CN109580951A - 多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测试剂盒技术领域，公开了多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒及其使用方法。本发明提供的多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒包括清洗缓冲液、Luminex荧光微球和藻红蛋白标记的二抗，Luminex荧光微球分别与AFP、AFP‑L3、GPC3、MDK、SCCA和DCP六种捕获抗体分子共价结合，从而具有不同的颜色编码，并且通过检测血清中的AFP、AFP‑L3、GPC3、MDK、SCCA和DCP的含量来诊断早期肝癌。本发明提供的多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒及其使用方法可以对AFP、AFP‑L3、GPC3、MDK、SCCA和DCP指标进行检测，准确率高，敏感度得到提升。

Description

多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于检测试剂盒技术领域，具体涉及多抗体联合检测早期肝癌标志 物的试剂盒及其使用方法。
背景技术
肝癌是恶性程度极高，预后极差的恶性肿瘤，被称为“癌中之王”。全世界 半数左右的肝癌患者集中在中国，我国每年约有11万人死于肝癌，肝癌居恶性 肿瘤病死率的第二位。目前临床肝癌诊疗中还存在着早期诊断难、复发转移率 高、治疗缺乏针对性、源头创新药物和治疗手段少等问题，因此，对肝癌分子 发病机制及肝癌诊治新技术、新疗法的研究尤为重要和迫切。
早期、正确的诊断对肝癌患者至关重要。21世纪的肝癌诊断包括对肝癌的 病理诊断、临床分期诊断、复发和转移的诊断、疗效和预后的判断以及将要开 展的对肝癌分子分型的诊断。我国在70年代肝癌普查基础上建立的“B超+AFP” 诊断方法仍是目前肝癌早期诊断的主要依据，并随现代影像学的技术进步而发 展。甲胎蛋白(AFP)属美国70年代研发，80年代上市产品，已失去专利保护， 同时其临床缺陷，比如灵敏度和准确性低已被广泛认识。
小扁豆素结合型甲胎蛋白异质体(AFP-L3)是肝癌细胞所特有的一种物质， 相比较影像技术，甲胎蛋白异质体AFP-L3可以提前9-12个月被检测出，AFP-L3 占总AFP超过10％，提示肝癌的发生率大于95％，这大大提高了肝癌的检查率， 对于肝癌的早发现早治疗有着重要的意义。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在调控细胞生长和分化方面起重要作用， 与肝癌的发生、发展密切相关。GPC3在肝癌组织中特异性高表达，从而提示GPC3对肝癌诊断具有明显的灵敏性和特异性,可作为肝癌治疗的新靶点。
中期因子(MDK)是一种新发现的肝素结合生长因子，可促进多种细胞的 生长、存活和迁移，其在多方面显示出与肿瘤发生有关的活性，包括促有丝分 裂、促血管生成、诱导细胞恶性转化等。与周围非癌组织相比MDK在肝癌组织 中出现过表达，并且在肿瘤早期、潜伏期和癌前病变阶段也呈高水平表达。
鳞状细胞癌抗原(SCCA)是从宫颈鳞状上皮细胞癌组织提取的肿瘤相关抗 原TA-4，正常人血清含量极微＜2.5μg/L。SCCA是鳞癌的肿瘤标志物，适用于 宫颈癌、肺鳞癌、食管癌、头颈部癌，膀胱癌的辅助诊断，治疗观察和复发监 测。
异常凝血酶原(DCP)是产生于肿瘤细胞的不正常的凝血酶原，与正常凝 血酶原相比，DCP的分子结构特点是其Gla domain结构域中的一个或多个Glu 残基(Glu residu)s没有被完全羧化(γ-carboxylated)成为Gla，从而失去凝血 功能。大约50至60％的肝癌患者DCP水平升高。由于肝病本身可以引起AFP 水平的增高，但不能导致DCP水平的增高，所以DCP诊断HCC比AFP更特 异。
Luminex荧光微球为用不同配比的两种红色分类荧光染料将直径为5.6微米 的聚苯乙烯微球染成不同的荧光色，从而获得多达100种荧光编码的微球。把 针对不同待测物的抗体分子或者基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码 微球上，每个编码微球都对应相应的检测项目。先把针对不同待测物的荧光编 码微球混合，然后加入待测物质或者待测的扩增片段，所形成的复合物再与标 记荧光素发生结合反应。微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光，红 激光用来判定微球的荧光编码，绿激光用来测定微球上报告分子的荧光强度。 从而达到快速准确的定量检测目的。
