CN114113604A - 一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，以藻红蛋白作为荧光标记物、以磁性荧光编码微球作为载体，分别将Tim‑3、GP73和Pre‑S1捕获抗体偶联于不同磁性聚苯乙烯荧光编码微球表面，同时分别将Tim‑3、GP73和Pre‑S1检测抗体与藻红蛋白共价偶联，最终与抗原形成荧光免疫复合体，通过识别不同编码微球区分不同检测指标，通过检测藻红蛋白荧光强度计算待测物浓度，本发明可以同时检测待测样品中Tim‑3、GP73和Pre‑S1三种与肝病相关的标志蛋白，效率高、特异性强、灵敏度高、重复性好，可在临床检测、流行病学调查等方面发挥重要作用。

Description

一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，更具体一点说，涉及一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，属于生物技术检测领域。
背景技术
肝脏是人体的重要器官，易发多种良恶性疾病。肝脏的恶性肿瘤中最常见的是原发性肝癌，它是全球死亡率第三的恶性肿瘤，也是我国发病率排名第三位、死亡率高居第二位的恶性肿瘤。肝脏的良性疾病中，慢性肝炎和肝硬化与肝癌的发生息息相关。以血清为基础的标志物对肝脏相关疾病的诊断十分关键，由于血液样本容易获得，对患者创伤性小，所以血清学检查更容易被广大患者接受。但是单一血清标志物的诊断效能有限的问题，2种或2种以上的血清标志物联合检测时能提高疾病的检出率。
Tim-3可广泛表达在多种免疫细胞中，它可以通过调节免疫细胞的功能，影响细胞免疫反应，从而导致多种肿瘤的发生与发展。Tim-3可异位高表达于肝癌细胞中，Tim-3的高表达促进了肝癌细胞的生长，同时抑制了T细胞的增殖和细胞因子的产生，促进了肝癌的发展。此外Tim-3也高表达在多种肝癌浸润免疫细胞上。一部分Tim-3是可溶性的，可以分泌到血液之中从而被检测。
高尔基体蛋白73(GP73)是高尔基体膜上的一种跨膜蛋白，定位于高尔基体顺面。在正常的肝细胞中并不表达GP73，仅在紧邻胆管面的细胞质中有GP73表达，而在肝脏疾病的患者中，GP73往往高表达。一项对血清GP73和AFP诊断肝细胞肝癌的敏感性和特异性的研究显示，GP73诊断肝细胞肝癌的敏感性和特异性分别为76％、86％，而AFP的敏感性和特异性分别为70％、89％。因此，血清GP73对肝细胞肝癌的诊断具有重要价值。
乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白包括S、前S2和前S1三种成分。Pre-S1在病毒侵入肝细胞过程中起重要作用。病毒附着于肝细胞上，最重要的介导部位是前S1蛋白的氨基酸(AA)21-47片段，变异的病毒只要这一区段完好就有传染性。Pre-S1在病毒感染、装配、复制和刺激机体产生免疫反应等方面起有十分重要作用。Pre-S1是人体在感染HBV病毒后最先出现免疫应答反应抗原成分，且此类抗原在HBV-DNA阳性血清中的检出率较高，故其与HBV-DNA检验结果具有较高的符合性，且Pre-S1阳性率与患者体内HBV病毒载量程度为正相关关系，故可在临床检验中通过乙肝病毒前S1抗原检测，实现对乙肝患者病情的有效诊断及评估。
流式微球技术利用球形基质作为载体,以流式细胞术作为检测平台,可以在较短时间内对生物分子进行大规模检测。该系统主要基于流式荧光编码微球，检测通量大、灵敏度高,可实现同步检测多靶标，具有较为广阔的应用空间。
发明内容
本发明目的在于提供具有能够利用不同荧光编码磁性微球和同一种荧光蛋白实现在同一份样品中同时检测三项指标等技术特点的一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，包括被同步检测的肝病相关标志蛋白Tim-3、GP73和Pre-S1，该检测方法包括如下步骤：
步骤1)：将Tim-3、GP73和Pre-S1捕获抗体分别包被在不同荧光编码磁性微球表面，形成微球-捕获抗体复合物；
步骤2)：将微球-捕获抗体复合物、待测样品和藻红蛋白标记的检测抗体一起孵育，形成微球-捕获抗体-抗原-藻红蛋白标记的检测抗体免疫复合物；
步骤3)：再根据微球荧光类型和荧光强度进行检测分析。
优选的，将Tim-3、GP73和Pre-S1捕获抗体分别包被在不同荧光编码磁性微球表面的包被比例为：20μg抗体包被5×106个荧光编码磁性微球；各捕获抗体与对应的荧光编码磁性微球的孵育条件为：室温避光震荡1.5h。
优选的，荧光编码的磁性微球为具有羧基基团的磁性聚苯乙烯荧光编码微球。
优选的，步骤3)中是通过识别不同荧光编码磁性微球区分不同检测指标，并且通过检测藻红蛋白荧光强度计算待测物浓度。
优选的，步骤2)与步骤3)间还具有如下步骤：利用离心管和磁力架对荧光编码磁性微球进行洗涤和分离，去除未结合抗体。
优选的，检测抗体免疫复合物是以藻红蛋白作为荧光标记物，利用双抗体夹心法形成抗原、抗体复合物，并能够根据荧光强度计算待测物含量。
优选的，藻红蛋白偶联的Tim-3、GP73和Pre-S1捕获抗体的浓度均为30μg/mL，每1mg抗体偶联藻红蛋白3.5mg。
