等；因此通过一个有效的标志物检测，进而实现上述目标，是非常必要的。
生长分化因子15(GDF15)是转化生长因子β家族一个类型，由于广泛存在各类细胞,导致其专业命名的多样性，又称前列腺衍生因子(PDF)、胎盘转化生长因子β(PTGFβ)、胎盘骨形态发生蛋白(PLAB)、非甾体抗炎药激活基因-1(NAG-1)、巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)。GDF15在全血、血清、血浆和相关液体中很容易检测到，在生理状态下，有些情况下GDF15会出现升高，及时监测便于对发生异常情况风险进行有效、及时预警；此外，GDF15浓度在很多病理条件下也会升高，例如：心肌梗塞和心衰等心脏损伤性疾病、肿瘤、炎症、急慢性疾病、青光眼等。
在生理条件下，胎盘是唯一能大量表达GDF15的组织；GDF15位于胎盘和胎膜上,这表明其在母-胎界面起作用；它可能通过抑制子宫中的促炎细胞因子和提高、或者提高半同种异体胎儿免疫耐受来支持胎儿存活。也有研究证明GDF15通过抑制外周血单核细胞增殖起免疫抑制的作用并诱导在CD4+、CD25+细胞forkhead box protein3的表达；妊娠特征性的高GDF15水平从一个正常水平逐步升高，在妊娠第九个月增加到峰值，因此在妊娠6和13周时GDF15检测浓度降低时会出现流产，因此在次期间及时检测GDF15水平非常关键和具有极大价值。
GDF15能在不同的细胞压力信号下出现增多，如低氧或缺氧、炎症、急性组织损伤和肿瘤等；在病理条件下进行监测GDF15，并为临床应用做预测性支持；在病理上，GDF15是一个综合信号；在癌症领域，GDF15在前列腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、口腔鳞状细胞癌、黑色素瘤、胶质瘤等疾病中表达和分泌显著增强；在心血管领域，GDF15是一个预测疾病的独立因子，其直接参与心肌纤维化和心肌重构的病理和生理过程，是继髓过氧化物酶(MPO)之后的一个新型心血管炎症标志物，GDF15是一种跨膜蛋白，能够作为细胞损伤和炎症反应的标志物，其可诊断动脉粥样硬化性疾病，其可预警和评估心肌梗塞、心衰等严重心血管事件发生风险程度。在所有慢病领域，比如风湿性关节炎、终末期肾功能衰竭、糖尿病，和在癌症、心血管疾病领域一样，GDF15的浓度变化对疾病的进展同样是一个独立的预测因素。GDF15也是评估青光眼严重程度的一个重要生物标志物，研究发现青光眼患者GDF15浓度显著高于正常人，且其浓度越高眼功能越差，呈正相关性；因此检测其浓度可以评估青光眼的严重程度，且可以预测视网膜细胞等死亡风险程度。
综上，不论在相关人群生理情况下、还是病理情况下的相关群体，及时进行GDF15的检测和监测是非常必要的；纵观各方法学，免疫荧光层析法能够实现对GDF15的精准加测，且可实现高灵敏度、高特异性、快速检测。
免疫荧光层析法利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及其螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质等，标记抗体或抗原，待抗原抗体反应发生后，用特定检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析；此方法学由于其低本底，高灵敏度和特异性，荧光寿命长，无放射性同位素污染等特点，自20世纪80年代Pettersson和Eskola等人首次报到后得到了迅速发展，并且广泛应用于临床疾病诊断。
在免疫荧光层析检测中，荧光抗体的淬灭及抗体包被浓度影响实验结果。蛋白质固着于硝酸纤维素膜(NC膜)作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对胶体金检测结果非常重要。如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。
发明内容
本发明提供一种GDF15快速定量荧光微球检测装置及其制备方法，以解决不借用大型仪器就不能实现GDF15浓度检测和监测、荧光易淬灭和NC膜吸附蛋白量不足、结合力不强的问题。本发明制备的GDF15快速定量荧光微球检测装置，可实现GDF15的灵敏、特异、快速检测，提高了对生理情况下相关群体、病理情况下相关群体进行合理综合判定能力，能够快速、准确进行风险早期预警及病情风险判断；由固相有纯化GDF15抗体和羊抗兔IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸附有荧光微球标记兔抗GDF15抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。可实现GDF15的灵敏、特异、快速检测。
本发明采取的技术方案是：样品垫1、免疫荧光玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述免疫硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫荧光玻璃纤维膜2搭接，所述免疫荧光玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述免疫硝酸纤维素膜3上设置检测线T和质控线C，所述的检测线T上固相有GDF15-抗体；所述的质控线C上喷点羊抗兔IgG多克隆抗体。
本发明GDF15快速定量荧光微球检测装置的制备方法，包括下列步骤：
(a)免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到EP管中。取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时。将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min。倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
(b)活化的免疫荧光微球交联标记抗体，取1ml活化后的免疫荧光微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体。加入抗体后，大约反应30s-120s后，再到超声波上超声20-40秒，然后再反应1小时。加牛血清白蛋白BSA进行封闭1小时。将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min,15min。将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用；
(c)采用缓冲液稀释步骤(b)的免疫荧光微球交联标记抗体获得免疫荧光抗体溶液，用免疫荧光抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光抗体玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理后，喷点与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合的载体蛋白-GDF15作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫荧光微球玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
本发明步骤(b)所述的缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％。
本发明步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理是：用聚乙二醇丙三醇处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)、PEG20000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合GDF15抗体是：以油酸修饰的ZnS作为载体，取1mL载体蛋白-GDF15溶液，搅拌1小时后，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
