CN204405678U - 用于联合检测心肌肌钙蛋白i-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的试纸条 - Google Patents
用于联合检测心肌肌钙蛋白i-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的试纸条 Download PDFInfo
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Abstract
本实用新型提供了一种用于联合检测心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的试纸条，包括样品垫；同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗心肌肌钙蛋白I的第一抗体以及由生物素标记的抗心肌肌钙蛋白I的第二抗体的抗体结合垫I；同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌红蛋白的第一抗体的抗体结合垫II；同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌酸激酶同工酶的第一抗体的抗体结合垫III；同时包被有相间隔的三条检测线和一条质控线的包被垫；和吸水纸。本实用新型的试纸条能够实现心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检，且具有灵敏度高，使用便捷等优点。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种用于定量检测心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检的层析试纸条。
背景技术
心肌肌钙蛋白I(Cardiac Troponin I，简称cTnI)是心肌细胞死亡的特异及敏感的标志物，其可在心肌损伤时进入血液中，而未发现在健康的或者受损伤的骨骼肌或者其他组织中表达。目前，心肌肌钙蛋白I作为心肌细胞死亡的标记物已经在临床诊断中广泛应用，如：对心肌损伤的诊断、AMI后溶栓治疗的指示、对围术期心肌梗死的诊断、对心肌炎的诊断以及与骨骼肌损伤的鉴别诊断等。
肌红蛋白(Myoglobin，简称Myo)作为心肌损伤的标记物，肌红蛋白作为已经被应用了三十多年。由于肌红蛋白大量存在于骨骼肌组织中，即使轻度的骨骼肌损伤都能导致血液中肌红蛋白浓度的显著升高。因此，肌红蛋白与cTnI一起被用于临床实践中以提高急性心肌梗死诊断的特异性。
肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase-MB，简称CK-MB)是临床诊断急性心肌梗死常用的酶学指标，并利用其增高的时间与梯度观察患者的病情变化、治疗效果及愈后。一般情况下，肌酸激酶同工酶在急性心肌梗死发病后4-8小时内增高，24小时达到峰值，2-3天后恢复正常。肌酸激酶同工酶作为常用的心肌损伤标志物在临床检测中广泛应用。
临床诊断常用的检测方法包括：酶联免疫法、化学发光法、胶乳增强免疫比浊法、胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法等。酶联免疫法及化学发光法检测灵敏度高，但其耗时过长。胶乳增强免疫比浊法虽可实现高通量筛选，但由于方法学本身的限制，其检测灵敏度较低。胶体金免疫层析法操作简单，但只能实现半定量。荧光免疫层析法虽本身具有高灵敏度，但是其易受到高浓度的共存杂质产生的背景荧光的影响，因此在临床检测中实际的灵敏度会大打折扣。
量子点尺寸介于几个nm至几十nm之间。它通常是由无机核以及包覆在核表面的有机分子所构成。对于量子点来说，当其尺寸达到一定的临界值时，材料的行为将呈现出量子特性，材料的结构和性质也将会发生从宏观到微观的改变。量子点的发光原理在于，当量子点的尺寸小到一定值时，由于受到量子尺寸效应的影响，原来连续的能级结构变成类似原子的不连续结构。当光照射到量子点上时，量子点吸收光子，价带上的电子吸收能量后受到激发，跃迁至导带，而在价带上则会产生与被激发电子对应的空穴，跃迁到导带上的电子可以再以辐射跃迁的方式重新回到价带，与价带上的空穴复合并发射出光子。
量子点独特的光学性质主要体现在以下几个方面：
1、通过改变量子点的尺寸和组成可以实现对量子点发射光谱的调控，从而得到多种不同发光颜色的量子点，并可以使量子点的荧光发射光谱覆盖整个可见光区。以CdSe/ZnS量子点为例，随着其尺寸的增大(从2nm增大到7nm)，量子点的发光颜色可以从蓝光(433nm)到红光(610nm)甚至近红外光(655nm)，覆盖了整个可见光范围。
2、宽的激发光谱：同一个激发波长的光可以激发不同大小的量子点，不同尺寸的量子点发射出的荧光不同，有利于在同步检测中的应用。而同一激发光源却难以同时激发多种有机染料。
3、大的Stokes位移(可达几百nm)以及窄且对称的发射光谱，这一特性使在使用量子点时可以有效地避免光谱重叠。