传统的用于肝癌早期检测的血清甲胎蛋白(AFP)方法已经越来越不能适应 患者的需要，因为血清甲胎蛋白(AFP)方法只能检测出约50％的病人，且只有 大约45％的准确率。对于肝癌，AFP敏感度仅为40％左右。此外，在15％～58％ 的慢性肝炎及11％～47％的肝硬化病例中，其血清AFP水平在20～200μg/L，这 表明AFP在肝癌诊断中存在一定的漏诊率和误诊率。
发明内容
本发明目的是为了解决上述问题，本发明提供灵敏度高，特异性强，方法 简单的通过AFP、AFP-L3、GPC3、MDK、SCCA和DCP六种抗体联合检测早 期肝癌标志物的多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒及其使用方法。
本发明提供的多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒，具体技术方案如 下：
多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒，包括清洗缓冲液、Luminex荧光 微球和藻红蛋白标记的二抗，所述清洗缓冲液为0.01mol/L PBS中加入 0.05％Tween-20，pH调节为7.4，
所述藻红蛋白标记的二抗为藻红蛋白标记的羊抗小鼠免疫球蛋白G，且浓 度为0.1-0.12mg/ml，
所述Luminex荧光微球包括包被AFP捕获抗体的微球、包被AFP-L3捕获 抗体的微球、包被GPC3捕获抗体的微球、包被MDK捕获抗体的微球、包被 SCCA捕获抗体的微球和包被DCP捕获抗体的微球，所述Luminex荧光微球中 包被不同捕获抗体的微球具有不同的颜色编码。
在某些实施方式中，所述Luminex荧光微球为SeroMap微球。
本发明还提供多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒的使用方法，包括 如下步骤：
(1)用所述清洗缓冲液湿润滤过板，通过真空抽滤去除所述滤过板的液体；
(2)制备缓冲液，用所述缓冲液将待检测的血清样本稀释5-10倍；
(3)将步骤(2)中的血清样本分别加入步骤(1)中的滤过板；
(4)用所述清洗缓冲液稀释所述Luminex荧光微球为(0.5-1.5)*105个/ ml，将稀释后的Luminex荧光微球加入步骤(3)中的滤过板；
(5)将步骤(4)中的滤过板置于室温避光环境下振荡孵育，振荡时间为 30-90分钟，用真空抽滤去除所述滤过板的孔内液体；
(6)向步骤(5)中的滤过板的每个孔中加入用所述清洗缓冲液稀释200-800 倍的所述藻红蛋白标记的二抗，在室温避光环境下振荡孵育，振荡时间为20-60 分钟，加入清洗缓冲液，在室温避光条件下振荡4-10分钟；
(7)将步骤(5)、步骤(6)中的滤过板放入Luminex200读取各孔荧光值；
(8)根据荧光强度获得所述待测血清样本中AFP、AFP-L3、GPC3、MDK、 SCCA和DCP的理论浓度值，依据所述理论浓度值获得早期肝癌的可能性；
在某些实施方式中，所述步骤(1)至步骤(7)中使用的所述滤过板为96 孔滤过板。
在某些实施方式中，所述步骤(2)中制备缓冲液的步骤包括以下步骤：
在所述清洗缓冲液中加入10％羊血清。
在某些实施方式中，所述振荡的转速为600-800r/分钟。
本发明具有以下有益效果：本发明提供的多抗体联合检测早期肝癌标志物 的试剂盒，通过检测血清中AFP、AFP-L3、GPC3、MDK、SCCA和DCP的含 量来联合诊断肝癌的试剂盒，可以通过定量检测血清AFP、AFP-L3、GPC3、 MDK、SCCA和DCP的含量，能够用于肝癌的早期诊断，利用Luminex荧光微 球使试剂盒具有高通量、检测速度快、灵敏度高的特点。
附图说明
图1是本发明实施例3中提供的多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒 利用Luminex荧光微球和AFP联合检测系统示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例， 对本发明进一步详细说明。
本发明提供的多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒，具体技术方案如 下：
