CN204228717U - 降钙素原定量检测荧光免疫层析试剂卡 - Google Patents

降钙素原定量检测荧光免疫层析试剂卡 Download PDF

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Abstract

本实用新型提供了一种降钙素原定量检测荧光免疫层析试剂卡,其包括底座、卡盖以及被所述底座和卡盖彼此相互紧扣于内部的试剂条,所述试剂条包括底板以及在底板上依次搭接粘贴的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、包被膜和吸水纸,所述第一结合垫包被有由两种不同粒径荧光微球标记的抗降钙素原第一抗体,所述第二结合垫包被有由生物素标记的抗降钙素原第二抗体,且所述包被膜上包被有相间隔的检测带和质控带,其中所述检测带固定有亲和素,所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体。本实用新型所提供的定量检测降钙素原的荧光免疫层析试剂卡可实现快速个性化的定量检测,同时具有高灵敏度、低误差范围的优点。

Description

降钙素原定量检测荧光免疫层析试剂卡
技术领域
本实用新型涉及一种用于降钙素原定量检测荧光免疫层析试剂卡。
背景技术
降钙素原(Procalcitonin)是激素降钙素的前体糖蛋白,通常由甲状腺的C细胞产生。降钙素原含有116个氨基酸,分子量大小约为13kD,包含57个氨基酸的N端部分,中间32个氨基酸的降钙素和21个氨基酸的抗钙素。自1993年首次报道在脓毒症患者血中降钙素原水平明显升高以来,关于降钙素原与炎性疾病相关性的研究大量开展,目前,国际上已将降钙素原作为评价临床感染程度和严重疾病的一项监测指标,其敏感性和特异性均优于CRP等其他炎性指标。
一般认为,降钙素原的生物学效应主要在于:次级炎症因子的作用、趋化因子的作用、抗炎及保护作用等。炎症反应约3小时后,降钙素原在血浆中的水平升高,6-8小时达到最高值,但自身免疫、过敏和病毒感染时降钙素原不会升高,因此可以区分病毒性和病菌性感染,指导用药。细菌感染者血清降钙素原水平与感染严重程度正相关,降钙素原水平下降则提示病情复发。降钙素原体内半衰期为20-24小时,可用于临床监测细菌感染和败血症的病程和预后。
对于降钙素原的检测,目前临床常用的方法包括:胶乳增强免疫比浊法、酶联免疫法、化学发光法、胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法等。胶乳增强免疫比浊法虽实现高通量筛选,但由于降钙素原所需的检测灵敏度要求高,导致检测时低值样品CV值过大。酶联免疫法及化学发光法虽可以准确定量,但检测耗时过长,且不适合于单个样品的检测。胶体金免疫层析法操作简单,但只能实现半定量。
实用新型内容
技术问题
对于灵敏度要求极高的降钙素原的检测,现有技术中缺少一种能够实现快速、精确、方便且成本低廉的检测装置。因此,需要提供一种新型降钙素原定量检测荧光免疫层析试剂卡。
技术方案
一方面,本实用新型提供了一种降钙素原定量检测荧光免疫层析试剂卡,其特征在于,包括以下组成部分:
a)试剂条,其中所述试剂条包括:
a-1)样品垫,
a-2)包被有由两种不同粒径荧光微球标记的抗降钙素原第一抗体的第一结合垫,
a-3)包被有由生物素标记的抗降钙素原第二抗体的第二结合垫,
a-4)包被有相间隔的检测带和质控带的包被膜,其中所述检测带固定有亲和素,所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体,
a-5)吸水纸,
a-6)底板,其中所述样品垫、第一结合垫、第二结合垫、包被膜和吸水纸在底板上依次搭接粘贴,
b)卡盖,其中所述卡盖包括:
b-1)位于所述样品垫的上侧以暴露出所述样品垫的部分区域的加样孔,和
b-2)位于所述包被膜的上侧以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域的检测孔,和
c)底座,其中所述底座和卡盖彼此相互紧扣,并将所述试剂条扣合在内部。
在一个实施方式中,所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小分别为100nm和300nm。
在一个实施方式中,所述检测带和所述质控带之间的间隔在0.3cm至0.5cm之间。
在一个实施方式中,所述荧光微球上具有选自以下的荧光物质:Cy3荧光素、Cy5荧光素、异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明和四甲基异硫氰酸罗丹明。
在一个实施方式中,所述卡盖和所述底座由塑料制成。
在一个实施方式中,所述试剂条的宽度在0.2cm至0.5cm之间。
有益效果
本实用新型所提供的定量检测降钙素原的荧光免疫层析试剂卡可实现快速个性化的定量检测,同时具有高灵敏度、低误差范围的优点。
附图说明
图1本实用新型的荧光免疫层析试剂卡的结构示意图。
图2本实用新型的荧光免疫层析试剂卡中试剂条的俯视结构示意图。
图3本实用新型的荧光免疫层析试剂卡中试剂条的侧视结构示意图。
附图标记表示为:1-底座、2-卡盖、3-加样孔、4-检测孔、5-检测带、6-质控带、7-样品垫、8-第一结合垫、9-第二结合垫、10-包被膜、11-吸水纸、12-底板。
具体实施方式
下文中将参照附图来更详细地描述示例性实施方式。所述附图用于图示说明本实用新型,而非对其进行限制。
图1是本实用新型的荧光免疫层析试剂卡的结构示意图。
如图1所示,本实用新型的荧光免疫层析试剂卡包括底座1和卡盖2,卡盖2上设置有加样孔3和检测孔4。试剂条(未示出)被底座1和卡盖2彼此相互紧扣于试剂卡内部。加样孔3的大小可暴露出试剂条上样品垫的部分区域。检测孔4的大小可暴露出试剂条上包被膜中检测带和质控带的全部区域。
底座1和卡盖2均可由诸如塑料等材料制成。加样孔3和检测孔4可以为正方形、长方形、椭圆形、圆形等形状。加样孔的长度可为0.1cm至0.5cm,宽度可为0.2cm至0.4cm。检测孔4的长度可为1.0cm至2.3cm, 宽度可为0.2cm至0.4cm。
本实用新型的降钙素原荧光免疫层析试剂卡可实现快速大批量的检测,有很重要的临床意义。
图2为本实用新型的荧光免疫层析试剂卡中试剂条的俯视结构示意图。
如图2所示,布置在底座1上的试剂条包括样品垫7、第一结合垫8、第二结合垫9、包被膜10和吸水纸11。
样品垫7用于接收样品,其可由选自玻璃纤维素膜或者聚酯膜、棉纤的材料制成,优选由玻璃纤维素膜制成。样品垫7可以起到样品过滤的作用。例如,当待检测样品为血浆、血清时,样品垫7可以过滤样品中的颗粒性不溶物。