4、量子点具有良好的光稳定性，其荧光可以保持很长时间而不会发生褪色；而有机染料易发生光漂白，其自身的荧光容易随着照射时间的延长而逐渐褪色。
稀土荧光材料是指镧系元素(元素周期表中原子序数从57-71号的15种元素)加上同属ⅢB族中原子序数21的钪Sc、39的钇Y，一共17种元素。当这些元素的离子受到光激发时，离子吸收的能量可使4f电子从能量较低的能级激发跃迁至能量较高的能级，而当4f电子从较高能级以辐射弛豫的方式跃迁回到较低能级时，由于各种镧系元素离子的4f电子能级不同，所以不同镧系元素离子的发光波长也不相同(两个能级间的能量差越大,发射的波长越短)。由于镧系元素离子具有丰富的4f能级和跃迁特性，从而产生大量的吸收光谱信息和荧光光谱信息。稀土荧光材料具有吸收能力强、转换率高、可发射宽范围的光谱，且物理性能稳定等优点。
基于量子点开发的试纸条具备了很高的检测灵敏度，特别是适用于低浓度水平(如pg/ml-ng/ml)待检物含量的准确测定，但是其检测的线性范围不够宽，在相同的一套检测体系范围内，无法实现高值样品的准确定量。因此，单独使用量子点时，无法兼顾到低端的检测灵敏度以及宽线性范围。而通过联合应用其他与量子点具有相似的激发波长和发射波长的荧光元素或者荧光材料，将有望获得更宽的线性范围，并且可以实现在同一套荧光检测系统中进行荧光信号结果的读取，也更有利于在临床的推广及应用。
实用新型内容
技术问题
心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶三项联检对于急性心肌梗死的判断具有重要的临床意义，因此亟待需要开发出一种定量检测心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶，且能够满足高灵敏度和宽线性范围要求的三项联检试纸条。
技术方案
本实用新型提供了一种用于联合检测心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括依次搭接粘贴的以下部件：
1)用于接受来自全血、血浆或血清样品的样品垫；
2)同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗心肌肌钙蛋白I的第一抗体以及由生物素标记的抗心肌肌钙蛋白I的第二抗体的抗体结合垫I，其中所述第一抗体和第二抗体分别特异性识别心肌肌钙蛋白I的不同表位；
3)同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌红蛋白的第一抗体的抗体结合垫II；
4)同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌酸激酶同工酶的第一抗体的抗体结合垫III；
5)同时包被有相间隔的三条检测线和一条质控线的包被垫，其中所述三条检测线依次固定有亲和素、识别肌红蛋白不同表位的抗肌红蛋白的第二抗体及识别肌酸激酶同工酶不同表位的抗肌酸激酶同工酶的第二抗体，所述质控线固定有抗鼠IgG的抗体；和
6)用于提供检测所需的毛细作用力的吸水纸。
在一个实施方式中，所述试纸条进一步包括底板，其中所述底板上粘贴有依次搭接的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫II、抗体结合垫III、包被垫和吸水纸。
在一个实施方式中，所述量子点为微球形式且具有2nm-30nm的粒径范围，且所述量子点选自以下组中：CdTe、CdSe、PbSe、InP和GaN。
在一个实施方式中，所述抗体结合垫I、II和/或III上进一步包被有微球，其中所述微球负载有所述稀土荧光材料和相应的抗体。
在一个实施方式中，所述微球的粒径大小为50nm-400nm。
在一个实施方式中，所述微球的粒径大小为100nm-300nm。
在一个实施方式中，所述微球的粒径大小为100nm或300nm。
在一个实施方式中，所述试纸条的宽度在0.2cm至0.5cm之间。
有益效果
本实用新型的三项联检试纸条兼顾了心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶中低值灵敏度和检测的线性范围的要求。而且，该试剂条制备方法简单，可以实现批量生产，具备广阔的市场前景。
附图说明
图1是本实用新型的试纸条的侧视示意图；和
图2是本实用新型的试纸条的俯视示意图。
附图标记表示为：
1-底板、2-样品垫、3-抗体结合垫I、4-抗体结合垫II、5-抗体结合垫III、6-包被垫、7-吸水纸、8-量子点标记的抗心肌肌钙蛋白I的第一抗体、9-量子点标记的抗肌红蛋白的第一抗体、10-量子点标记的抗肌酸激酶同工酶的第一抗体、11-检测线(心肌肌钙蛋白I)、12-检测线(肌红蛋白)、13-检测线(肌酸激酶同工酶)和14-质控线。
具体实施方式
以下将参照在附图中说明并描述于以下的说明书中的实施方案。应理解由此不意图限制本实用新型的范围。
图1为一种定量检测心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检试纸条的侧视示意图。
