CN111638347B - Mgo和go快速定量联合检测装置及其制备方法 - Google Patents

Mgo和go快速定量联合检测装置及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种MGO和GO快速定量联合检测装置及其制备方法，属于医疗检测领域。由固相有甲基乙二醛、乙二醛‑载体蛋白和羊抗鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸附有荧光微球标记甲基乙二醛、乙二醛抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。采用聚乙二醇丙三醇处理液对硝酸纤维素膜进行预处理，将载体蛋白‑甲基乙二醛、乙二醛先与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合再吸附到硝酸纤维素膜上，并配制合适的缓冲液和样品垫处理液，在保证免疫荧光微球释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫荧光微球的用量，检测试纸灵敏度高、特异性强、操作简便省时、实用性强。

Description

MGO和GO快速定量联合检测装置及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗检测设备领域，特别涉及甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)快速定量联合检测装置及其制备方法，利用荧光免疫层析技术以及竞争法原理定量检测全血、血清、血浆和相关液体标本中甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)含量的检测装置及其制备方法，可实现甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)的快速检测，且灵敏度高、特异性强。
背景技术
我国高血糖发生率逐年升高，糖尿病患者群体逐年扩大；糖尿病并发症，比如糖尿病心血管病、糖尿病足、糖尿病肾病、糖尿病眼病等，给人类造成了极大损伤和经济负担；如何在这些并发症来临之前我们就可以及早发现，已经成为医学界关注的热点和研究的热点；本发明涉及的产品就是针对糖尿病引发的心血管疾病进行早期预警和诊断的临床诊断工具。
甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)是一种活性的二羰基化合物，作为糖尿病心血管疾病(CVD)非常关键的标志物。糖尿病领域权威杂志Diabetes Care上发表了一篇研究文章，该研究纳入了1003名来自于第二表现为动脉疾病队列(SMART)的2型糖尿病患者(年龄平均±SD为59.1±10.5岁，69.3％为男性，61.6％的参与者既往有CVD)，研究人员采用质谱测量了基础的血浆(MGO)水平和乙二醛(GO)。CVD事件的中位随访时间为8.6年。研究人员采用Cox回归对性别、年龄、吸烟、收缩压、总胆固醇、HbA1c、BMI、CVD和药物使用调整后的数据进行分析。风险比采用每SD-Ln转化的二羰基表示；该研究表明：MGO和GO水平与2型糖尿病患者的心血管死亡率直接相关；因此，及时检测MGO和GO会及早发现风险、及早预警、及早干预；同时监测MGO和GO水平对2型糖尿病CVD患者群体收益极大，其次改变二羰基水平也会成为降低2型糖尿病CVD的一个靶点。
综上，在糖尿病群体中及时进行甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)的检测和监测是非常必要的；免疫荧光层析法能够实现对甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)的精准加测，且可实现高灵敏度、高特异性、快速检测。
免疫荧光层析法利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及其螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质等，标记抗体或抗原，待抗原抗体反应发生后，用特定检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析；此方法学由于其低本底，高灵敏度和特异性，荧光寿命长，无放射性同位素污染等特点，自20世纪80年代Pettersson和Eskola等人首次报到后得到了迅速发展，并且广泛应用于临床疾病诊断。
在免疫荧光层析检测中，荧光抗体的淬灭及抗体包被浓度影响实验结果。蛋白质固着于硝酸纤维素膜(NC膜)作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对胶体金检测结果非常重要。如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。
发明内容
本发明提供一种MGO和GO快速定量联合检测装置及其制备方法，以解决不借用大型仪器就不能实现甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)浓度检测和监测、和荧光易淬灭和NC膜吸附蛋白量不足、结合力不强的问题。本发明制备的甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)快速定量检测装置，可实现甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)的灵敏、特异、快速检测，提高了相关群体进行合理综合判定能力，能够快速、准确进行风险早期预警及病情风险判断；由固相有纯化甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)-载体蛋白和羊抗兔IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸附有荧光微球标记兔抗甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。可实现甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)的灵敏、特异、快速检测。
本发明采取的技术方案是：样品垫1、免疫荧光玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述免疫硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫荧光玻璃纤维膜2搭接，所述免疫荧光玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述免疫硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C；所述的第一检测线T1和第二检测线T2上分别固相有甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白、乙二醛(GO)-载体蛋白；所述免疫硝酸纤维素膜3上设置的检测线T1、T2可以纵向排列在同一条免疫硝酸纤维素膜3上，形成一个联合检测装置；所述免疫硝酸纤维素膜(3)上设置的检测线T1、T2也可以分别设置在两条免疫硝酸纤维素膜3上，并列排列形成一个联合检测装置；所述的质控线C上喷点羊抗兔IgG多克隆抗体；