本发明步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备方法：取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中，水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
本发明步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂(烷基酚聚氧乙烯醚)组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂浓度为0.5～1％。
本发明制备的GDF15快速定量检测装置可检测患者全血、血清、血浆和相关液体中GDF15含量，对相关群体、相关疾病的风险预警、进展评估具有重要意义。
本发明由固相有纯化的GDF15抗体(检测线T)和羊抗兔IgG抗体(质控线)的硝酸纤维素膜、吸附有荧光微球标记GDF15抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成，具有特异、快速、灵敏的特点。
乙二醇与环氧氯丙烷用碱催化其反应,产物用稀盐酸中和,四氯化碳萃取,减压蒸馏,得到聚乙二醇丙三醇(PEGG),为淡黄色粘稠物。PEGG能与水以任意比例混溶,也能溶于一般的有机溶剂如乙醇、丙酮、四氢呋喃、氯仿,有一定的表面活性。聚乙二醇丙三醇的结构中含有多个羟基可供偶联,活化过程简单，方便NC膜表面固定蛋白。常规条件下，单位面积的NC膜上结合抗体的数量是有限的，采用聚乙二醇丙三醇处理之后，可以让单位面积的NC膜上结合抗体数量增加，进而可以实现更高的检测灵敏度。
在改善NC膜对蛋白吸附基础上，探讨蛋白对NC膜吸附效果也是提高免疫荧光层析技术灵敏度的另一途径。油酸/十二烷基硫酸钠修饰的ZnS不仅具有纳米级的粒径尺寸、且具有良好的水溶性与生物相容性，利用其外表面的功能性基团，在水介质中均匀分散，可与生物大分子相结合。油酸修饰的硫化锌纳米颗粒具有较好的稳定性、易于制备、生物相容性较好及较低的免疫原性等优势，在生物医学领域研究较为广泛。但在免疫荧光层析技术中尚未有报道应用。本研究探讨了油酸修饰的硫化锌纳米颗粒对NC膜包被抗体的影响，先将划膜用的抗体先与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合，封闭，离心纯化，去掉未结合的抗体，然后复溶到一定比例，然后划膜，这样一个油酸修饰的硫化锌纳米颗粒可以结合多个抗体，从而增加了包被抗体效率，灵敏度也会大大提高。
为了提高免疫荧光层析技术的灵敏度，我们通过对硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液进行了预处理，将包被NC的抗体与硫化锌纳米颗粒结合，达到了提高试纸灵敏度的目的。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的检测装置结构新颖，将GDF15-抗体吸附到油酸修饰的硫化锌纳米颗粒后包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，也没有增加生产操作的复杂度。
2、免疫荧光抗体制备步骤中，通过配合合适的缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫荧光抗体释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫荧光微球的用量，节约成本。
3、本发明对包被蛋白的硝酸纤维素膜进行预处理，降低荧光淬灭，同时提高了检测试纸灵敏度、特异性。
4、本发明的检测装置操作简便，不需要专业人员操作。实用性强。
附图说明
图1是本发明的结构示意图；
图2是图1的A-A剖视图。
具体实施方式
实施例1
样品垫1、免疫荧光玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述免疫硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫荧光玻璃纤维膜2搭接，所述免疫荧光玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述免疫硝酸纤维素膜3上设置检测线T和质控线C，所述的检测线T上固相有GDF15-抗体；所述的质控线C上喷点羊抗兔IgG多克隆抗体；
制备方法：
(a)、免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍，即1000ul，加入到EP管中，取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液NHS加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时，将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min。倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
(b)、活化的免疫荧光微球交联标记抗体，取1ml活化后的微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应30s后，再到超声波上超声20秒，然后再反应1小时，加BSA进行封闭1小时，将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min，15min，将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用，所述的荧光缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(c)、采用优化的荧光缓冲液稀释荧光抗体获得免疫荧光抗体溶液，用缓冲液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光玻璃纤维膜；
(d)、固相硝酸纤维素膜
1)聚乙二醇丙三醇处理液预处理硝酸纤维素膜
配制聚乙二醇丙三醇处理液：聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
聚乙二醇丙三醇处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚乙二醇丙三醇处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)硫化锌纳米颗粒修饰GDF15抗体
油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备：取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中。水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
硫化锌纳米颗粒修饰GDF15抗体：以油酸修饰的ZnS作为载体，取1mL GDF15抗体溶液，搅拌1小时后，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将硫化锌纳米颗粒-GDF15抗体稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
(e)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，该样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