如图1所示，本实用新型的三项联检荧光层析试纸条包括底板1和在底板1上顺序搭接粘结的样品垫2、抗体结合垫I 3、抗体结合垫II 4、抗体结合垫III 5、包被垫6和吸水纸7。
样品垫2用于接受来自全血、血浆或血清样品，其可由选自玻璃纤维素膜或者聚酯膜、棉纤的材料制成。样品垫2可以起到过滤样品中的颗粒性不溶物。因此，与市售的部分试纸条相比，采用单独样品垫2的设计有助于提高检测灵敏度。
抗体结合垫I 3、抗体结合垫II 4和抗体结合垫III 5由玻璃纤维素膜或者聚酯膜制成。抗体结合垫I3上同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗心肌肌钙蛋白I的第一抗体以及由生物素标记的抗心肌肌钙蛋白I的第二抗体。抗体结合垫II 4上同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌红蛋白的第一抗体。抗体结合垫III 5上同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌酸激酶同工酶的第一抗体。将针对不同目标蛋白的抗体分别包被于不同的结合垫上，可以有效降低了抗体之间的相互影响，由此提高了检测的灵敏度。
在本实用新型中，术语“标记”包括采用化学或物理使抗待测蛋白的抗体与量子点和稀土荧光材料直接连接。然而，标记也可以通过其它方式完成，例如稀土荧光材料和抗待测蛋白的抗体可通过例如同时包埋或负载在微球上的方式达到“标记”的目的。因此，在一个实施方式中，抗体结合垫上可进一步具有微球(未示出)，所述微球上同时包埋或负载有稀土荧光材料和抗待测蛋白的抗体。在一个实施方式中，包埋或负载在所述微球上的稀土荧光材料和抗待测蛋白的抗体之间可以具有化学连接，例如以稀土荧光材料标记的抗待测蛋白的抗体的形式存在于所述微球上。在另一个实施方式中，包埋或负载在所述微球上的稀土荧光材料和抗待测蛋白的抗体之间可以不具有化学连接，即所述微球上包埋或负载有彼此间无化学连接的稀土荧光材料和抗待测蛋白的抗体。
在一个实施方式中，所述微球可以为聚合物微球，例如聚苯乙烯微球。在一个实施方式中，微球的粒径大小范围在50nm-400nm之间，优选在100nm-300nm之间，更优选为100nm或300nm。
制备稀土荧光微球的方法是现有技术已知的，包括但不限于：包埋法，即在聚合物微球的聚合反应过程中加入稀土材料配合物；键合法，即使稀土元素离子与聚合物侧链上的官能团发生配位反应得到稀土荧光微球；以及溶胀法和包覆法。后两种方法均是在单分散的微球(如：聚苯乙烯微球)的基础上，将稀土材料配合物渗透或包覆在微球的内部或表面，通过控制反应条件，可实现最终制备出单分散性好、荧光强度高、荧光稳定性好的聚合物微球。
量子点是由半导体材料制成的、稳定直径在2nm-30nm的纳米粒子，通常呈现微球形。采用量子点来标记抗体可以极大的提高检测的精确度和灵敏度。但是，基于量子点的检测体现为高值检测不准确。单独稀土荧光材料标记的抗体虽然具备良好的线性范围，但是灵敏度有待改进，体现为低值检测不准确。本实用新型通过联用量子点和稀土荧光材料，量子点标记物有利于低值的检测以达到灵敏度的要求，而稀土荧光材料标记物使得检测的线性范围可覆盖高值区域。
在一个实施方式中，所述量子点具有2nm-30nm的粒径。在一个优选实施方式中，所述量子点具有2nm-20nm的粒径。在一个优选实施方式中，所述量子点具有5nm-20nm的粒径。在一个实施方式中，所述量子点为II-VI族量子点(如CdTe、CdSe等)。在另一个实施方式中，所述量子点为III-V族量子点(如InP、GaN等)。在又一个实施方式中，所述量子点为IV-VI族量子点(如PbSe等)。
在一个实施方式中，所述稀土荧光材料为含有铕(Eu)离子、铽(Tb)离子、钐(Sm)离子、钕(Nd)离子、镝(Dy)离子等各种镧系元素的荧光材料中的一种或者几种。在一个实施方式中，稀土荧光材料为含有铕(Eu)离子、铽(Tb)离子、钐(Sm)离子、钕(Nd)离子、镝(Dy)离子等各种镧系元素的稀土荧光材料中的一种或者几种负载到微球上形成的稀土荧光微球。将稀土荧光材料负载到微球上可进一步提高荧光的稳定性。
而且，在本实用新型的试纸条中，对心肌肌钙蛋白的检测采用双抗体夹心结合生物素-亲和素级联放大的方法进行检测，对肌红蛋白和肌酸激酶同工酶的检测采用双抗体夹心的方法进行检测。在双抗体夹心法中，同时使用分别识别目标蛋白不同表位的两种抗体来特异性结合目标蛋白，由此提高了检测的灵敏性。
包被垫6包被有相间隔的三条检测线和一条质控线。三条检测线11、12和13依次固定有亲和素、识别肌红蛋白不同表位的抗肌红蛋白的第二抗体及识别肌酸激酶同工酶不同表位的抗肌酸激酶同工酶的第二抗体。质控线14固定有抗鼠IgG的抗体。
检测线11、12和13之间的距离可以在0.1cm至0.6cm之间。在一个实施方式中，检测线11、12和13之间的距离在0.2cm至0.5cm之间，优选在0.2cm至0.4cm之间。质控线14用于确定反应体系是否成立，并通过计算检测线11、12和13与质控线14的荧光信号值以精确进行定量。