所述的第一检测线T1、第二检测线T2上分别固相有甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)-载体蛋白，结合甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)-载体蛋白是指：卵清蛋白(OVA)、或牛血清白蛋白(BSA)、或血蓝蛋白(KLH)。
一种MGO和GO快速定量联合检测装置的制备方法，包括下列步骤：
(a)免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到EP管中。取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时。将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min。倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
(b)活化的微球交联抗体，取1ml活化后的免疫荧光微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体。加入抗体后，大约反应30s-120s后，再到超声波上超声20-40秒，然后再反应1小时。加牛血清白蛋白BSA进行封闭1小时。将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min,15min。将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用；
(c)采用缓冲液稀释步骤(b)的免疫荧光微球交联标记抗体获得免疫荧光抗体溶液，用免疫荧光抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理后，喷点与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合的甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白和乙二醛(GO)-载体蛋白作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫荧光玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
本发明步骤(c)所述的缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％。
本发明步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理是：用聚乙二醇丙三醇处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白和乙二醛(GO)-载体蛋白是：以油酸修饰的ZnS作为载体，取1mL载体甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白和乙二醛(GO)-载体蛋白溶液，搅拌1小时后，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)、PEG20000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备方法：取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中。水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
本发明步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂(烷基酚聚氧乙烯醚)组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂浓度为0.5～1％。
本发明制备的甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)快速定量联合检测装置可检测患者血液和相关液体中甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)含量，对相关群体、相关疾病的风险预警、进展评估具有重要意义。
本发明由固相有纯化的甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)-载体蛋白(检测线T)和羊抗兔IgG抗体(质控线)的硝酸纤维素膜、吸附有免疫荧光微球标记甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成，具有特异、快速、灵敏的特点。
乙二醇与环氧氯丙烷用碱催化其反应,产物用稀盐酸中和,四氯化碳萃取,减压蒸馏,得到聚乙二醇丙三醇(PEGG),为淡黄色粘稠物。PEGG能与水以任意比例混溶,也能溶于一般的有机溶剂如乙醇、丙酮、四氢呋喃、氯仿,有一定的表面活性。聚乙二醇丙三醇的结构中含有多个羟基可供偶联,活化过程简单，方便NC膜表面固定蛋白。常规条件下，单位面积的NC膜上结合抗体的数量是有限的，采用聚乙二醇丙三醇处理之后，可以让单位面积的NC膜上结合抗体数量增加，进而可以实现更高的检测灵敏度。
在改善NC膜对蛋白吸附基础上，探讨蛋白对NC膜吸附效果也是提高胶体金灵敏度的另一途径。油酸/十二烷基硫酸钠修饰的ZnS不仅具有纳米级的粒径尺寸、且具有良好的水溶性与生物相容性，利用其外表面的功能性基团，在水介质中均匀分散，可与生物大分子相结合。油酸修饰的硫化锌纳米颗粒具有较好的稳定性、易于制备、生物相容性较好及较低的免疫原性等优势，在生物医学领域研究较为广泛。但在免疫荧光层析技术中尚未有报道应用。本研究探讨了油酸修饰的硫化锌纳米颗粒对NC膜包被抗体的影响，先将划膜用的抗体先与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合，封闭，离心纯化，去掉未结合的抗体，然后复溶到一定比例，然后划膜，这样一个油酸修饰的硫化锌纳米颗粒可以结合多个抗体，从而增加了包被抗体效率，灵敏度也会大大提高。
为了提高免疫荧光层析技术的灵敏度，我们通过对硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液进行了预处理，将包被NC的抗体与硫化锌纳米颗粒结合，达到了提高试纸灵敏度的目的。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的检测装置结构新颖，将甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)-载体蛋白吸附到油酸修饰的硫化锌纳米颗粒后包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，也没有增加生产操作的复杂度。
2、免疫荧光抗体制备步骤中，通过配合合适的缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫荧光抗体释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫荧光微球的用量，节约成本。
3、本发明对包被蛋白的硝酸纤维素膜进行预处理，降低荧光淬灭，同时提高了检测试纸灵敏度、特异性。
4、本发明的检测装置操作简便，不需要专业人员操作。实用性强。
附图说明
