CN109270274A

CN109270274A - 一种可定量检测末梢血中c反应蛋白含量的试纸条及制备方法

Info

Publication number: CN109270274A
Application number: CN201811322649.XA
Authority: CN
Inventors: 左云国; 赵亚丽
Original assignee: Chongqing Xinsaiya Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Xinsaiya Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2019-01-25

Abstract

本发明涉及一种可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其包括样品垫、量子垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和衬板，所述的量子垫上包被有碳量子点标记的C反应蛋白抗体，所述的硝酸纤维素膜上自所述的样品垫所在侧向着所述的吸水纸所在侧依次设置有检测线和质控线，所述的检测线上包被有识别C反应蛋白单克隆抗体，所述的质控线上包被有羊抗鼠IgG。本发明的试纸条结构简单，能够快速、准确、精准的对末梢血CRP进行定量检测，该试纸条的检测灵敏度高、稳定性强、特异性好，检测时间不大于15min，能够大大提高诊断效率以及检验操作人员的工作效率。

Description

一种可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条及制备方法

技术领域

本发明属于医学免疫学中量子点免疫荧光层析技术领域，具体涉及一种可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条及制备方法。

背景技术

CRP(C反应蛋白)是第一个被发现的机体急性期反应蛋白，普遍认为是一种非常敏感的炎症和组织损伤标记物，Tillett和Francis于1930年首先发现，肺炎患者血清中一种与肺炎球菌(现称肺炎链球菌)非型特异的菌体多糖成C多糖发生沉淀反应的物质。1941年Macleod和Avery先后证实这是一种急性感染时出现的蛋白质，与C多糖体的絮状沉淀反应依赖于Ca²⁺的存在。1944年，Joncs将其作为临床风湿热诊断标准的次要指标之一。之后研究人员发现，不仅在链球菌肺炎患者，亦可在其他各种急性期感染、炎症性疾病、坏死、外伤和恶性肿瘤患者都有类似的反应，其本质是机体对炎症状态的化学反应。CRP由肝细胞合成，CRP分子由5个相似的非糖基化多肽亚单位组成，每个亚单位包含206个氨基酸残基，其原体为以非共价键相连的环状结构，以5个为基数形成循环对称结构。其产生机理是：当机体受感染或组织受损伤时巨噬细胞和其他白细胞等被激活，产生白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子TNF-a等细胞因子及其他介导物，这些细胞因子和介导物到达肝脏，刺激肝细胞和上皮细胞合成CRP。疾病发生时，如风湿性关节炎或脓毒血症，CRP常于发病6-8h内开始升高，约48h达峰浓度300mg/L。基础研究表明，CRP浓度在一定范围内保持稳定，基线CRP浓度无显著的时间和季节等周期性变化。健康个体24h内无显著差异，饮食改变亦无明显影响，美国公共卫生署(PUS)的数据显示无论在吸烟者还是不吸烟者中，CRP的浓度和将来发生冠状动脉疾病都存在阳性联系。这项研究表明CRP浓度四分位数最高的个体将来发生中风可能性是正常人的2倍，将来发生心肌梗死和外周血管疾病可能性是正常人的3倍。故任何时间测定的CRP均有较大的临床参考价值。

目前，检测CRP的常用方法有：ELISA法、胶体金法、免疫荧光层析法、电化学发光法，但是这些检测方法，耗时较长，所采用的血样本均为静脉血。对于婴儿、大面积烧伤以及某些经常需要采血监测CRP水平的成人患者和儿童等患者或者而言，不宜反复抽取静脉血，末梢血采取方便、快捷，对人体造成的创伤小，是较好的血样本来源。

末梢血与静脉血在成分与采血方式和采血位点上是有较大区别的，例如RBC、Hb、HCT、MCHC(红细胞平均血红蛋白浓度)检测中末梢血明显低于静脉血。除此之外，末梢血的采血量一般比较少，抽血量与检验项目多少有关，静脉血的抽血量一般为几毫升，末梢血多在0.1～0.5mL左右，比较难以满足试纸条检测所需的最小样本量。此外在三甲医院的门诊、妇幼保健院的检验科，每天末梢血的样本很多并且集中，按照目前的操作速度，导致患者等待时间过长，也影响医院的日检测量。因此，虽然目前有一些CRP检测试剂盒测定静脉血中CRP的含量，但是这些试纸条不能快速、准确检测出末梢血中CRP的含量。