吸水纸7用于提供检测所需的毛细作用力，其可由选自由棉绒、玻纤的材料制成，优选由棉绒制成。
需要说明，图1的各个层之间的搭接方式，例如一层逐渐高于一层或高低变化的搭接方式仅是示例性说明，诸如采用其它高低变化等搭接方式同样在本实用新型要求保护的试纸条的范围内。
试纸条的整体长度在8cm至12cm之间，整体宽度在0.2cm至0.5cm之间，优选在0.2cm至0.3cm之间，最优选为0.3cm。本实用新型的试纸条在提供灵敏度和检测线性范围的同时，通过降低试纸条的长度和/或宽度可降低抗体的用量，大大节约了生产成本。
图2是本实用新型所述一种定量检测心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检试纸条的俯视示意图。对图2中与图1相同的内容不再赘述。
以下将结合实施例来进一步说明本实用新型。
实施例
以下实施例用于说明本实用新型，但不应理解为限于在此阐述的实施例。
下述实施例中，所述心肌肌钙蛋白I第一抗体、心肌肌钙蛋白I第二抗体、肌红蛋白第一抗体、肌红蛋白第二抗体、肌酸激酶同工酶(CK-MB)第一抗体、肌酸激酶同工酶(CK-MB)第二抗体、抗鼠IgG抗体、亲和素、生物素、量子点、稀土铕荧光微球、氧化铕(Eu2O3)、4,4'-二(1,1',2,2',3,3'-七氟-4',6'-己二酮-6'-基)-氯磺酰-邻三联苯(BHHCT)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、吡啶、牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、海藻糖、Superdex200填料、玻璃纤维素膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜、高强度吸水纸均为市售产品。
所述联合应用量子点与稀土荧光材料的试纸条的制备方法为：
1)样品垫的制备
将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入预处理液(含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。
2)抗体结合垫I的制备
A、抗体结合垫I的预处理
将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入预处理液(含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。
B、量子点标记抗体的制备
使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤经修饰表面含有羧基基团的量子点，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤量子点，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入相同缓冲液透析过的心肌肌钙蛋白I第一抗体，使第一抗体与量子点的质量比为1：5至1：25，室温反应2小时后，加入含有10％BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤量子点，用含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
C、稀土荧光材料标记抗体的制备(1)
用6M HCl溶解Eu2O3，并用超纯水定容至终浓度1mg/ml，再用0.05MpH8.0NH4HCO3溶液稀释500倍。将BHHCT用无水乙醇溶解至终浓度10mg/ml。使用0.05-0.2M，pH9.0-9.5的碳酸盐标记缓冲液对心肌肌钙蛋白I第一抗体透析4-6次，或者超滤离心方式洗涤4-6次，调整浓度至0.25mg/ml。将BHHCT无水乙醇溶液以体积比1：200的比例加入第一抗体溶液中，室温避光持续混匀反应1-3小时。用0.05M pH8.0NH4HCO3溶液脱盐。使用Superdex200填料在1*30cm柱中纯化结合物，用0.1％BSA溶液平衡1-3小时，用0.05M Tris-HCl洗脱，流速为1ml/min。根据280nm吸光度收集蛋白峰，用0.22μm滤器除菌过滤。再用0.05M Tris-HCl稀释20倍，之后加入Eu3+的NH4HCO3溶液，按照体积比为1：5至1：15的比例添加，室温避光持续混匀反应1-2小时。用0.05M Tris-HCl以超滤离心方式清洗并浓缩至抗体浓度大于5mg/ml，备用。
D、稀土荧光材料标记抗体的制备(2)
使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤的稀土铕荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤稀土铕荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体，使心肌肌钙蛋白I第一抗体与荧光微球的质量比为1：8至1：60，室温反应2小时后，加入含有10％BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤稀土铕荧光微球，用含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