多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒，包括清洗缓冲液、Luminex荧光 微球和藻红蛋白标记的二抗，清洗缓冲液为0.01mol/L PBS中加入 0.05％Tween-20，pH调节为7.4，藻红蛋白标记的二抗为藻红蛋白标记的羊抗小 鼠免疫球蛋白G，且浓度为0.1-0.12mg/ml，Luminex荧光微球为包被AFP捕获 抗体的微球、包被AFP-L3捕获抗体的微球、包被GPC3捕获抗体的微球、包被 MDK捕获抗体的微球、包被SCCA捕获抗体的微球和包被DCP捕获抗体的微 球，Luminex荧光微球中包被不同捕获抗体的微球具有不同的颜色编码。
在某些实施方式中，所述Luminex荧光微球为SeroMap微球。检测血清中 的特异性抗体时，检测的背景信号过高，给实验造成了干扰。其产生的原因是 血清中含有的某些抗体可以直接非特异性的结合在微球表面，而这种非特意性 的结合与微球呈现的抗原性无关，因此不能被系统所识别。选用SeroMap微球 有效消除非特异性的结合。
实施例1
多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒的使用方法如下：
(1)用清洗缓冲液(0.01mol/L PBS中加入0.05％Tween-20，调节pH为7.4) 预湿96孔滤过板，真空抽滤去除液体；
(2)将待检测的血清样本用缓冲液(含10％羊血清的清洗缓冲液)稀释5 倍；
(3)将已稀释5倍的待检测的血清样本分别加人96孔滤过板，每孔50μl；
(4)将Luminex荧光微球用清洗缓冲液稀释为0.5*105个/ml，每孔加入 50μl；
(5)室温避光振荡孵育(振荡转速为800r/分钟，振荡时间为30分钟)，后 真空抽滤去除96孔滤过板孔内液体；
(6)向步骤(5)中的96孔滤过板的每孔加入经过清洗缓冲液稀释200倍 的藻红蛋白标记的二抗100μl；在室温避光振荡孵育20分钟(振荡转速为800r/ 分钟)；最后将96孔滤过板每孔加入120μl清洗缓冲液，室温避光振荡4min (振荡转速为800r/分钟)；
(7)将步骤(6)中的96孔滤过板放入Luminex200读取各孔荧光值。
(8)根据荧光强度来获得所述待测血清样本中AFP、AFP-L3、GPC3、MDK、 SCCA和DCP的理论浓度值，依据所述理论浓度值获得早期肝癌的可能性。
实施例2
多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒的使用方法如下：
(1)用所述清洗缓冲液湿润96孔滤过板，通过真空抽滤去除滤过板的液 体；
(2)清洗缓冲液中加入10％羊血清，制备获得缓冲液，用缓冲液将待检测 的血清样本稀释8倍；
(3)将步骤(2)中的血清样本分别加入步骤(1)中的96孔滤过板；
(4)所述Luminex荧光微球用所述清洗缓冲液稀释为1.5*105个/ml，加 入步骤(3)中的96孔滤过板；
(5)将步骤(4)中的96孔滤过板置于室温避光环境下振荡孵育，振荡转 速为600r/分钟，振荡时间为30分钟，用真空抽滤去除96孔滤过板的孔内液体；
(6)向步骤(5)中的96孔滤过板的每个孔中加入用所述清洗缓冲液稀释 800倍的所述藻红蛋白标记的二抗，在室温避光环境下振荡孵育，振荡时间为 60分钟(振荡转速为600r/分钟)，加入清洗缓冲液，在室温避光条件下振荡10 分钟；
(7)将步骤(6)中的96孔滤过板放入Luminex200读取各孔荧光值；
(8)根据荧光强度来获得所述待测血清样本中AFP、AFP-L3、GPC3、MDK、 SCCA和DCP的理论浓度值，依据所述理论浓度值获得早期肝癌的可能性。
实施例3
本发明的多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒在96孔滤过板上利用分 别包被六个捕捉抗体Luminex荧光微球-AFP(抗原1)捕获抗体、AFP-L3(抗 原2)捕获抗体、GPC3(抗原3)捕获抗体、MDK(抗原4)捕获抗体、SCCA (抗原5)捕获抗体和DCP(抗原6)捕获抗体和AFP联合检测血清AFP、AFP-L3、 GPC3、MDK、SCCA和DCP等分子的含量，AFP、AFP-L3、GPC3、MDK、 SCCA和DCP都是抗原，捕获抗体可与对应的抗原特异性结合。如图1所示， 其中一个孔包含的与捕捉抗体共价结合的不同颜色的检测小球，96孔滤过板上 区域1检测对象为AFP标准为普通试剂，区域2为检测对象为健康人的对照血 清样本和区域3检测对象为病人血清。
多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒的使用方法如下：
(1)用清洗缓冲液(0.01mol/L PBS中加入0.05％Tween-20，调节pH为7.4) 预先湿润96孔滤过板，真空抽滤去除液体；