量子点或半导体纳米微晶体，作为一种新型的荧光标记物于20世纪70年代末应用于生物医学领域，与传统的荧光染料相对比，由主族Ⅱ-Ⅵ(如CdSe)或者Ⅲ-Ⅴ(如InP、InAs、GaSe)元素组成的稳定的纳米微晶体及其衍生物，具有许多独特的性质：激发光谱宽而连续、发射光谱窄而对称、荧光信号强且寿命长、光化学稳定性好。量子点微球(Quantumdot submicrobeads)是将大量的量子点通过化学方法偶联形成微球，量子点微球具有较高的荧光强度和光学稳定性。使用量子点微球标记抗体制备试纸条可以使更多的发光分子连接到抗体上，从而使荧光信号值放大；可以克服外界环境对发光试剂如猝灭作用，增加发光试剂的稳定性；可减少荧光分子的泄露，降低量子点对活性的影响；同时可提高试纸条的灵敏度。但是，目前的CRP试剂盒的准确性和重复性仍有待提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种准确性和重复性好的可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条及制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其包括样品垫、量子垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和衬板，所述的量子垫上包被有碳量子点标记的C反应蛋白抗体，所述的硝酸纤维素膜上自所述的样品垫所在侧向着所述的吸水纸所在侧依次设置有检测线和质控线，所述的检测线上包被有识别C反应蛋白的单克隆抗体，所述的质控线上包被有羊抗鼠IgG。

优选地，所述的碳量子点的最大粒径小于12nm。

优选地，所述的碳量子点标记的C反应蛋白抗体由碳量子点标记的亲和素与生物素标记的C反应蛋白抗体偶联形成。

进一步优选地，所述的碳量子点与所述的亲和素的投料质量比为1：0.15～0.25。

进一步优选地，所述的生物素标记的C反应蛋白抗体通过向C反应蛋白抗体中投加生物素溶液制得，其中，所述的生物素与所述的C反应蛋白抗体的质量比为15～25：1，所述的C反应蛋白抗体和所述的生物素溶液的投料体积比为1：0.01～0.02。进一步优选地，所述的碳量子点标记的亲和素与所述的生物素标记的C反应蛋白抗体的投料质量比为0.3～0.5：1。

进一步优选地，所述的碳量子点标记的C反应蛋白抗体通过如下步骤制备得到：

(1)将葡萄糖溶液在170～190℃下进行水热反应10～30h，冷却后，用超声波震荡处理30～40min，然后经过滤得到碳量子点溶液；

(2)将所述的碳量子点溶液、聚乙二醇和水按体积比为2～3：0.5～0.7：1的比例混合，超声处理30～40min，然后在170～190℃下钝化25～35h；

(3)将钝化后的碳量子点溶液、PBS缓冲液和EDC盐酸盐混合均匀，然后加入链霉亲和素，在10～30℃下搅拌反应2～4h，经硅胶柱层析、PBS缓冲液洗脱、分离纯化得到碳量子点标记的亲和素；

(4)将C反应蛋白抗体和PBS缓冲液混合离心后，加入生物素溶液和PBS缓冲液，37℃避光温育0.5～1h，经离心后，多次加入PBS缓冲液并离心，然后加入Tris保存液，经吹打离心后，得到生物素标记的C反应蛋白抗体溶液；

(5)将步骤(3)得到的碳量子点标记的亲和素和步骤(4)得到的生物素标记的C反应蛋白抗体溶液混合得到所述的碳量子点标记的C反应蛋白抗体。

由于生物素和亲和素之间有极强的亲和力，比抗体对抗原的亲和力要高出100万倍，碳量子点标记的亲和素有4个亚单位，具有4个同生物素亲和力极高的结合位点，通过这结合位点与生物素标记的C反应蛋白抗体偶联。