E、量子点标记抗体及稀土荧光材料标记抗体的混合
将本部分步骤B中制备的量子点标记抗体与步骤C或者步骤D中制备的稀土荧光材料标记抗体按抗体浓度为1：5至5：1的比例进行混匀，即制备获得联合量子点标记抗体与稀土荧光材料标记抗体的双标记混合物。
F、生物素化抗体的制备
将心肌肌钙蛋白I第二抗体以0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液4℃透析过夜，调整浓度为5mg/ml-10mg/ml。
生物素的预活化：准确称取300mg生物素溶解于8ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，室温条件下加入183mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，304mg的N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)及0.1ml的吡啶，将反应混合物在室温下搅拌24小时。过滤除去反应产生的尿素，滤液浓缩后通过硅胶柱色谱纯化，在异丙醇中重结晶得到的白色固体即为预活化的生物素。
用二甲基甲酰胺(DMF)溶解预活化的生物素，使其终浓度为0.05M，并加入到透析过的第二抗体中，使得第二抗体与生物素的摩尔比为1：10-1：25，室温反应1小时，以0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液4℃透析过夜。
G、抗体结合垫I的制备
将本部分步骤E制备获得的量子点标记抗体与稀土荧光材料标记抗体的双标记混合物与步骤F制备获得的生物素化抗体充分混匀，使用定量喷膜仪以2μl/cm-8μl/cm均匀喷涂于本部分步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时，加入干燥剂封存备用。
3)抗体结合垫II的制备
A、抗体结合垫II的预处理
将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入预处理液(含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。
B、量子点标记抗体的制备
使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤经修饰表面含有羧基基团的量子点，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤量子点，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入相同缓冲液透析过的肌红蛋白第一抗体，使第一抗体与量子点的质量比为1：5至1：25，室温反应2小时后，加入含有10％BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤量子点，用含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
C、稀土荧光材料标记抗体的制备(1)
用6M HCl溶解Eu2O3，并用超纯水定容至终浓度1mg/ml，再用0.05MpH8.0NH4HCO3溶液稀释500倍。将BHHCT用无水乙醇溶解至终浓度10mg/ml。使用0.05-0.2M，pH9.0-9.5的碳酸盐标记缓冲液对肌红蛋白第一抗体透析4-6次，或者超滤离心方式洗涤4-6次，调整浓度至0.25mg/ml。将BHHCT无水乙醇溶液以体积比1：200的比例加入第一抗体溶液中，室温避光持续混匀反应1-3小时。用0.05M pH8.0NH4HCO3溶液脱盐。使用Superdex200填料在1*30cm柱中纯化结合物，用0.1％BSA溶液平衡1-3小时，用0.05M Tris-HCl洗脱，流速为1ml/min。根据280nm吸光度收集蛋白峰，用0.22μm滤器除菌过滤。再用0.05M Tris-HCl稀释20倍，之后加入Eu3+的NH4HCO3溶液，按照体积比为1：5至1：15的比例添加，室温避光持续混匀反应1-2小时。用0.05M Tris-HCl以超滤离心方式清洗并浓缩至抗体浓度大于5mg/ml，备用。
D、稀土荧光材料标记抗体的制备(2)
使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤的稀土铕荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤稀土铕荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体，使肌红蛋白第一抗体与荧光微球的质量比为1：8至1：60，室温反应2小时后，加入含有10％BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤稀土铕荧光微球，用含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