第一结合垫8上包被有两种不同粒径荧光微球标记的抗降钙素原的抗体。本实用新型发明人发现,对于灵敏度要求极高的降钙素原的检测而言(低值需要检测到0.05ng/ml),目前的荧光免疫层析法所采用的单个荧光微球存在一定的缺陷。例如,对于大粒径的荧光微球,其有利于低值的检测以达到灵敏度的要求,但是其检测的线性范围不够,因此高值检测不准确。相反,对于小粒径的荧光微球,其检测的线性范围可覆盖高值区域,但是低端的测值不准确,CV值过大。
在本实用新型中,第一结合垫8上所使用的大粒径荧光微球的粒径大小范围在300nm至500nm之间,优选300nm,小粒径荧光微球的粒径大小范围在50nm至150nm之间,优选100nm。大粒径荧光微球标记的抗体有利于低值的检测以达到灵敏度的要求,而小粒径荧光微球标记的抗体使得检测的线性范围可覆盖高值区域。因此,本实用新型的试剂条可满足高灵敏度和宽检测线性范围的要求。
荧光微球上具有选自以下的荧光物质:Cy3荧光素、Cy5荧光素、异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明和四甲基异硫氰酸罗丹明。
第二结合垫9包被有由生物素标记的另一种抗降钙素原的抗体。与第一结合垫8上的抗体相比,第二结合垫9上的抗体特异性结合不同的抗降钙素原的抗原表位。通过将两种不同抗体分别包被于不同的结合垫上,可以避免抗体之间的相互影响。
包被膜10上包被有检测带5和质控带6。检测带5上固定有亲和素, 质控带6上固定有抗鼠IgG的抗体。检测带8和质控带9彼此相间隔,其之间的距离可以在0.05cm至0.8cm之间。在一个实施方式中,检测带和质控带之间的间隔在0.1cm至0.6cm之间,优选在0.3cm至0.5cm之间。在应用本实用新型的试剂卡检测降钙素原的过程中,同时采用了双抗体夹心法和生物素-亲和素级联放大系统,这进一步提高了检测灵敏度,保证了降钙素原检测对灵敏度的极高要求。
吸水纸11可由选自由棉绒、玻纤的材料制成,优选由棉绒制成。
试纸条的整体长度在8cm至10cm之间,整体宽度在0.2cm至0.5cm之间,优选在0.2cm至0.3cm之间,最优选为0.3cm。本实用新型的试纸条在提供灵敏度和检测线性范围的同时,通过降低试纸条的长度和/或宽度可降低抗体的用量,大大节约了生产成本。
图3是本实用新型的荧光免疫层析试剂卡中试剂条的侧视结构示意图。
如图3所示,样品垫7、第一结合垫8、第二结合垫9、包被膜10和吸水纸11在底板12上依次顺序搭接排列。图3中所示的搭接方式仅为示例性实施方式,并不构成对本实用新型的限制。对图3中与图1和图2相同的内容不再进行重复描述。
本实用新型的荧光免疫层析试剂卡具有至少以下诸多优点:
1)试剂卡的设计易于携带、保存及在荧光检测仪中读数;
2)独立样品垫和两个单独结合垫的设计有助于提高降钙素原检测灵敏度;
3)两种不同粒径的荧光微球的应用极好的克服了单荧光微球存在的低值灵敏度和检测线性范围无法兼顾的问题;和
4)通过引入双抗体夹心法和生物素-亲和素放大系统进一步大幅提高了降钙素原检测灵敏度;和
5)试剂卡结构简单,所用材料来源广泛,价格低廉,很适用于降钙素原检测在临床上的大规模推广应用。
实施例
以下实施例用于说明本实用新型,但不应理解为限于在此阐述的实施例。
下述实施例中,所述降钙素原第一抗体、降钙素原第二抗体、抗鼠IgG抗体、Cy3荧光素标记的荧光微球、Cy5荧光素标记的荧光微球、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光微球、四乙基罗丹明(TAMRA)标记的荧光微球、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的荧光微球、亲和素、生物素、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、吡啶、牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、海藻糖、玻璃纤维素膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜、高强度吸水纸均为市售产品。
所述应用两种不同粒径荧光微球检测降钙素原的荧光免疫层析试剂卡的制备方法为:
1)样品垫的制备 
将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入样品垫处理液(含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.1M,pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.05M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。
2)第一结合垫的制备
A、第一结合垫的预处理
将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入结合垫处理液(含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.1M,pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.05M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。
B、标记抗体的两种不同粒径荧光微球的制备
将降钙素原第一抗体以0.1M,pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液4℃透析过夜,调整浓度为2mg/ml-5mg/ml。
使用0.05M,pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤小粒径荧光微球(选自Cy3荧光素标记的荧光微球、Cy5荧光素标记的荧光微球、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光微球、四乙基罗丹明(TAMRA)标记的荧光微球、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的荧光微球中的任意一种),加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol,室温反应20-30分钟,充分洗涤荧光微球, 用0.05M,pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体,使第一抗体与荧光微球的质量比为1:8至1:60,室温反应2小时后,加入含有10%BSA的0.02M,pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟,充分洗涤荧光微球,用含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.05M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
使用0.05M,pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤大粒径荧光微球(选自Cy3荧光素标记的荧光微球、Cy5荧光素标记的荧光微球、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光微球、四乙基罗丹明(TAMRA)标记的荧光微球、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的荧光微球中的任意一种),加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol,室温反应20-30分钟,充分洗涤荧光微球,用0.05M,pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体,使第一抗体与荧光微球的质量比为1:20至1:80,室温反应2小时后,加入含有10%BSA的0.02M,pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟,充分洗涤荧光微球,用含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.05M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
将上述标记第一抗体的两种不同粒径的荧光微球按1:10到10:1的比例进行混匀,即制备出标记抗体的两种不同粒径荧光微球。
C、第一结合垫的制备
将上述步骤B制备获得的标记抗体的两种不同粒径荧光微球使用定量喷膜仪以2μl/cm-8μl/cm均匀喷涂于上述步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时,加入干燥剂封存备用。
3)第二结合垫的制备
A、第二结合垫的预处理
将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入结合垫处理液(含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.1M,pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.05M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。
B、生物素化抗体的制备
将降钙素原第二抗体以0.02M,pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液4℃透析过夜,调整浓度为5mg/ml-10mg/ml。
生物素的预活化:准确称取300mg生物素溶解于8ml的二甲基甲酰胺(DMF)中,室温条件下加入183mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),304mg的N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)及0.1ml的吡啶,将反应混合物在室温下搅拌24小时。过滤除去反应产生的尿素,滤液浓缩后通过硅胶柱色谱纯化,在异丙醇中重结晶得到的白色固体即为预活化的生物素。
用二甲基甲酰胺(DMF)溶解预活化的生物素,使其终浓度为0.05M,并加入到透析过的第二抗体中,使得第二抗体与生物素的摩尔比为1:10-1:25,室温反应1小时,以0.02M,pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液4℃透析过夜。
C、第二结合垫的制备
将上述步骤B制备获得的生物素标记抗体使用定量喷膜仪以2μl/cm-8μl/cm均匀喷涂于上述步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时,加入干燥剂封存备用。
4)包被膜的制备 
A、检测带的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将亲和素稀释到1mg/ml-5mg/ml的浓度,使用定量喷膜仪以1.2μl/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
B、质控带的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将抗小鼠IgG稀释到0.5mg/ml-3mg/ml的浓度,使用定量喷膜仪以0.8μl/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
C、包被膜的制备:用封闭液(含有1-10%BSA和1-10%海藻糖的0.01-0.02M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜封闭1-2小时,取出后置35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时,封袋备用。
5)试纸条的组装 
在湿度小于30%,温度20-30℃条件下进行试纸条的组装。底板选用PVC材料,在底板同一面的方向顺次连接且相邻部位部分重叠的样品垫、 第一结合垫、第二结合垫、包被膜及吸水纸。在包被膜粘覆底板时,检测带的位置靠近结合垫,质控带的位置靠近吸水纸。吸水纸为高强度吸水纸。组装好后裁剪成试纸条。
6)试剂卡的组装 
在湿度小于30%,温度20-30℃条件下进行试剂卡的组装。将上述试纸条置于塑料底座的中间位置,使试纸条的底板与塑料底座相连,并扣合塑料卡盖。卡盖上设置有加样孔和检测孔,加样孔开口于样品垫的上侧,暴露出样品垫的部分区域,检测孔开口于所述包被膜的上侧,暴露出检测带和质控带的全部区域。
7)校准品及待检样品的测定
将100μl的标准品或者待检样品加入到试剂卡的加样孔,进行免疫层析反应,10-15分钟后将试剂卡置于专门的荧光检测仪中,通过读取荧光信号的大小进行定量测定。
以上实施例仅是为了清楚地说明所做的举例,并非对实施方式的限定。

Claims (5)

1.一种降钙素原定量检测荧光免疫层析试剂卡,其特征在于,包括以下组成部分:
a)试剂条,其中所述试剂条包括:
a-1)样品垫,
a-2)包被有由两种不同粒径荧光微球标记的抗降钙素原第一抗体的第一结合垫,
a-3)包被有由生物素标记的抗降钙素原第二抗体的第二结合垫,
a-4)包被有相间隔的检测带和质控带的包被膜,其中所述检测带固定有亲和素,所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体,
a-5)吸水纸,
a-6)底板,其中所述样品垫、第一结合垫、第二结合垫、包被膜和吸水纸在底板上依次搭接粘贴,
b)卡盖,其中所述卡盖包括:
b-1)位于所述样品垫的上侧以暴露出所述样品垫的部分区域的加样孔,和
b-2)位于所述包被膜的上侧以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域的检测孔,和
c)底座,其中所述底座和卡盖彼此相互紧扣,并将所述试剂条扣合在内部。
2.如权利要求1的试剂卡,其特征在于,所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小分别为100nm和300nm。
3.如权利要求1的试剂卡,其特征在于,所述检测带和所述质控带之间的间隔在0.3cm至0.5cm之间。
4.如权利要求1的试剂卡,其特征在于,所述卡盖和所述底座由塑料制成。
5.如权利要求1的试剂卡,其特征在于,所述试剂条的宽度在0.2cm至0.5cm之间。
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