(2)将待检测的血清样本用缓冲液(含10％羊血清的清洗缓冲液)稀释 10倍；
(3)将已稀释10倍的待检测的血清样本分别加人96孔滤过板，每孔50μl；
(4)将Luminex荧光微球用清洗缓冲液稀释为105个/ml，每孔加入50μl；
(5)室温避光振荡孵育(振荡转速为700r/分钟，振荡时间为60分钟)，后 真空抽滤去除96孔滤过板孔内液体；
(6)想步骤(5)中的96孔滤过板的每孔加入经过清洗缓冲液稀释500倍 的藻红蛋白标记的二抗100μl；在室温避光振荡孵育30分钟(振荡转速为700r/ 分钟)；最后将96孔滤过板每孔加入120μl清洗缓冲液，室温避光振荡5min(振 荡转速为700r/分钟)；
(7)将步骤(6)中的96孔滤过板放入Luminex200读取各孔荧光值。
(8)根据荧光强度来获得所述待测血清样本中AFP、AFP-L3、GPC3、MDK、 SCCA和DCP的理论浓度值，依据所述理论浓度值获得早期肝癌的可能性。
综上所述，相对于传统的AFP单项检测，本发明提供的多抗体联合检测早 期肝癌标志物的试剂盒是在AFP基础上叠加了多种肝癌抗原及相关抗原，通过 Luminex荧光微球的利用，使检测既快速又准确，只需1毫升血清，即能够检测 出约85％的血清中肝癌标志物，具有大约90％的准确率，从而多元化反映肝癌 病变，大大提高了对肝癌标志物检测的可靠性。
上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限 于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、 改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒，其特征在于，包括清洗缓冲液、Luminex荧光微球和藻红蛋白标记的二抗，
所述清洗缓冲液为0.01mol/L PBS中加入0.05％Tween-20，pH调节为7.4，
所述藻红蛋白标记的二抗为藻红蛋白标记的羊抗小鼠免疫球蛋白G，且浓度为0.1-0.12mg/ml，
所述Luminex荧光微球包括包被AFP捕获抗体的微球、包被AFP-L3捕获抗体的微球、包被GPC3捕获抗体的微球、包被MDK捕获抗体的微球、包被SCCA捕获抗体的微球和包被DCP捕获抗体的微球，所述Luminex荧光微球中包被不同捕获抗体的微球具有不同的颜色编码。
2.根据权利要求1所述的多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒，其特征在于，所述Luminex荧光微球为SeroMap微球。
3.多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用所述清洗缓冲液湿润滤过板，通过真空抽滤去除所述滤过板的液体；
(2)制备缓冲液，用所述缓冲液将待检测的血清样本稀释5-10倍；
(3)将步骤(2)中的血清样本分别加入步骤(1)中的滤过板；
(4)用所述清洗缓冲液稀释所述Luminex荧光微球为(0.5-1.5)*105个/ml，将稀释后的Luminex荧光微球加入步骤(3)中的滤过板；
(5)将步骤(4)中的滤过板置于室温避光环境下振荡孵育，振荡时间为30-90分钟，用真空抽滤去除所述滤过板的孔内液体；
(6)向步骤(5)中的滤过板的每个孔中加入用所述清洗缓冲液稀释200-800倍的所述藻红蛋白标记的二抗，在室温避光环境下振荡孵育，振荡时间为20-60分钟，加入清洗缓冲液，在室温避光条件下振荡4-10分钟；
(7)将步骤(6)中的滤过板放入Luminex200读取各孔荧光值；
(8)根据荧光强度获得所述待测血清样本中AFP、AFP-L3、GPC3、MDK、SCCA和DCP的理论浓度值。
4.根据权利要求3所述的多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(1)至步骤(7)中使用的所述滤过板为96孔滤过板。
5.权利要求3所述的多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)中制备缓冲液的步骤包括以下步骤：
在所述清洗缓冲液中加入10％羊血清。
6.权利要求3所述的多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(5)、步骤(6)中，振荡操作的转速为600-800r/分钟。
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