优选地，所述的试纸条还包括能够容纳所述的样品垫、所述的量子垫、所述的硝酸纤维素膜、所述的吸水纸和所述的衬板的下壳，盖设在所述的下壳上的上壳，开设在所述的上壳上能够向所述的样品垫上滴加样品的加样孔，开设在所述的上壳上能够看到所述的检测线和所述的质控线的观察窗。

优选地，所述的样品垫和所述的量子垫由经过表面活性剂处理的玻璃纤维组成。

本发明的另一个目的是提供一种所述的试纸条的制备方法，包括如下步骤：

(1)将碳量子点标记的C反应蛋白抗体以0.8～1.2μL/cm的量喷涂在量子垫上，干燥制得包被有碳量子点标记的C反应蛋白抗体的量子垫；

(2)将硝酸纤维素膜粘贴到所述的衬板上，将CRP抗体用印膜缓冲液稀释成0.8～1.2mg/mL，将羊抗鼠IgG用印膜缓冲液稀释成0.8～1.2mg/mL，然后分别以0.8～1.2μL/cm的量喷涂在所述的硝酸纤维素膜上，干燥得到含有质控线和检测线的硝酸纤维素膜；其中，所述的印膜缓冲液包括浓度为0.01～0.03mol/L、pH7～7.4的PBS缓冲液、质量百分浓度为0.8～1.2％的海藻糖、浓度为8～12mmol/L的乙二胺四乙酸、质量百分浓度为0.08～0.12％的proclin300；

(3)将吸水纸的一端与衬板的一端对齐，吸水纸的另一端压在所述的硝酸纤维素膜的一端上，且压住1～1.5mm；将量子垫的一端压在所述的硝酸纤维素膜的另一端上，且压住0.5～1mm；将样品垫的一端压在所述的量子垫的另一端上，且压住1.5～2mm，将样品垫的另一端与衬板的另一端对齐。

本发明采用量子点免疫荧光技术，将量子点标记的亲和素与生物素标记的抗体通过偶联形成量子点标记物，此标记物稳定性良好、发光强度高，可提高检测的稳定性。

本发明采用碳量子点标记抗体，使得试纸条的灵敏度有很大程度上的提高。

本发明试纸条免疫层析后，质控线靠近吸水纸，检测线靠近样品垫，可通过荧光免疫分析仪检测检测线和质控线，检测线与质控线荧光信号之比得出检测结果，该方法自动化，大大减少了人为主观因素的干扰，诊断结果更加快速、准确、可靠。

本发明可提高检测灵敏度，降低非特异性结合的可能，试剂盒性能得以改善。

通过本发明对人体内C反应蛋白进行检测，检测时间不大于15分钟，检测线性范围为0.5～150mg/L，在很大程度上提高了检测效率。

本发明的塑料卡设有滴加样品的加样孔和可供检测和观察结果的观察窗，观察窗上有明确的C、T标识，根据仪器判断结果，准确、真实、快速、可靠。

本发明制备方便，体积小，便于运输和携带，检测成本相对较低，批量生产的批内和批间差小，可应用于临床上的快速诊断以及现场的快速诊断；可常温保存，不仅有利于在三甲和大型医院推广还有利于基层医疗单位使用。

本发明可以检测末梢血。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的试纸条结构简单，能够快速、准确、精准的对末梢血CRP进行定量检测，该试纸条的检测灵敏度高、稳定性强、特异性好，检测时间不大于15min，能够大大提高诊断效率以及检验操作人员的工作效率。

附图说明

附图1为本发明试纸条的结构示意图(不含上壳和下壳)；

附图2为本发明试纸条的透视图；

附图3为本发明试纸条的俯视图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件，本发明中的试剂均可市购。

实施例1、检测试剂卡的制备

1、样品垫5的优化：

1.1、材料与试剂：

(1)样品垫5：玻璃纤维材质。

(2)样品垫5：杭州纳晶生物科技有限公司。

(3)样品垫优化缓冲液：50mmol/L、pH8.2的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、质量百分浓度为0.5％的吐温20、质量百分浓度为0.1％的proclin300、以及余量的纯化水。