图1是本发明检测装置的结构示意图，图中第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C设置在同一条免疫硝酸纤维素膜上；
图2是图1的A-A剖视图；
图3是本发明检测装置的结构示意图，图中第一检测线T1、第二检测线T2设置在两条免疫硝酸纤维素膜上；
图4是图3的B-B剖视图；
图5是图3的C-C剖视图。
具体实施方式
实施例1
样品垫1、免疫荧光玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述免疫硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫荧光玻璃纤维膜2搭接，所述免疫荧光玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述免疫硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C；所述的第一检测线T1和第二检测线T2上分别固相有甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白、乙二醛(GO)-载体蛋白；所述免疫硝酸纤维素膜3上设置的检测线T1、T2可以纵向排列在同一条免疫硝酸纤维素膜3上，形成一个联合检测装置；所述免疫硝酸纤维素膜3上设置的检测线T1、T2也可以分别设置在两条免疫硝酸纤维素膜3上，并列排列形成一个联合检测装置；所述的质控线C上喷点羊抗兔IgG多克隆抗体；
所述的第一检测线T1、第二检测线T2上分别固相有甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)-载体蛋白，结合甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)-载体蛋白是指：卵清蛋白(OVA)、或牛血清白蛋白(BSA)、或血蓝蛋白(KLH)；
制备方法：
(a)、免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到EP管中。取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时。将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min，倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
(b)、活化的微球交联抗体，取1ml活化后的微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体。加入抗体后，大约反应1min后，再到超声波上超声30秒左右，然后再反应1小时。加BSA进行封闭1小时。将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min,15min。将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用。
(c)、采用优化的荧光抗体缓冲液稀释荧光抗体获得免疫荧光抗体溶液，用免疫荧光抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光玻璃纤维膜；所述的荧光抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为0.5％，pH为8.5；
(d)、固相硝酸纤维素膜
1)聚乙二醇丙三醇处理液预处理硝酸纤维素膜
配制聚乙二醇丙三醇处理液：聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
聚乙二醇丙三醇处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚乙二醇丙三醇处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)硫化锌纳米颗粒修饰甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白、乙二醛(GO)-载体蛋白
油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备：取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中。水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
硫化锌纳米颗粒修饰甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白、乙二醛(GO)-载体蛋白：
以油酸修饰的ZnS作为载体，取1mL甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白、乙二醛(GO)-载体蛋白溶液，搅拌1小时后，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将硫化锌纳米颗粒甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白、乙二醛(GO)-载体蛋白稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
4)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，所述样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
(e)、将预处理的样品垫、免疫荧光玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
定量检测：通过荧光定量检测仪检测，本检测装置检测甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)最低检测值：0.5ng/ml。
实施例2：
所述的荧光抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为12％、海藻糖浓度为3％、BSA浓度为0.7％，pH为8.5；
配制聚乙二醇丙三醇处理液：由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
所述样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.7％、酪蛋白浓度为0.15％、表面活性剂浓度为0.7％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
其余同实施例1。
实施例3
所述的荧光抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为20％、海藻糖浓度为5％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
配制聚乙二醇丙三醇处理液：由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)与PEG2000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
所述样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为1％、酪蛋白浓度为0.2％、表面活性剂浓度为1％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
