CN202837303U - Ngal荧光免疫层析定量检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及一种NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条，在底衬上依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的抗NGAL抗体A，所述的硝酸纤维素膜上包被有抗NGAL抗体B作为检测线和兔抗鼠IgG抗体作为质控线。本实用新型的试纸条能够准确定量检测人血浆中NGAL含量，具有操作简便、准确度高、灵敏度高特点。
Description
技术领域
本实用新型属于医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL）是1993年在中性粒细胞内首次被发现的，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生于发展等过程相关。近年来国内外研究表明，NGAL蛋白在多种疾病发生过程中具有特异性表达变化的特点，使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。
近年美国临床化学协会（AACC）年度会议的研究结果发表得知检测尿中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白可能有助于临床医生检测心脏移植患者环孢霉素诱导的毒性，以及调节环孢霉素剂量以预防其对肾脏造成的不可逆伤害。中国专利CN101163971研究在急性肾衰竭（ARF）、急性肾小管坏死（ATN）和急性肾小管间质性肾病（ATIN）发病的早期，尿液和血液中NGAL水平显著增加，因此NGAL是早期检测肾脏对缺血性损伤的标志物。
目前，检测NGAL方法主要有酶联免疫法（中国专利CN101650369）、基于抗体免疫的微型柱测试法（中国专利CN101163971）和胶乳免疫比浊法（中国专利CN102072960A）。酶联免疫法操作容易受到酶活性变化的影响，结果不太准确；胶乳比浊法反应特异性不好，所需试剂比较复杂。
基于荧光标记技术的免疫层析能够准确定量检测样品中NGAL的含量，同时灵敏度高。
发明内容
本实用新型的目的是提供一种操作简便、准确度高、灵敏度高和能进行定量检测NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条。
本实用新型的技术方案为：一种NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条，在底衬上依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的抗NGAL抗体A，所述的硝酸纤维素膜上包被有抗NGAL抗体B作为检测线和兔抗鼠IgG抗体作为质控线。
所述胶乳微球粒径范围为50nm-500nm。
所述的荧光胶乳微球是由胶乳微球吸附荧光标记的链霉亲和素制备得到。
所述荧光胶乳微球的荧光为直接荧光物质，优选异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。
所述结合垫材质为玻璃纤维素膜或聚酯膜。
一种NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条的制备方法包括如下步骤：
1）. 包被荧光胶乳微球标记NGAL抗体A结合垫的制备
a. 将荧光标记的链霉亲和素和胶乳微球吸附结合，制备得到荧光胶乳微球；
b. 将生物素与抗NGAL抗体A结合，制备得到生物素化抗NGAL抗体A；
c. 将步骤a所得荧光胶乳微球和步骤b所得生物素化抗NGAL抗体A混合，即得荧光胶乳微球标记抗NGAL抗体A。
d. 将步骤c所得荧光胶乳微球标记抗NGAL抗体A喷涂在结合垫上。
2). 硝酸纤维素膜的制备
用包被缓冲液分别稀释抗NGAL抗体B和兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的两种抗体分别平行地喷于硝酸纤维素膜上，两种抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成抗NGAL抗体B检测线和兔抗鼠IgG抗体包被的质控线。
3）. 在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。
本实用新型与现有技术相比，具有如下优点：
1）本实用新型制作方便，体积小、便于携带；
2）本实用新型通过对试纸条上荧光信号的强弱分析，并结合荧光免疫分析仪的处理分析，可以实现样品中NGAL的准确定量；
3）本实用新型可批量生产，适用于临床快速诊断和现场快速检测，易于保存和在基层医院的推广使用。
附图说明
图1为本实用新型NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条结构示意图；
其中，图1：1、底衬；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水纸；6、检测线；7、质控线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本实用新型作进一步详细的说明。
NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条，在底衬上依次搭接地样品垫2、结合垫3、硝 酸纤维素膜4和吸水纸5，所述结合垫3上喷涂有荧光胶乳微球标记的抗NGAL单克隆抗体M1，所述硝酸纤维素膜4上有包被抗NGAL单克隆抗体M2作为检测线6和兔抗鼠IgG抗体作为质控线7。以上抗体均购自罗氏公司。
上述硝酸纤维素膜上检测6线还可以是包被抗NGAL的多克隆抗体，所述多克隆抗体是采用本领域熟练技术人员熟知的常规方法免疫鼠获得抗血清制备而得。
进一步所述的胶乳微球粒径范围为50nm-500nm。
所述荧光胶乳微球的荧光为自发荧光物质，优选异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。
实施例1
NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条制备方法如下：
1）荧光胶乳微球的制备
荧光胶乳微球的制备：用吸附缓冲液（50mM、pH5.8的柠檬酸盐缓冲液）稀释粒径为100nm胶乳微球至终浓度20mg/ml，体积为5ml，制得胶乳微球悬浮液;添加适量的荧光素Cy5标记链霉亲和素（购自上海研晶生物科技有限公司）在吸附缓冲液里，终体积为5ml；将上述胶乳微球悬浮液加入到上述含有荧光素标记链霉亲和素的吸附缓冲液中，制得混合液；将所得混合液在室温下温浴1-2小时，并不断搅拌，然后离心，收集沉淀，沉淀用储存缓冲液（含有0.05%BSA的吸附缓冲液）溶解，放置4℃保存，备用。
2）生物素化抗NGAL抗体A的制备
将抗NGAL单克隆抗体M1用0.1mol/L、pH8.0碳酸氢钠缓冲液稀释至1mg/ml，交互用0.1mol/L、pH8.0碳酸氢钠缓冲液对NGAL抗体M1充分透析；用1ml DMSO溶解1mg的NHSB，得到NHSB溶液；向上述1mlNGAL单克隆抗体M1溶液加入20μl NHSB溶液，室温搅拌2-4小时，继续室温搅拌10分钟，然后用20mM、pH7.2 PBS缓冲液透析，即得生物素化抗NGAL单克隆抗体M1。
3）荧光胶乳微球标记NGAL抗体A的制备
将步骤1)制得的荧光胶乳微球和步骤2）制得的生物素化NGAL抗体M1混合在一起，反应30分钟后离心，沉淀用储存缓冲液溶解，恢复至原体积。
4) 包被荧光胶乳微球标记NGAL抗体A结合垫3的制备
将步骤3）制得的荧光胶乳微球标记抗NGAL抗体M1，按3.0μl/cm3的用量喷在玻璃纤维素膜材质的结合垫3上。
5） 硝酸纤维素膜4的制备
a）包被缓冲液的制备：将0.025M、pH7.4的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期7天。
b）封闭液的制备：将含1%BSA，1%蔗糖，0.025M、pH7.5的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期3天。
c）NGAL抗体检测线6的制备：将抗NGAL单克隆抗体M2按2mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min,划线速度50m/20min，在干燥箱内20℃鼓风干燥12小时。
d）质控线7的制备：将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜4上划线，该线与检测线6平行，放入干燥箱内20℃鼓风干燥12小时。
e）用上述封闭液将含有检测线6和质控线7的硝酸纤维素膜4于37℃封闭60分钟，取出后置37℃下烘干处理两个小时，封袋备用。
6）试纸条组装
在底衬1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2，结合垫3，硝酸纤维素膜4和吸水纸5得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。
7）待测抗原检测
将被检测血清、全血或尿液滴加100-120μl于样品垫1上，进行免疫反应，时间5-8min；反应结束后，将试纸条放于专门的荧光信号读取仪器中，读取荧光信号的大小，进行定量测定。
实施例2
另一种NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条制备方法如下：
1）荧光胶乳微球的制备
荧光胶乳微球的制备：用吸附缓冲液（50mM、pH5.8的柠檬酸盐缓冲液）稀释粒径为400nm胶乳微球至终浓度30mg/ml,体积为6ml，制得胶乳微球悬浮液;添加适量的红色荧光素罗丹明标记链霉亲和素(购自上海酶联生物科技有限公司)在吸附缓冲液里，终体积为6ml；将上述胶乳微球悬浮液加入到上述含有红色荧光素罗丹明标记链霉亲和素的吸附缓冲液中，制得混合液；将所得混合液在室温下温浴1-2小时，并不断搅拌，然后离心，收集沉淀，沉淀用储存缓冲液（含有0.06%BSA的吸附缓冲液）溶解，放置4℃保存，备用。
2）生物素化抗NGAL抗体A的制备
将抗NGAL单克隆抗体M1用0.1mol/L、pH8.0碳酸氢钠缓冲液稀释至1mg/ml,交互用0.1mol/L、pH8.0碳酸氢钠缓冲液对NGAL抗体M1充分透析；用1ml DMSO溶解1mg的 NHSB，得到NHSB溶液；向上述1mlNGAL单克隆抗体M1溶液加入25μl NHSB溶液，室温搅拌2-4小时，继续室温搅拌10分钟，然后用20mM、pH7.2 PBS缓冲液透析，即得生物素化抗NGAL单克隆抗体M1。
3）荧光胶乳微球标记NGAL抗体的制备
将步骤1)制得的荧光胶乳微球和步骤2）制得的生物素化NGAL抗体M1混合在一起，反应30分钟后离心，沉淀用储存缓冲液溶解，恢复至原体积。
4) 涂覆荧光胶乳微球标记NGAL抗体A结合垫3的制备
将步骤3）制得的荧光胶乳微球标记抗NGAL抗体M1，按2μl/cm3的用量喷在聚酯膜材质的结合垫3上。
5）硝酸纤维素膜4的制备
a）包被缓冲液的制备：将0.025M、pH7.4的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期7天。
b）封闭液的制备：将含1%BSA，1%蔗糖，0.025M、pH7.5的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期3天。
c）NGAL抗体检测线6的制备：将抗NGAL多克隆抗体按3mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在干燥箱内20℃鼓风干燥12小时。
d）质控线7的制备：将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜4上划线，该线与检测线6平行，放入干燥箱内20℃鼓风干燥12小时。
e）用上述封闭液将含有检测线6和质控线7的硝酸纤维素膜4于37℃封闭60分钟，取出后置37℃下烘干处理两个小时，封袋备用。
6）试纸条组装
在底衬1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2，结合垫3，硝酸纤维素膜4和吸水纸5得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。
7）待测抗原检测
将被检测血清、全血或尿液滴加100-120μl于样品垫1上，进行免疫反应，时间5-8min；反应结束后，将试纸条放于专门的荧光信号读取仪器中，读取荧光信号的大小，进行定量测定。
Claims (5)
1.一种NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条，在底衬（1）上依次搭接地粘贴样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）和吸水纸（5），其特征在于所述的结合垫（3）上包被有荧光胶乳微球标记的抗NGAL抗体A，所述的硝酸纤维素膜（4）上包被有抗NGAL抗体B作为检测线（6）和兔抗鼠IgG抗体作为质控线（7）。
2.根据权利要求1所述的NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于所述胶乳微球粒径范围为50nm-500nm。
3.根据权利要求1所述的NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于所述的荧光胶乳微球的荧光为直接荧光物质。
4.根据权利要求3所述的NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于所述直接荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。
5.根据权利要求1所述的NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于所述结合垫（3）材质为玻璃纤维素膜或聚酯膜。
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|---|---|---|---|---|
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|
| CX01 | Expiry of patent term | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20130327 |