1.2、将样品垫5浸没在样品垫优化缓冲液中，浸没30～45min，然后干燥间干燥5h以上，湿度控制在30％以下。

2、量子垫4的优化：

2.1、材料与试剂

(1)量子垫4：玻璃纤维材质。

(2)量子垫4：杭州纳晶生物科技有限公司。

(3)量子垫优化缓冲液：50mmol/L、pH8.2的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)、质量百分浓度为0.5％的吐温(Tween)20、质量百分浓度为2％的蔗糖、质量百分浓度为0.1％的proclin300、以及余量的纯化水。

2.2、将量子垫4浸没在量子垫优化缓冲液中，浸没30～45min，然后干燥间干燥5h以上，湿度控制在30％以下。

3、包被有碳量子点(CQD_S)标记的C反应蛋白抗体的量子垫4的制备

3.1、材料与试剂

(1)步骤2优化后的量子垫4。

3.2、制备方法

量子点采用水热法制备CQD_S，具体操作为在100mL的不锈钢高压釜四氟乙烯内胆中加入50mL的5mmol/L的葡萄糖溶液，在180℃的条件下反应11h，溶液冷却至室温，用超声波震荡处理35min后用0.22μm的滤膜过滤除去大颗粒可获得CQD_S溶液，制得的CQD_S的最大粒径小于12nm，之后将6mL的聚乙二醇和10mL蒸馏水与25mLCQD_S溶液混合均匀，超声35min后，加入到100mL的高压釜中，180℃的条件下钝化29h。

将钝化好的CQD_S加入到50mL PBS(0.15mol/L，PH＞8)缓冲液中，向其中加入EDC盐酸盐(8.7g/L)混合均匀后加入链霉亲和素(CQD_S：EDC：SA质量比为1：3.5：0.2)，在室温条件下搅拌反应3h，硅胶柱层析，PBS洗脱，分离纯化后可得CQD_S-SA。

将1mgCRP抗体置于超滤管中，按照抗体终浓度为2mg/ml加入PBS缓冲液(PH7.2～7.4)，12000r离心15min后加入生物素溶液和PBS缓冲液(PH7.2～7.4)，使得最终体积为0.5mL，在37℃避光温育1h，12000r离心15min。加入PBS缓冲液(PH7.2～7.4)，使得最终体积为0.5mL，12000r离心15min，3次。加入标记物保存液Tris(PH8.0～9.0)，轻轻吹打后，将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6000r离心15min，3次后收集离心管中的溶液即为生物素标记的C反应蛋白抗体溶液。(其中CRP抗体：生物素溶液体积比为1：0.01，生物素与C反应蛋白抗体的质量比为20：1)。

将制得的碳量子点标记的亲和素和制得的生物素标记的C反应蛋白抗体溶液按照碳量子点标记的亲和素与生物素标记的C反应蛋白抗体的质量比为0.4：1进行投料混合，得到碳量子点标记的C反应蛋白抗体。

将碳量子点标记的C反应蛋白抗体以1μL/cm的量喷涂在量子垫上，干燥制得包被有碳量子点标记的C反应蛋白抗体的量子垫4。

4、硝酸纤维素膜2上检测线和质控线的制备

4.1、材料与试剂

(1)硝酸纤维素膜2。

(2)衬板1：PVC板。

(3)质控线C：羊抗鼠IgG。

(4)检测线T：CRP-Ab。

(5)印膜缓冲液：浓度为0.01～0.03mol/L、pH7.2的PBS缓冲液、质量百分浓度为1％的海藻糖、浓度为10mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、质量百分浓度为0.1％的proclin300。

4.2、制备方法

将硝酸纤维素膜2粘贴到衬板1上，将CRP抗体用印膜缓冲液稀释成1mg/mL，将羊抗鼠IgG用印膜缓冲液稀释成1mg/mL，根据工艺要求用划膜喷金仪以1μL/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜2上，干燥0.5h制得质控线和检测线。