其余同实施例1。
下边通过实验来进一步说明本发明的效果。
实验例1：
1、聚乙二醇丙三醇处理液对硝酸纤维素膜抗淬灭能力的比较
1.1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.2.1配制聚乙二醇丙三醇处理液
配制三种聚乙二醇丙三醇处理液：聚乙二醇丙三醇组，聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％组成；聚乙二醇丙三醇处理液多聚赖氨酸组，聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％；聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸和PEG20000组，，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，三组处理液均经0.22μm滤膜过滤，备用。
1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入聚乙二醇丙三醇处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
1.3实验方法
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备3-脱氧果糖荧光微球检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后荧光指标差异。
1.4结果:
1.4.1荧光强度比较
取处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察荧光显色情况判断处理后膜对荧光淬灭能力的影响，结果见表1。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明荧光淬灭能力降低，提高了反应灵敏度。
表1硝酸纤维素膜荧光淬灭能力比较
Figure BDA0002476936600000101
1.4.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取聚乙二醇丙三醇处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察实验数据来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表2。表2结果与表1结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0002476936600000102
实验例2：
2、硫化锌纳米颗粒修饰甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白
2.1材料与方法
2.1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
2.1.2硫化锌纳米颗粒修饰甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白
2.1.2油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备
取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中。水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
2.2实验方法
分别将硫化锌纳米颗粒修饰的甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白与未修饰的载甲基乙二醛(MGO)-载体蛋白按照上述实施例工艺流程制备甲基乙二醛(MGO)检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硫化锌纳米颗粒处理和未处理对蛋白吸附力和稳定性指标差异。
2.3结果
2.3.1蛋白吸附力比较
取硫化锌纳米颗粒处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表3。结果显示，硫化锌纳米颗粒修饰组膜尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表3硫化锌纳米颗粒修饰对蛋白吸附能力比较
Figure BDA0002476936600000111
2.3.2稳定性比较
取硫化锌纳米颗粒处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断硫化锌修饰后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表4。表4结果与表3结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表4加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0002476936600000121
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种MGO和GO快速定量联合检测装置的制备方法， 其特征在于：包括下列步骤：
（a）免疫荧光微球的制备，取100ul固体含量为 1%的微球悬浮液，用超纯水稀释 10倍，即1000ul，加入到EP 管中，取 40ul 的 N-羟基琥珀酰亚胺液NHS加入微球悬浮液中混匀，然后接着将40ul 的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液EDC加入微球悬浮液中混匀，常温下反应 0.5 小时，将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件 10000r/min、20min，倒掉上清液，加入1ml 超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
（b）活化的微球交联抗体，取 1ml 活化后的免疫荧光微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应30s-120s后，再到超声波上超声 20-40秒，然后再反应1小时，加牛血清白蛋白BSA进行封闭1小时，将封闭好的微球进行离心，速度为 10000r/min，15min，将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用；
（c）采用缓冲液稀释步骤（b）的免疫荧光微球交联标记抗体获得免疫荧光抗体溶液，用免疫荧光抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光玻璃纤维膜；
（d）将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理后，喷点与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合的甲基乙二醛MGO-载体蛋白、乙二醛GO-载体蛋白作为检测线，喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