E、量子点标记抗体及稀土荧光材料标记抗体的混合
将本部分步骤B中制备的量子点标记抗体与步骤C或者步骤D中制备的稀土荧光材料标记抗体按抗体浓度为1：5至5：1的比例进行混匀，即制备获得联合量子点标记抗体与稀土荧光材料标记抗体的双标记混合物。
F、抗体结合垫II的制备
将本部分步骤E制备获得的量子点标记抗体与稀土荧光材料标记抗体的双标记混合物使用定量喷膜仪以2μl/cm-8μl/cm均匀喷涂于本部分步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时，加入干燥剂封存备用。
4)抗体结合垫III的制备
A、抗体结合垫III的预处理
将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入预处理液(含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。
B、量子点标记抗体的制备
使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤经修饰表面含有羧基基团的量子点，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤量子点，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入相同缓冲液透析过的肌酸激酶同工酶(CK-MB)第一抗体，使第一抗体与量子点的质量比为1：5至1：25，室温反应2小时后，加入含有10％BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤量子点，用含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
C、稀土荧光材料标记抗体的制备(1)
用6M HCl溶解Eu2O3，并用超纯水定容至终浓度1mg/ml，再用0.05MpH8.0NH4HCO3溶液稀释500倍。将BHHCT用无水乙醇溶解至终浓度10mg/ml。使用0.05-0.2M，pH9.0-9.5的碳酸盐标记缓冲液对肌酸激酶同工酶(CK-MB)第一抗体透析4-6次，或者超滤离心方式洗涤4-6次，调整浓度至0.25mg/ml。将BHHCT无水乙醇溶液以体积比1：200的比例加入第一抗体溶液中，室温避光持续混匀反应1-3小时。用0.05M pH8.0NH4HCO3溶液脱盐。使用Superdex200填料在1*30cm柱中纯化结合物，用0.1％BSA溶液平衡1-3小时，用0.05M Tris-HCl洗脱，流速为1ml/min。根据280nm吸光度收集蛋白峰，用0.22μm滤器除菌过滤。再用0.05MTris-HCl稀释20倍，之后加入Eu3+的NH4HCO3溶液，按照体积比为1：5至1：15的比例添加，室温避光持续混匀反应1-2小时。用0.05M Tris-HCl以超滤离心方式清洗并浓缩至抗体浓度大于5mg/ml，备用。
D、稀土荧光材料标记抗体的制备(2)
使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤的稀土铕荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤稀土铕荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体，使肌酸激酶同工酶(CK-MB)第一抗体与荧光微球的质量比为1：8至1：60，室温反应2小时后，加入含有10％BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤稀土铕荧光微球，用含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
E、量子点标记抗体及稀土荧光材料标记抗体的混合
将本部分步骤B中制备的量子点标记抗体与步骤C或者步骤D中制备的稀土荧光材料标记抗体按抗体浓度为1：5至5：1的比例进行混匀，即制备获得联合量子点标记抗体与稀土荧光材料标记抗体的双标记混合物。
F、抗体结合垫III的制备
将本部分步骤E制备获得的量子点标记抗体与稀土荧光材料标记抗体的双标记混合物使用定量喷膜仪以2μl/cm-8μl/cm均匀喷涂于本部分步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时，加入干燥剂封存备用。
5)包被垫的制备
A、检测线(心肌肌钙蛋白I)的制备：使用包被液(含有0.1-10％海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将亲和素稀释到1mg/ml-5mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2μl/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