5、检测试剂卡的组装

将吸水纸3的一端与衬板1的一端对齐，吸水纸3的另一端压在硝酸纤维素膜2的一端上，且压住1～1.5mm；将量子垫4的一端压在硝酸纤维素膜2的另一端上，且压住0.5～1mm；将样品垫5的一端压在量子垫4的另一端上，且压住1.5～2mm，将样品垫5的另一端与衬板1的另一端对齐，如图1所示，将组装好的衬板1、硝酸纤维素膜2、样品垫5、量子垫4和吸水纸3放入下壳61内，盖上上壳60得到试剂盒，如图2和3所示。

本发明的量子垫4上固定有量子点标记的CRP鼠单克隆抗体(北京久峰润达生物技术有限公司)(浓度0.1-0.3μM)，硝酸纤维素膜2上固定有另一株CRP鼠单克隆抗体(北京雅安达生物技术有限公司)制成固相抗体即检测线(T线)(浓度0.5～2.0mg/mL)和固定有羊抗鼠IgG制成固相抗体即质控线(C线)(浓度0.5～1.5mg/mL)，质控线C线主要用于检测试纸条是否有效。量子点荧光免疫是一种新型检测信号的用于体外诊断试剂生产的方法。

当待测样本垂直滴加到样品垫5上时，样本中的CRP通过虹吸作用流经量子垫4，与量子垫4上的量子点标记的CRP抗体(Mark-CRP*Quantum Dots)反应后形成复合物CRP-Mark-CRP*Quantum Dots，在层析的作用下反应形成的复合物继续向前流动经过硝酸纤维素膜2固定的CRP抗体(检测T线)时，反应复合物与包被的CRP抗体(Mab-CRP)形成新的复合物(Mab-CRP-CRP-Mark-CRP*Quantum Dots)，通过荧光免疫分析仪可读取荧光信号值即(T值)；量子垫4上的量子点标记的CRP抗体(Mark-CRP*Quantum Dots)在虹吸作用下流经T线形成(Mab-CRP-Mark-CRP*Quantum Dots)在与C线(Mab-IgG)反应形成复合物(Mab-IgG-Mab-CRP-Mark-CRP*Quantum Dots)，通过荧光免疫分析仪可读取荧光信号值即(C值)。计算T/C值，根据SD卡内的标准曲线即可算出样品中CRP的浓度，从而得到CRP的含量。

对比例1

基本上与实施例1相同，不同之处在于：采用带有功能团巯基羧酸的量子点直接与抗体结合。

C反应蛋白量子点荧光免疫层析检测试纸条对样本的检测

使用实施例1和对比例1中的试纸条对不同病人的末梢血和静脉血进行检测，其中末梢血重复检测2次，以确定检测结果的稳定性，将末梢血和静脉血检测的结果进行分析比较，用以确定该C反应蛋白量子点荧光免疫层析检测试纸条可用来检测末梢血。实施例1的检测结果见表1，对比例1的检测结果见表2。

表1

从检测结果可以看出，本发明的试纸条稳定性好，用末梢血检测的结果与用静脉血检测结果关联性很好，可以满足用末梢血检测，辅助临床诊断的需要。故，用该试纸条对末梢血进行CRP含量的检测可行。本试纸条也适用于静脉血中CRP的检测。

表2

从实验数据可看出相关性不好，且复孔重复性差。

使用实施例1和对比例1中的试纸条对校准点10mg/L等倍比稀释进行检测，重复检测3次，将检测的结果进行分析比较，用以确定该C反应蛋白量子点荧光免疫层析检测试纸条检测最低浓度。实施例1的检测结果见表3，对比例1的检测结果见表4。

表3

从检测结果可以看出，本发明的试纸条的最低检测浓度可达0.3mg/L。

表4

从实验数据可看出对比例1的试纸条检测10mg/L时，检测结果已存在较大误差。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其包括样品垫、量子垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和衬板，其特征在于：所述的量子垫上包被有碳量子点标记的C反应蛋白抗体，所述的硝酸纤维素膜上自所述的样品垫所在侧向着所述的吸水纸所在侧依次设置有检测线和质控线，所述的检测线上包被有识别C反应蛋白的单克隆抗体，所述的质控线上包被有羊抗鼠IgG。

2.根据权利要求1所述的可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其特征在于：所述的碳量子点的最大粒径小于12nm。