将预处理的样品垫、免疫荧光玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
定量检测：通过荧光定量检测仪检测，本检测装置检测GDF15最低检测值：0.5ng/ml。
实施例2：
(b)、活化的免疫荧光微球交联标记抗体，取1ml活化后的微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应75s后，再到超声波上超声30秒，然后再反应1小时，加BSA进行封闭1小时，将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min，15min，将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用，所述的荧光缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为12％、海藻糖浓度为3％、BSA浓度为0.7％，pH为8.5；
配制聚乙二醇丙三醇处理液：由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.7％、酪蛋白浓度为0.15％、表面活性剂浓度为1％；
其余同实施例1。
实施例3
(b)、活化的免疫荧光微球交联标记抗体，取1ml活化后的微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应120s后，再到超声波上超声40秒，然后再反应1小时，加BSA进行封闭1小时，将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min，15min，将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用，所述的荧光缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为20％、海藻糖浓度为5％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
配制聚乙二醇丙三醇处理液：由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)与PEG2000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为1％、酪蛋白浓度为0.2％、表面活性剂浓度为1％；
其余同实施例1。
下边通过实验来进一步说明本发明的效果。
实验例1：
1、聚乙二醇丙三醇处理液对硝酸纤维素膜抗淬灭能力的比较
1.1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.2.1配制聚乙二醇丙三醇处理液
配制三种聚乙二醇丙三醇处理液：聚乙二醇丙三醇组，聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％组成；聚乙二醇丙三醇处理液多聚赖氨酸组，聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％；聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸和PEG20000组，，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，三组处理液均经0.22μm滤膜过滤，备用。
1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入聚乙二醇丙三醇处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
1.3实验方法
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备生长分化因子15(GDF15)荧光微球检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后荧光指标差异。
1.4结果:
1.4.1荧光强度比较
取处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察荧光显色情况判断处理后膜对荧光淬灭能力的影响，结果见表1。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明荧光淬灭能力降低，提高了反应灵敏度。
表1硝酸纤维素膜荧光淬灭能力比较
Figure BDA0002476936290000091
1.4.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取聚乙二醇丙三醇处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察实验数据来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表2。表2结果与表1结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0002476936290000101
实验例2：
2、硫化锌纳米颗粒修饰GDF15抗体
3、2.1材料与方法
2.1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
2.1.2硫化锌纳米颗粒修饰GDF15抗体
2.1.2油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备
取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，
40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中。水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
2.2实验方法
分别将硫化锌纳米颗粒修饰的GDF15抗体与未修饰的GDF15按照上述实施例工艺流程制备GDF15检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硫化锌纳米颗粒处理和未处理对蛋白的吸附力和稳定性指标差异。
2.3结果
2.3.1吸附力比较
取硫化锌纳米颗粒处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表3。结果显示，硫化锌纳米颗粒修饰组膜尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表3硫化锌纳米颗粒修饰吸附能力比较
Figure BDA0002476936290000111
2.3.2稳定性比较
取硫化锌纳米颗粒处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断硫化锌修饰后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表4。表4结果与表3结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表4加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0002476936290000112