（e）将预处理的样品垫、步骤（c）制备的免疫荧光玻璃纤维膜、步骤（d）制备的免疫硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
2.根据权利要求 1 所述的MGO和GO快速定量联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（c）所述的缓冲液由 Tris-HCl 液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白 BSA组成，pH 值 8.5，其中 Tris-HCl浓度为 0.02mol/L，蔗糖浓度为 5~20%，海藻糖浓度为 1~5%，牛血清白蛋白BSA 浓度为 0.5~1%。
3.根据权利要求 1 所述的MGO和GO快速定量联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（d）所述的将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理是：用聚乙二醇丙三醇处理液浸泡硝酸纤维素膜1 h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
步骤（d）所述的与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合的甲基乙二醛MGO-载体蛋白、乙二醛GO-载体蛋白的制备方法：以油酸修饰的硫化锌纳米颗粒作为载体，取 1 mL甲基乙二醛MGO-载体蛋白、乙二醛GO-载体蛋白溶液，搅拌1小时后，分别以12000 rpm，8500 rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
4.根据权利要求1或3 所述的MGO和GO快速定量联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（d）所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇稀释到浓度为0.5%组成，经0.22μm滤膜过滤，备用。
5.根据权利要求1或3所述的MGO和GO快速定量联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（d）所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸SIGMA,150KD～300KD混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5%，多聚赖氨酸浓度为0.5%，经0.22μm滤膜过滤，备用。
6.根据权利要求1或3所述的MGO和GO快速定量联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（d）所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸SIGMA,150KD～300KD、PEG20000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5%，多聚赖氨酸浓度为0.5%，PEG20000浓度为0.1%，经0.22μm滤膜过滤，备用。
7.根据权利要求1或3所述的MGO和GO快速定量联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（d）所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备方法：取油酸无水乙醇溶液 15ml 加入到15ml 浓度为 0.3mol/L 的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节 pH 值，再加入15ml 浓度为 0.3mol/L 的硫化钠水溶液，反应 5min 后，加入 5ml SDS 水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入 90ml水热釜中，水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间，待反应结束，降温至 50℃，取出产物，用丙酮、去离子水、乙醇洗涤，离心分离，在 50℃下真空干燥 2h 得到粉体 ZnS，存放待用。
8.根据权利要求1所述的MGO和GO快速定量联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（e）所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCl液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚组成，其中Tris-HCl液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5~1%，酪蛋白浓度为0.1~0.2%、表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚浓度为0.5~1%。
9.采用如权利要求1~8任一项所述的方法制备的MGO和GO快速定量联合检测装置，其特征在于：样品垫（1）、免疫荧光玻璃纤维膜（2）、免疫硝酸纤维素膜（3）、吸收垫（4）分别粘贴在塑料板（5）上，所述免疫硝酸纤维素膜（3）的两端分别与吸收垫（4）、免疫荧光玻璃纤维膜（2）搭接，所述免疫荧光玻璃纤维膜（2）的另一端与样品垫（1）搭接；所述免疫硝酸纤维素膜（3）上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C；所述免疫硝酸纤维素膜（3）上设置的第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C纵向排列在同一条免疫硝酸纤维素膜（3）上，形成一个联合检测装置；所述的第一检测线T1、第二检测线T2上分别固相有甲基乙二醛MGO-载体蛋白、乙二醛GO-载体蛋白；所述的质控线C上喷点羊抗鼠 IgG 多克隆抗体。
10.采用如权利要求1~8任一项所述的方法制备的MGO和GO快速定量联合检测装置，其特征在于：样品垫（1）、免疫荧光玻璃纤维膜（2）、免疫硝酸纤维素膜（3）、吸收垫（4）分别粘贴在塑料板（5）上，所述免疫硝酸纤维素膜（3）的两端分别与吸收垫（4）、免疫荧光玻璃纤维膜（2）搭接，所述免疫荧光玻璃纤维膜（2）的另一端与样品垫（1）搭接；所述免疫硝酸纤维素膜（3）上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C；所述免疫硝酸纤维素膜（3）上设置的第一检测线T1、第二检测线T2分别设置在两条免疫硝酸纤维素膜（3）上，且在每条免疫硝酸纤维素膜（3）上设置质控线C，两条免疫硝酸纤维素膜（3）并列排列形成一个联合检测装置；所述的第一检测线T1、第二检测线T2上分别固相有甲基乙二醛MGO-载体蛋白、乙二醛GO-载体蛋白；所述的质控线C上喷点羊抗鼠 IgG 多克隆抗体。
11.根据权利要求9或10所述的MGO和GO快速定量联合检测装置，其特征在于：所述甲基乙二醛MGO-载体蛋白、乙二醛GO-载体蛋白中的载体蛋白是指：卵清蛋白OVA、牛血清白蛋白BSA或血蓝蛋白KLH。
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