3.根据权利要求1所述的可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其特征在于：所述的碳量子点标记的C反应蛋白抗体由碳量子点标记的亲和素与生物素标记的C反应蛋白抗体偶联形成。

4.根据权利要求3所述的可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其特征在于：所述的碳量子点与所述的亲和素的投料质量比为1：0.15~0.25。

5.根据权利要求3所述的可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其特征在于：所述的生物素标记的C反应蛋白抗体通过向C反应蛋白抗体中投加生物素溶液制得，其中，所述的生物素与所述的C反应蛋白抗体的质量比为15~25：1，所述的C反应蛋白抗体和所述的生物素溶液的投料体积比为1：0.01~0.02。

6.根据权利要求3所述的可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其特征在于：所述的碳量子点标记的亲和素与所述的生物素标记的C反应蛋白抗体的投料质量比为0.3~0.5：1。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其特征在于：所述的碳量子点标记的C反应蛋白抗体通过如下步骤制备得到：

（1）将葡萄糖溶液在170~190℃下进行水热反应10~30h，冷却后，用超声波震荡处理30~40min，然后经过滤得到碳量子点溶液；

（2）将所述的碳量子点溶液、聚乙二醇和水按体积比为2~3:0.5~0.7:1的比例混合，超声处理30~40min，然后在170~190℃下钝化25~35h；

（3）将钝化后的碳量子点溶液、PBS缓冲液和EDC盐酸盐混合均匀，然后加入链霉亲和素，在10~30℃下搅拌反应2~4h，经硅胶柱层析、PBS缓冲液洗脱、分离纯化得到碳量子点标记的亲和素；

（4）将C反应蛋白抗体和PBS缓冲液混合离心后，加入生物素溶液和PBS缓冲液，37℃避光温育0.5~1h，经离心后，多次加入PBS缓冲液并离心，然后加入Tris保存液，经吹打离心后，得到生物素标记的C反应蛋白抗体溶液；

（5）将步骤（3）得到的碳量子点标记的亲和素和步骤（4）得到的生物素标记的C反应蛋白抗体溶液混合得到所述的碳量子点标记的C反应蛋白抗体。

8.根据权利要求1所述的可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其特征在于：所述的试纸条还包括能够容纳所述的样品垫、所述的量子垫、所述的硝酸纤维素膜、所述的吸水纸和所述的衬板的下壳，盖设在所述的下壳上的上壳开设在所述的上壳上能够向所述的样品垫上滴加样品的加样孔，开设在所述的上壳上能够看到所述的检测线和所述的质控线的观察窗。

9.根据权利要求1所述的可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其特征在于：所述的样品垫和所述的量子垫由经过表面活性剂处理的玻璃纤维组成。

10.一种如权利要求1至9中任一项所述的试纸条的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将碳量子点标记的C反应蛋白抗体以0.8~1.2μL/cm的量喷涂在量子垫上，干燥制得包被有碳量子点标记的C反应蛋白抗体的量子垫；

（2）将硝酸纤维素膜粘贴到所述的衬板上，将CRP抗体用印膜缓冲液稀释成0.8~1.2mg/mL，将羊抗鼠IgG用印膜缓冲液稀释成0.8~1.2mg/mL，然后分别以0.8~1.2μL/cm的量喷涂在所述的硝酸纤维素膜上，干燥得到含有质控线和检测线的硝酸纤维素膜；其中，所述的印膜缓冲液包括浓度为0.01~0.03mol/L、pH7~7.4的PBS缓冲液、质量百分浓度为0.8~1.2%的海藻糖、浓度为8~12mmol/L的乙二胺四乙酸、质量百分浓度为0.08~0.12%的proclin300；

（3）将吸水纸的一端与衬板的一端对齐，吸水纸的另一端压在所述的硝酸纤维素膜的一端上，且压住1~1.5mm；将量子垫的一端压在所述的硝酸纤维素膜的另一端上，且压住0.5~1mm；将样品垫的一端压在所述的量子垫的另一端上，且压住1.5~2mm，将样品垫的另一端与衬板的另一端对齐。