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种GDF15快速定量荧光微球检测装置，其特征在于：样品垫(1)、免疫荧光玻璃纤维膜(2)、免疫硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)分别粘贴在塑料板(5)，所述免疫硝酸纤维素膜(3)的两端分别与吸收垫(4)、免疫荧光玻璃纤维膜(2)搭接，所述免疫荧光玻璃纤维膜(2)的另一端与样品垫(1)搭接；所述免疫硝酸纤维素膜(3)上设置检测线(T)和质控线(C)；所述的检测线(T)上固相有GDF15-抗体；所述的质控线(C)上喷点羊抗兔IgG多克隆抗体。
2.如权利要求1所述的GDF15快速定量荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(a)免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到EP管中，取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液NHS加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液EDC加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时，将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min，倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
(b)活化的免疫荧光微球交联标记抗体，取1ml活化后的免疫荧光微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应30s-120s后，再到超声波上超声20-40秒，然后再反应1小时，加牛血清白蛋白BSA进行封闭1小时，将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min，15min，将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用；
(c)采用缓冲液稀释步骤(b)的免疫荧光微球交联标记抗体获得免疫荧光抗体溶液，用免疫荧光抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理后，喷点与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合的GDF15抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫荧光玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
3.根据权利要求2所述的GDF15快速定量荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(b)所述的缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％。
4.根据权利要求2所述的GDF15快速定量荧光微球检测装置的制备方法，其特征在在于：步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理是：用聚乙二醇丙三醇处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
5.根据权利要求2或4所述的GDF15快速定量荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，备用。
6.根据权利要求2或4所述的GDF15快速定量荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
7.根据权利要求2或4所述的GDF15快速定量荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)、PEG20000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
8.根据权利要求2所述的GDF15快速定量荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合-GDF15抗体是：以油酸修饰的ZnS作为载体，取1mL GDF15抗体，搅拌1小时后，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
9.根据权利要求2或8所述的GDF15快速定量荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备方法：取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中，水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间，待反应结束，降温至50℃，取出产物，用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
10.根据权利要求2所述的GDF15快速定量荧光微球检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂浓度为0.5～1％。
CN202010370054.2A 2020-04-30 2020-04-30 Gdf15快速定量荧光微球检测装置及其制备方法 Active CN111638364B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010370054.2A CN111638364B (zh) 2020-04-30 2020-04-30 Gdf15快速定量荧光微球检测装置及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010370054.2A CN111638364B (zh) 2020-04-30 2020-04-30 Gdf15快速定量荧光微球检测装置及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111638364A true CN111638364A (zh) 2020-09-08
CN111638364B CN111638364B (zh) 2021-08-24

Family

ID=72329978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010370054.2A Active CN111638364B (zh) 2020-04-30 2020-04-30 Gdf15快速定量荧光微球检测装置及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111638364B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112698042A (zh) * 2020-12-17 2021-04-23 北京赛诺浦生物技术有限公司 检测人生长分化因子-15的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN112816705A (zh) * 2020-12-31 2021-05-18 北京赛诺浦生物技术有限公司 人心肌钙蛋白i、人生长分化因子15以及人d二聚体的三联检测层析试纸条及其应用
CN113702647A (zh) * 2021-08-31 2021-11-26 普十生物科技(北京)有限公司 人生长分化因子15即时检测试剂盒、其制备方法及其应用
CN115015540A (zh) * 2022-04-17 2022-09-06 吉林迅准生物技术有限公司 采用处理的nc膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法