优选的，所述微球-捕获抗体复合物是通过活化磁性微球表面表面的羧基基团，并通过羧基基团实现与Tim-3、GP73、Pre-S1抗体上的氨基形成共价键而形成复合物。具体是利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)。
优选的，所述检测抗体是指Tim-3、GP73和Pre-S1单克隆抗体。
本发明一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测的试剂盒，包括试剂盒以及放在试剂盒内的多个药剂盒，其中，具有放置不同荧光编码磁性微球的药剂盒，荧光编码微球包含有分别包被Tim-3、GP73和Pre-S1捕获抗体的荧光编码微球；具有放置检测抗体的药剂盒，检测抗体包括分别偶联藻红蛋白的Tim-3、GP73和Pre-S1检测抗体，具有放置标准品溶液的药剂盒，所述标准品溶液包括Tim-3、GP73和Pre-S1标准品溶液，具有放置缓冲液的药剂盒，所述缓冲液为pH7.4的PBS缓冲液。试剂盒为可发性聚苯乙烯泡沫，盒体与盒盖由酚醛塑料材质的连接轴连接，试剂盒底部预制有存放碎冰的冰槽。
有益效果：本发明可以同时检测待测样品中Tim-3、GP73和Pre-S1三种与肝病相关的标志蛋白，效率高、特异性强、灵敏度高、重复性好，可在临床检测、流行病学调查等方面发挥重要作用。
附图说明
图1是本发明Tim-3(A)的检测标准曲线图。
图2是本发明GP73(B)的检测标准曲线图
图3是本发明Pre-S1(C)的检测标准曲线图
具体实施方式
以下结合说明书附图1-3，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
为使本发明的目的、方法及优点更加清楚明确，下面结合具体实施例对本发明做出详细说明，所述的实施例只用于说明本发明，而不是用于对本发明进行限定，任何在本发明基础上所做的修改、等同替换等均在本发明的保护范围内。
本发明一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法的技术方案如下：
首先，将Tim-3、GP73和Pre-S1捕获抗体分别包被在不同荧光编码磁性微球表面，形成微球-捕获抗体复合物，20μg抗体包被5×106个磁珠，抗体与微球的孵育条件为室温避光震荡1.5h。利用离心管和磁力架对编码荧光微球进行洗涤和分离，去除未结合抗体。其次，将微球-捕获抗体复合物与待测样品和藻红蛋白标记的检测抗体孵育，孵育条件为避光、37℃震荡1h，形成微球-捕获抗体-抗原-藻红蛋白标记的检测抗体免疫复合物，经仪器检测荧光类型和荧光信号强度完成检测。
所述包被抗体是指Tim-3、GP73和Pre-S1单克隆抗体。所述微球-捕获抗体复合物，是通过活化荧光微球表面的羧基[利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)]，将其分别与Tim-3、GP73和Pre-S1抗体上的氨基形成共价键，从而形成复合物。所述检测抗体是指Tim-3、GP73和Pre-S1单克隆抗体。所述的微球-捕获抗体-抗原-藻红蛋白标记的检测抗体免疫复合物是指在每步孵育完成后利用离心和磁力架去除未结合成分后的物质。所述样品制备过程中的离心管和磁力架，可用酶标板和96孔板磁力架替代。所述荧光检测分析是指利用检测仪器发射的两束不同波长激发光照射免疫复合体，由荧光编码微球的荧光类型确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定检测指标含量。检测仪器优选Tesmi F4000全自动流式荧光发光免疫分析仪。磁性微球优选美国Luminex生产。
实施例1微球-Tim-3捕获抗体偶联
5×106个荧光编码磁性微球(以下简称：微球)为一个批次，将其加入至1.5mL离心管中，依次加入EDC和NHS溶液，在室温、酸性条件下活化微球表面30min，随后利用磁力架将微球清洗，加入30μg抗体，室温避光震荡1.5h，利用磁力架去除未过量的抗体，加入1％BSA，室温避光震荡30h以封闭未结合位点。
实施例2藻红蛋白偶联Tim-3检测抗体
藻红蛋白冻干粉用0.1M pH值7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，浓度调整到5-10mg/mL，将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)配制成10mg/mL，每毫克的藻红蛋白添加11uL的琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)，室温旋转反应1h，将衍生化的藻红蛋白过柱，收集藻红蛋白峰，二硫苏糖醇(DTT)溶解于蒸馏水中，配制成1mol/L，调整抗体的浓度，使其浓度为4mg/mL。每mL抗体溶液中加入20ul的二硫苏糖醇(DTT)，室温静置反应40min，将反应液过柱，收集抗体部分。每1mg抗体加入3.2mg的琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)衍生化的藻红蛋白，于室温旋转反应1h，使藻红蛋白分子上的马来酰亚胺基和抗体上的巯基实现共价交联，加入3.4微升N-乙基马来酰胺(NEM)，于室温旋转反应1h，使抗体上的巯基封闭，将交联物于存储缓冲液中透析后保存于冰箱。
实施例3微球-捕获抗体-抗原-藻红蛋白标记的检测抗体免疫复合物形成
1.5mL离心管中加入微球-Tim-3捕获抗体偶联物、待测样品溶液和藻红蛋白偶联Tim-3检测抗体，37℃避光震荡1h，得到荧光免疫复合物，并上机检测。
实施例4Tim-3、GP73和Pre-S1检测的线性范围、灵敏度、特异性及精密度
分别制备Tim-3、GP73和Pre-S1标准品，利用本试剂盒进行检测，绘制标准曲线，利用荧光值和浓度值绘制标准曲线，Tim-3线性方程为：y＝503.08x+3294.2，R2＝0.9988，线性范围为1ng/ml～500ng/ml，结果图1所示。
GP73线性方程为：y＝354.41x+3868.4，R2＝0.9998，线性范围为2ng/ml～1000ng/ml，结果图2所示。
Pre-S1线性方程为：y＝1022.2x+722.46，R2＝0.9992，线性范围为1ng/ml～200ng/ml，结果图3所示。
平行测定10次0ng/ml参考标准品的荧光值，并计算其均值(mean)及标准差(SD)，采用mean+2SD代入标准曲线方程，计算得到本试剂盒对Tim-3的检测灵敏度为0.55ng/ml，对GP73的检测灵敏度为1.29ng/ml，对Pre-S1的检测灵敏度为0.41ng/ml。使用试剂盒同步检测20ng/ml的KIM-1、CA125、AFP、CEA，250IU/mL HBsAg、0.1NCU/mL HBeAg，结果均为阴性，结果表明本试剂盒与以上蛋白无交差反应。
分别检测Tim-3、GP73和Pre-S1的低值样本、中值样本、高值样本各10次，得到Tim-3批内变异系数为3.88％-8.09％(＜10％)，批间变异系数为8.77％-11.15％(＜15％)。GP73批内变异系数为5.35％-9.45％(＜10％)，批间变异系数为7.62％-14.77％，Pre-S1批内变异系数为3.14％-9.58％(＜10％)，批间变异系数为8.14％-12.63％(＜15％)。
表1 Tim-3检测精密度
Figure BDA0003322998250000071
表2 GP73检测精密度
Figure BDA0003322998250000072
表3 Pre-S1检测精密度
Figure BDA0003322998250000073
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，包括被同步检测的肝病相关标志蛋白Tim-3、GP73和Pre-S1，其特征在于该检测方法包括如下步骤：
步骤1)：将Tim-3、GP73和Pre-S1捕获抗体分别包被在不同荧光编码磁性微球表面，形成微球-捕获抗体复合物；
步骤2)：将微球-捕获抗体复合物、待测样品和藻红蛋白标记的检测抗体一起孵育，形成微球-捕获抗体-抗原-藻红蛋白标记的检测抗体免疫复合物；
步骤3)：再根据微球荧光类型和荧光强度进行检测分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，其特征在于：将Tim-3、GP73和Pre-S1捕获抗体分别包被在不同荧光编码磁性微球表面的包被比例为：20μg抗体包被5×106个荧光编码磁性微球；各捕获抗体与对应的荧光编码磁性微球的孵育条件为：室温避光震荡1.5h。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，其特征在于：荧光编码的磁性微球为具有羧基基团的磁性聚苯乙烯荧光编码微球。
4.根据权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，其特征在于：步骤3)中是通过识别不同荧光编码磁性微球区分不同检测指标，并且通过检测藻红蛋白荧光强度计算待测物浓度。
5.根据权利要求1或4所述的一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，其特征在于：步骤2)与步骤3)间还具有如下步骤：利用离心管和磁力架对荧光编码磁性微球进行洗涤和分离，去除未结合抗体。
6.根据权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，其特征在于：检测抗体免疫复合物是以藻红蛋白作为荧光标记物，利用双抗体夹心法形成抗原、抗体复合物，并能够根据荧光强度计算待测物含量。
7.根据权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，其特征在于：藻红蛋白偶联的Tim-3、GP73和Pre-S1捕获抗体的浓度均为30μg/mL，每1mg抗体偶联藻红蛋白3.5mg。
8.根据权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，其特征在于：所述微球-捕获抗体复合物是通过活化磁性微球表面表面的羧基基团，并通过羧基基团实现与Tim-3、GP73、Pre-S1抗体上的氨基形成共价键而形成复合物。
9.根据权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的肝病相关标志物同步检测方法，其特征在于：所述检测抗体是指Tim-3、GP73和Pre-S1单克隆抗体。
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