CN103645321A - 一种筛查降钙素原的试纸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛查降钙素原的试纸，其特征在于：试纸包括加样区、标记复合物结合区、检测区、质控区及手持区；标记复合物结合区标记有抗人降钙素原单克隆抗体B，检测区标记有抗人降钙素原单克隆抗体A，抗人降钙素原单克隆抗体A和抗人降钙素原单克隆抗体B为配对抗体。本发明为临床快速筛查人血液中的降钙素原提供一种层析试纸，使用中无须配套检测仪器设备；检测样本为全血，不需要离心等预处理，检测时间仅5分钟，达到床边即时检测（POCT）的目标，且单次检测费用不足10元即可，试纸条使用简便可实现家庭自测，大大降低诊疗费用，节约医疗资源。

Description

一种筛查降钙素原的试纸及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种能够适用于对人血液中的降钙素原应用双抗体夹心法和免疫层析法的原理进行快速检测筛查的试纸及其制备方法。
背景技术
降钙素原（PCT）是一种用于细菌感染早期诊断、鉴别诊断及治疗监控的具有创新意义的诊断指标，优于其它现用于诊断细菌感染的指标(CRP和细胞因子等)。临床观察发现严重全身性细菌、真菌和寄生虫感染时,PCT异位生成，血浆水平异常增高，且增高程度与感染严重度及预后相关。
PCT是无激素活性的降钙素前肽物质，由116个氨基酸组成，分子量为13KD的糖蛋白。PCT的半衰期为25-30小时，在体外稳定性很好。健康人血浆PCT含量极低，在正常人血中低于0.5ng/ml。临床广泛应用于ICU、儿科、内科、外科手术、肿瘤科、移植等。目前多采用化学发光、上转发光及胶体金半定量或定量检测，试剂必须配套检测仪器设备方可使用，检测样本为血清，需要离心处理，检测时间至少半小时，难以达到床边即时检测（POCT）的目标，不能实现家庭自测，且单次检测费用均在百元以上。
发明内容
本发明为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种快速筛查降钙素原的试纸及其制备方法，以期可以降低检测成本及检测难度。
本发明解决技术问题采用如下技术方案
本发明筛查降钙素原的试纸，其特点在于：所述试纸包括加样区、标记复合物结合区、检测区、质控区及手持区；所述标记复合物结合区标记有抗人降钙素原单克隆抗体B，所述检测区标记有抗人降钙素原单克隆抗体A，所述抗人降钙素原单克隆抗体A和抗人降钙素原单克隆抗体B为配对抗体。
本发明筛查降钙素原的试纸，其特点也在于：所述质控区标记有羊抗鼠IgG。
所述加样区是在样品垫的上方粘贴有微孔滤膜。
本发明筛查降钙素原的试纸的制备方法，其特点在于：
按如下步骤进行：
a、配制处理液
a1、配制金标垫处理液：在浓度为10mM、pH=7.4的盐酸氨丁三醇缓冲液中加入聚维酮和吐温-20，获得金标垫处理液；在所述金标垫处理液中，聚维酮的质量浓度为0.5%，吐温-20的质量浓度为0.5%；
a2、配制加样区处理液：在浓度为10mM、pH=7.4的盐酸氨丁三醇缓冲液中加入聚维酮和酪蛋白，获得加样区处理液；在所述加样区处理液中，聚维酮的质量浓度为1%，酪蛋白是质量浓度为0.8%；
a3、配制点膜抗体稀释液：由浓度为10mM、pH=7.4的PB缓冲液和NaCl混合获得点膜抗体稀释液；在所述点膜抗体稀释液中，NaCl的质量浓度为0.85%；
a4、配制标记抗体稀释液：以浓度为10mM、pH=7.4的PB缓冲液作为标记抗体稀释液；
a5、配制胶体金-蛋白复合物稀释液：由浓度为10mM、pH=7.4的PB缓冲液、蔗糖及牛血清白蛋白混合获得胶体金-蛋白复合物稀释液；在所述胶体金-蛋白复合物稀释液中，PB缓冲液、蔗糖及牛血清白蛋白的质量浓度分别为：79%、20%及1%；
b、制备试纸条
b1、处理膜材
b11处理样品区：将样品垫用步骤a2配制的加样区处理液浸泡30min，然后置于烘房中，38℃条件下烘至湿度降到30%以下，得待用样品垫；
b12处理金标垫：将聚酯膜用步骤a1配制的金标垫处理液浸泡30min，然后置于烘房中，38℃件下烘至湿度降到30%以下，得待用金标垫；
b2、点膜
b21、配制抗体溶液：用步骤a3配制的点膜抗体稀释液将羊抗鼠IgG稀释成浓度为0.5mg/ml的抗体溶液；用步骤a3配制的点膜抗体稀释液将抗人降钙素原单克隆抗体A稀释成1.0mg/ml的抗体溶液A；
b22贴膜：以PVC胶板作为底衬，将硝酸纤维膜贴于PVC胶板上，使硝酸纤维膜覆盖质控区和检测区；
b23点膜：开启点膜喷金仪，以1μl/cm的速度将步骤b21配制的抗体溶液点在质控区，将步骤b21配制的抗体溶液A点在检测区；将点膜后的PVC胶板置于烘房中，在38℃条件下烘至湿度降到30%以下，得待用PVC胶板；
b3、制备胶体金-蛋白复合物
b31制备胶体金
用柠檬酸三钠将氯金酸还原成由直径为20nm～40nm的胶体金颗粒构成的胶体金；
b32制备胶体金-蛋白复合物
在1ml胶体金中加入15μl质量浓度为0.1M的K2CO3混合均匀，再加入15μg抗人降钙素原单克隆抗体B和20mlPEG20000，搅拌，离心并收集沉淀，将所述沉淀用步骤a5所制备的胶体金-蛋白复合物稀释液复溶，得胶体金-蛋白复合物；
b4、开启喷金仪，以3μl/cm的浓度将胶体金-蛋白复合物喷在待用金标垫上，置于烘房38℃烘至湿度降到30%以下，得预处理金标垫；
b5、将吸水纸贴于待用PVC胶板的手持区；将待用样品垫贴于加样区，并在待用样品垫上贴微孔滤膜；将预处理金标垫贴于待用PVC胶板的标记复合物结合区，即得筛查降钙素原的试纸。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
1、本发明为临床快速筛查人血液中的降钙素原提供一种层析试纸，使用中无须配套检测仪器设备；检测样本为全血，不需要离心等预处理，检测时间仅5分钟，达到床边即时检测（POCT）的目标，且单次检测费用不足10元即可，试纸条使用简便可实现家庭自测，大大降低诊疗费用，节约医疗资源；
2、本发明试纸的制备中，在金标垫处理液中加入聚维酮和吐温-20可增加金标垫的稳定性；在加样区处理液中加入聚维酮和酪蛋白，可以样本加入后快速层析；以PBS缓冲液作为点膜抗体稀释液可以确保抗体活性；以PB缓冲液作为标记抗体稀释液不影响抗体与检测样本中抗原结合，提高试纸的灵敏度；以PB缓冲液、20%蔗糖及1%牛血清白蛋白的混合液作为胶体金复合物稀释液，可有效增强复合物稳定性，确保抗体不脱落。
附图说明
图1为本发明筛查降钙素原的试纸的结构示意图。
具体实施方式
如图1所示，本实施例筛查降钙素原的试纸包括加样区、标记复合物结合区、检测区(T)、质控区（C）及手持区；标记复合物结合区标记有抗人降钙素原单克隆抗体B，检测区标记有抗人降钙素原单克隆抗体A，抗人降钙素原单克隆抗体A和抗人降钙素原单克隆抗体B为配对抗体。质控区标记有羊抗鼠IgG。加样区是在样品垫的上方粘贴有微孔滤膜。
本实施例筛查降钙素原的试纸的制备方法，其特征在于：
按如下步骤进行：
a、配制处理液
a1、配制金标垫处理液：在浓度为10mM、pH=7.4的盐酸氨丁三醇缓冲液中加入聚维酮和吐温-20，获得金标垫处理液；在金标垫处理液中，聚维酮的质量浓度为0.5%，吐温-20的质量浓度为0.5%；
a2、配制加样区处理液：在浓度为10mM、pH=7.4的盐酸氨丁三醇缓冲液中加入聚维酮和酪蛋白，获得加样区处理液；在加样区处理液中，聚维酮的质量浓度为1%，酪蛋白是质量浓度为0.8%；
a3、配制点膜抗体稀释液：由浓度为10mM、pH=7.4的PB缓冲液和NaCl混合获得点膜抗体稀释液；在点膜抗体稀释液中，NaCl的质量浓度为0.85%；
a4、配制标记抗体稀释液：以浓度为10mM、pH=7.4的PB缓冲液作为标记抗体稀释液；
a5、配制胶体金-蛋白复合物稀释液：由浓度为10mM、pH=7.4的PB缓冲液、蔗糖及牛血清白蛋白混合获得胶体金-蛋白复合物稀释液；在胶体金-蛋白复合物稀释液中，PB缓冲液、蔗糖及牛血清白蛋白的质量浓度分别为：79%、20%及1%；
b、制备试纸条
b1、处理膜材
b11处理样品区：将样品垫用步骤a2配制的加样区处理液浸泡30min，然后置于烘房中，38℃条件下烘至湿度降到30%以下，得待用样品垫；
b12处理金标垫：将聚酯膜用步骤a1配制的金标垫处理液浸泡30min，然后置于烘房中，38℃件下烘至湿度降到30%以下，得待用金标垫；
b2、点膜
b21、配制抗体溶液：用步骤a3配制的点膜抗体稀释液将羊抗鼠IgG稀释成浓度为0.5mg/ml的抗体溶液；用步骤a3配制的点膜抗体稀释液将抗人降钙素原单克隆抗体A稀释成1.0mg/ml的抗体溶液A；
b22贴膜：以PVC胶板作为底衬，将硝酸纤维膜贴于PVC胶板上，使硝酸纤维膜覆盖质控区和检测区；
b23点膜：开启点膜喷金仪，以1μl/cm的速度将步骤b21配制的抗体溶液点在质控区，将步骤b21配制的抗体溶液A点在检测区；将点膜后的PVC胶板置于烘房中，在38℃条件下烘至湿度降到30%以下，得待用PVC胶板；
b3、制备胶体金-蛋白复合物
b31制备胶体金
用柠檬酸三钠将氯金酸还原成由直径为20nm～40nm的胶体金颗粒构成的胶体金；
b32制备胶体金-蛋白复合物
在1ml胶体金中加入15μl质量浓度为0.1M的K2CO3混合均匀，再加入15μg抗人降钙素原单克隆抗体B和20mlPEG20000，搅拌，离心并收集沉淀，将所述沉淀用步骤a5所制备的胶体金-蛋白复合物稀释液复溶，得胶体金-蛋白复合物；
b4、开启喷金仪，以3μl/cm的浓度将胶体金-蛋白复合物喷在待用金标垫上，置于烘房38℃烘至湿度降到30%以下，得预处理金标垫；
b5、将吸水纸贴于待用PVC胶板的手持区；将待用样品垫贴于加样区，并在待用样品垫上贴微孔滤膜；将预处理金标垫贴于待用PVC胶板的标记复合物结合区，即得筛查降钙素原的试纸。
受试方法：本发明试纸条
对照方法：罗氏化学发光法
实验方案：临床采集血液样本50人份，分别采用两种检测方法检测，读取结果。
实验结果：经本发明试纸条检测结果为阳性的31例样本，按罗氏化学发光法检测其含量均大于0.5ng/ml，显示样本异常，已患感染；检测结果为阴性的19例样本，按罗氏化学发光法检测其含量均小于0.5ng/ml，显示样本正常，未患感染。
结果判定：本发明试纸条与罗氏化学发光法检测结果基本一致，无显著性差异。

Claims (4)

1.一种筛查降钙素原的试纸，其特征在于：所述试纸包括加样区、标记复合物结合区、检测区、质控区及手持区；所述标记复合物结合区标记有抗人降钙素原单克隆抗体B，所述检测区标记有抗人降钙素原单克隆抗体A，所述抗人降钙素原单克隆抗体A和抗人降钙素原单克隆抗体B为配对抗体。
2.根据权利要求1所述的筛查降钙素原的试纸，其特征在于：所述质控区标记有羊抗鼠IgG。
3.根据权利要求1所述的筛查降钙素原的试纸，其特征在于：所述加样区是在样品垫的上方粘贴有微孔滤膜。
4.一种权利要求3所述的筛查降钙素原的试纸的制备方法，其特征在于：
按如下步骤进行：
a、配制处理液
a1、配制金标垫处理液：在浓度为10mM、pH=7.4的盐酸氨丁三醇缓冲液中加入聚维酮和吐温-20，获得金标垫处理液；在所述金标垫处理液中，聚维酮的质量浓度为0.5%，吐温-20的质量浓度为0.5%；
a2、配制加样区处理液：在浓度为10mM、pH=7.4的盐酸氨丁三醇缓冲液中加入聚维酮和酪蛋白，获得加样区处理液；在所述加样区处理液中，聚维酮的质量浓度为1%，酪蛋白是质量浓度为0.8%；
a3、配制点膜抗体稀释液：由浓度为10mM、pH=7.4的PB缓冲液和NaCl混合获得点膜抗体稀释液；在所述点膜抗体稀释液中，NaCl的质量浓度为0.85%；
a4、配制标记抗体稀释液：以浓度为10mM、pH=7.4的PB缓冲液作为标记抗体稀释液；
a5、配制胶体金-蛋白复合物稀释液：由浓度为10mM、pH=7.4的PB缓冲液、蔗糖及牛血清白蛋白混合获得胶体金-蛋白复合物稀释液；在所述胶体金-蛋白复合物稀释液中，PB缓冲液、蔗糖及牛血清白蛋白的质量浓度分别为：79%、20%及1%；
b、制备试纸条
b1、处理膜材
b11处理样品区：将样品垫用步骤a2配制的加样区处理液浸泡30min，然后置于烘房中，38℃条件下烘至湿度降到30%以下，得待用样品垫；
b12处理金标垫：将聚酯膜用步骤a1配制的金标垫处理液浸泡30min，然后置于烘房中，38℃件下烘至湿度降到30%以下，得待用金标垫；
b2、点膜
b21、配制抗体溶液：用步骤a3配制的点膜抗体稀释液将羊抗鼠IgG稀释成浓度为0.5mg/ml的抗体溶液；用步骤a3配制的点膜抗体稀释液将抗人降钙素原单克隆抗体A稀释成1.0mg/ml的抗体溶液A；
b22贴膜：以PVC胶板作为底衬，将硝酸纤维膜贴于PVC胶板上，使硝酸纤维膜覆盖质控区和检测区；
b23点膜：开启点膜喷金仪，以1μl/cm的速度将步骤b21配制的抗体溶液点在质控区，将步骤b21配制的抗体溶液A点在检测区；将点膜后的PVC胶板置于烘房中，在38℃条件下烘至湿度降到30%以下，得待用PVC胶板；
b3、制备胶体金-蛋白复合物
b31制备胶体金
用柠檬酸三钠将氯金酸还原成由直径为20nm～40nm的胶体金颗粒构成的胶体金；
b32制备胶体金-蛋白复合物
在1ml胶体金中加入15μl质量浓度为0.1M的K2CO3混合均匀，再加入15μg抗人降钙素原单克隆抗体B和20mlPEG20000，搅拌，离心并收集沉淀，将所述沉淀用步骤a5所制备的胶体金-蛋白复合物稀释液复溶，得胶体金-蛋白复合物；
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b5、将吸水纸贴于待用PVC胶板的手持区；将待用样品垫贴于加样区，并在待用样品垫上贴微孔滤膜；将预处理金标垫贴于待用PVC胶板的标记复合物结合区，即得筛查降钙素原的试纸。
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