CN115015553A (zh) * 2022-04-17 2022-09-06 吉林迅准生物技术有限公司 一种多项标志物联合检测装置及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105445449A (zh) * 2015-04-04 2016-03-30 吉林双正医疗科技有限公司 唾液尿酸快速半定量检测装置及其制备方法
CN107782900A (zh) * 2016-08-31 2018-03-09 朱海燕 人生长分化因子‑15的检测试纸组件
CN109781984A (zh) * 2019-01-29 2019-05-21 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种同时定量检测多个肝癌标志物的抗体芯片试剂盒
CN109799334A (zh) * 2019-02-06 2019-05-24 吉林双正生物工程有限公司 心脏标志物的荧光微球联合检测装置及其制备方法
CN110615462A (zh) * 2019-07-26 2019-12-27 北京化工大学 一种基于液体石蜡溶剂体系绿色合成油溶性硫化锌量子点的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105445449A (zh) * 2015-04-04 2016-03-30 吉林双正医疗科技有限公司 唾液尿酸快速半定量检测装置及其制备方法
CN105588939A (zh) * 2015-04-04 2016-05-18 吉林双正医疗科技有限公司 MPO、H-FABP和cTnT联合检测装置及制备方法
CN107782900A (zh) * 2016-08-31 2018-03-09 朱海燕 人生长分化因子‑15的检测试纸组件
CN109781984A (zh) * 2019-01-29 2019-05-21 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种同时定量检测多个肝癌标志物的抗体芯片试剂盒
CN109799334A (zh) * 2019-02-06 2019-05-24 吉林双正生物工程有限公司 心脏标志物的荧光微球联合检测装置及其制备方法
CN110615462A (zh) * 2019-07-26 2019-12-27 北京化工大学 一种基于液体石蜡溶剂体系绿色合成油溶性硫化锌量子点的方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112698042A (zh) * 2020-12-17 2021-04-23 北京赛诺浦生物技术有限公司 检测人生长分化因子-15的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN112816705A (zh) * 2020-12-31 2021-05-18 北京赛诺浦生物技术有限公司 人心肌钙蛋白i、人生长分化因子15以及人d二聚体的三联检测层析试纸条及其应用
CN113702647A (zh) * 2021-08-31 2021-11-26 普十生物科技(北京)有限公司 人生长分化因子15即时检测试剂盒、其制备方法及其应用
CN113702647B (zh) * 2021-08-31 2024-03-15 普十生物科技(北京)有限公司 人生长分化因子15即时检测试剂盒、其制备方法及其应用
CN115015540A (zh) * 2022-04-17 2022-09-06 吉林迅准生物技术有限公司 采用处理的nc膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法
CN115015553A (zh) * 2022-04-17 2022-09-06 吉林迅准生物技术有限公司 一种多项标志物联合检测装置及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111638364B (zh) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111638364B (zh) Gdf15快速定量荧光微球检测装置及其制备方法
CN105588939B (zh) MPO、H‑FABP和cTnT联合检测装置及制备方法
CN111638366B (zh) G-17、pgi、pgii联合检测装置及其制备方法
CN111638372B (zh) 一种心肌标志物的联合检测装置及其制备方法
CN103987855A (zh) 未分化细胞检测方法及复合糖检测方法
CN109884029B (zh) 银/石墨烯量子点纳米酶、sers检测试剂盒及应用
Wang et al. Determination of brain injury biomarkers by surface-enhanced Raman scattering using hollow gold nanospheres
CN111638365B (zh) Gdf15快速定量检测装置及其制备方法
CN111638369B (zh) 胃功能及胃癌发生风险的荧光微球检测装置及其制备方法
CN109253998B (zh) 基于拉曼增强的金属-包裹物-抗体复合纳米粒子定量检测肿瘤标记物的方法
WO2015119386A1 (ko) 효소 모방 무기 나노입자를 이용한 고감도 측면유동 면역 발색칩 및 이를 이용한 검출 방법
CN111208297A (zh) 一种微流控芯片检测外泌体gpc1蛋白的方法及其在胰腺癌早期诊断中的应用
Jalali et al. MoS2-Plasmonic nanocavities for Raman spectra of single extracellular vesicles reveal molecular progression in glioblastoma
Lu et al. Detection of squamous cell carcinoma antigen in cervical cancer by surface-enhanced Raman scattering-based immunoassay
CN115902232A (zh) 一种急性主动脉夹层检测试剂盒及制备方法
CN107884573B (zh) 基于反向荧光增强的高灵敏可视化双模态急性心肌梗塞免疫层析试纸条制备和检测方法
CN111638371A (zh) 一种心肌标志物的荧光微球联合检测装置及其制备方法
CN111638363B (zh) 3-脱氧果糖快速定量荧光检测装置及其制备方法
CN111551740B (zh) 幽门螺杆菌尿素酶IgG和IgM抗体联合检测装置及制备方法
JP7081861B1 (ja) ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット、およびその製造方法
CN105950558A (zh) 一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法
CN111638347B (zh) Mgo和go快速定量联合检测装置及其制备方法
CN114478828B (zh) 一种循环肿瘤细胞的检测材料、检测器以及检测方法
US20210025866A1 (en) Devices, Systems, and Methods for Cell Analysis in Microgravity
Cheng et al. A combined negative and positive enrichment assay for cancer cells isolation and purification

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant