CN102654499A - 一种胃蛋白酶原ⅰ的光激发化学发光检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种胃蛋白酶原Ⅰ的光激发化学发光检测方法及试剂盒，属于光激发化学发光免疫分析技术领域。本发明方法为：微量的胃蛋白酶原Ⅰ标准品或样品、包被有抗胃蛋白酶原Ⅰ一株高效价单抗的发光微粒和生物素化抗胃蛋白酶原Ⅰ的另一株单克隆抗体，在微孔板中避光反应，随后加入包被有链霉亲和素的感光微粒，孵育后检测。本发明应用光激发化学发光原理，在特定波长激发下，通过单线态离子氧的产生和传递，将能量传递给发光微粒产生荧光，仪器检测获得数据。利用生物素-链霉亲和素的放大效应和高效价的单克隆抗体，及光激化学发光原理特性，达到反应时间很短、上样量少、灵敏度高、特异性好、测量范围宽，操作简单，便于临床使用，利于大规模推广应用。

Description

一种胃蛋白酶原Ⅰ的光激发化学发光检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种血清（血浆）中胃蛋白酶原Ⅰ的快速、定量、均相检测方法及试剂盒，属于体外试剂诊断领域中血清（浆）抗原的光激发化学发光免疫检测分析方法，用于实施疾病诊断和治疗方法的仪器或装置，属于光激发化学发光免疫分析技术领域。

背景技术

胃蛋白酶原Ⅰ（简称PGⅠ）是反映胃部状态的功能性指标——胃蛋白酶无活性前体，PGⅠ由胃底腺的主细胞、颈黏液细胞分泌，大部分进入胃腔，少量进入血液循环，而胃是PGⅠ的唯一来源，因此PGⅠ水平的变化可以反映胃粘膜状态和细胞数量的改变。

国内外临床研究指出，PGⅠ升高，提示胃黏膜破损可能性高，患胃溃疡、胃炎的风险增加；PGⅠ降低，则患有萎缩性胃炎的可能性明显增加，甚至有患胃癌的风险。测定PGⅠ含量有助检测出胃溃疡、萎缩性胃炎、胃炎、胃癌等其他消化道疾病，供临床检测和体检筛查需求。

国内外学者对胃癌患者的血清PG变化作了大量研究指出：胃癌患者的血清PG含量急剧降低，低分化癌患者PGⅠ含量更低于分化较高的胃癌患者；有数据显示，在被确诊的胃癌患者中，检测他们几年前的血样品可以发现，1/3的患者在当时还健康的情况下血清PG水平已经降低；PGⅠ与PGⅠ/PGⅡ比值并联使用灵敏度高，可有效应用于胃癌高发区人群的初步筛查。因此，PG检测被称为胃部的“血清学活检”，作为非侵入性方法，降低患者痛苦，简便、经济，具有普查价值。

在人群胃病筛查中，每个人做胃镜是不现实的，可通过非侵入性血清PG检测将浅表性胃炎、糜烂性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌等高危人群筛查出来，再进行胃镜检查是一种切实可行的方案。

光激发化学发光免疫分析技术是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发光免疫技术，该项技术前景广阔，将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。又称为AlphaLISA分析法，被誉为免洗的ELISA。其主要原理是由光激发产生的均相化学发光技术，它具有快速、均相（免洗）、高灵敏、量程宽和操作简便的特点。该试剂由含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约188nm，表面覆盖多糖水凝胶。水凝胶能减少非特异性结合，同时，增加微粒的悬浮性。微粒通过水凝胶表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增加了反应的表面积，每个微粒表面覆盖着成百上千个生物分子，可捕获目标分子。

该技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光（680nm）照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小（约为200nm）。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光（520nm-620nm）。反之，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心或受体-配体复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。

生物素-链霉亲和素与免疫分析试剂偶联起来，可大大提高免疫分析的测定灵敏度：因为链霉亲和素与生物素之间极高的亲和力，使反应结合更牢固稳定，而且特异性高；每个链霉亲和素（亲和素）可结合4个生物素，可使反应明显放大、减少反应中的空间位阻。

发明内容

本发明的目的是：提供一种新型的PGⅠ光激发化学发光免疫检测分析方法及试剂盒，运用生物素-链霉亲和素（包括亲和素）的放大效应和先进的光激发化学发光免疫检测技术，将双抗夹心法的信号放大，达到高灵敏、特异性好、量程范围宽、反应时间短的目的。

本发明的技术方案：一种血清胃蛋白酶原Ⅰ光激发化学发光检测方法，基于光激发化学发光免疫分析法，将链霉亲和素—生物素放大系统引入胃蛋白酶原Ⅰ双抗夹心体系中，在白色不透明微孔板中加入包被有抗胃蛋白酶原Ⅰ的一株高效价单抗的发光微粒和连有生物素的抗胃蛋白酶原Ⅰ的另一株单克隆抗体溶液，及胃蛋白酶原Ⅰ标准品或样品，避光反应，随后加入包被有链霉亲和素的感光微粒，孵育后检测。

所述的胃蛋白酶原Ⅰ光激发化学发光检测方法所用的试剂盒，由白色不透明微孔板（1），胃蛋白酶原Ⅰ标准品（2），连有抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体的发光微粒（3），生物素化抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体溶液（4）和包被有链霉亲和素的感光微粒（5）组成，胃蛋白酶原Ⅰ标准品浓度范围0-300ng/mL。

将一株抗PGⅠ抗体与发光微粒偶联，另一株抗PGⅠ抗体与生物素连接，在均相体系中形成感光微粒-抗体-抗原-抗体-生物素的复合物。通过链霉亲和素，感光微粒与双抗夹心复合物免疫夹心，实现感光微粒与发光微粒的特异性接近，从而实现能量传递，发出荧光信号，并被仪器测量出来。

本发明的有益效果：一、灵敏度高，检测至2.0ng/mL；二、量程宽，血清（浆）样本不需要稀释，样品浓度值介于0-300ng/mL的都能准确检测；三、检测时间短，从样品孵育到检测，约0.5小时完成；四，样品需求量少，一次上样只需20μL。

附图说明

图1：PGⅠ光激发化学发光免疫检测分析试剂盒的组成示意图；

1、白色不透明微孔板，2、PGⅠ标准品一套，3、包被有PGⅠ单抗的发光微粒，4、生物素化PGⅠ单抗试剂，5、包被有链霉亲和素的感光微粒。

图2：PGⅠ光激发化学发光免疫反应原理示意图。

图3：PGⅠ光激发化学发光免疫反应标准曲线图。

具体实施方式

实施例1 

包被有PGⅠ单抗的发光微粒制备

在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5 μL 1% Tween-20，0.05 mg PGⅠ单抗，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH 6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时。加入10μL 0.3 M pH 5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐（CMO）溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接PGⅠ单抗的发光微粒，稀释后备用。

PGⅠ光激发化学发光检测试剂盒的制备

试剂盒的组成：

(1)、白色不透明微孔板（12×8孔，可以拆分为单孔）。

(2)、1×包被有PGⅠ单抗的发光微粒（50μg/mL）：2mL。

(3)、6×PGⅠ标准品，0.5mL/瓶，标准液浓度为：0，10，50，100，200，300ng/mL。

(4)、1×生物素化抗PGⅠ单抗溶液（10μg/mL），2mL。

(5)、1×包被有链霉亲和素的感光微粒（20μg/mL）：20mL。

在所有恒温孵育过程中，避免光线照射。

PGⅠ光激发化学发光检测步骤

取包被有PGⅠ单抗的发光微粒、PGⅠ标准品或处理好的样品、一定浓度的生物素化抗PGⅠ单抗三种试剂，各20μL加到白色不透明微孔板，37℃孵育20分钟；加入175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃孵育10分钟；在光激化学发光检测仪上检测光信号。

结果处理：根据标准品浓度和对应荧光值绘制标准曲线，将样品的荧光值代入标准曲线中，计算得到样品中PGⅠ含量。

表1：显示PGⅠ光激发化学发光检测结果，其中第一列代表PGⅠ浓度，第二列代表荧光计数值（cps），夹心法测试实验结果如下表所示。

表1：PGⅠ光激发化学发光检测结果

PGⅠ(ng/mL)	荧光值(cps)
		0	203
10	1006
		50	4955
100	7799
		200	13135
300	17768

本发明所述实施例是指导性的，非限定性的，只是帮助理解本发明，因此本发明并不限于具体实施方式中所述的实施例，凡是由本领域技术员根据本发明的技术方案得出的其他具体实施方式，同样属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种血清胃蛋白酶原Ⅰ光激发化学发光检测方法，其特征在于：基于光激发化学发光免疫分析法，将链霉亲和素—生物素放大系统引入胃蛋白酶原Ⅰ双抗夹心体系中，在白色不透明微孔板中加入包被有抗胃蛋白酶原Ⅰ的一株高效价单抗的发光微粒和连有生物素的抗胃蛋白酶原Ⅰ的另一株单克隆抗体溶液，及胃蛋白酶原Ⅰ标准品或样品，避光反应，随后加入包被有链霉亲和素的感光微粒，孵育后检测。

2.权利要求1所述的胃蛋白酶原Ⅰ光激发化学发光检测方法所用的试剂盒，其特征在于：由白色不透明微孔板（1），胃蛋白酶原Ⅰ标准品（2），连有抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体的发光微粒（3），生物素化抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体溶液（4）和包被有链霉亲和素的感光微粒（5）组成，胃蛋白酶原Ⅰ标准品浓度范围0-300ng/mL。

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