B、检测线(肌红蛋白)的制备：使用包被液(含有0.1-10％海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将肌红蛋白第二抗体稀释到0.2mg/ml-4mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2μl/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
C、检测线(肌酸激酶同工酶CK-MB)的制备：使用包被液(含有0.1-10％海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将肌酸激酶同工酶CK-MB第二抗体稀释到0.2mg/ml-4mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2μl/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
D、质控线的制备：使用包被液(含有0.1-10％海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将抗小鼠IgG稀释到0.5mg/ml-3mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以0.8μl/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
E、包被垫的制备：用封闭液(含有1-10％BSA和1-10％海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜封闭1-2小时，取出后置35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时，封袋备用。6)试纸条的组装
在湿度小于30％，温度20-30℃条件下进行试纸条的组装。底板选用PVC材料，在底板同一面的方向顺次连接且相邻部位部分重叠的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫II、抗体结合垫III、包被垫及吸水纸。在包被垫粘覆底板时，检测线的位置靠近抗体结合垫III，质控线的位置靠近吸水纸。组装好后裁剪成试纸条，并装于试纸卡内。
7)校准品及待检样品的测定
将100μl的标准品或者待检样品加入到加样孔，进行免疫层析反应，10-15分钟后将试纸卡置于专门的荧光检测仪中，通过读取荧光信号的大小进行定量测定。
以上实施例仅是为了清楚地说明所做的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上可以做出其他的改进和润饰，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申的显而易见的改进和润饰仍处在本实用新型的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于联合检测心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括依次搭接粘贴的以下部件：
1)用于接受来自全血、血浆或血清样品的样品垫；
2)同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗心肌肌钙蛋白I的第一抗体以及由生物素标记的抗心肌肌钙蛋白I的第二抗体的抗体结合垫I，其中所述第一抗体和第二抗体分别特异性识别心肌肌钙蛋白I的不同表位；
3)同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌红蛋白的第一抗体的抗体结合垫II；
4)同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌酸激酶同工酶的第一抗体的抗体结合垫III；
5)同时包被有相间隔的三条检测线和一条质控线的包被垫，其中所述三条检测线依次固定有亲和素、识别肌红蛋白不同表位的抗肌红蛋白的第二抗体及识别肌酸激酶同工酶不同表位的抗肌酸激酶同工酶的第二抗体，所述质控线固定有抗鼠IgG的抗体；和
6)用于提供检测所需的毛细作用力的吸水纸。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条进一步包括底板，其中所述底板上粘贴有依次搭接的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫II、抗体结合垫III、包被垫和吸水纸。
3.如权利要求1的试纸条，其特征在于，所述量子点为微球形式且具有2nm-30nm的粒径范围，且所述量子点选自以下组中：CdTe、CdSe、PbSe、InP和GaN。
4.如权利要求1的试纸条，其特征在于，所述抗体结合垫I、II和/或III上进一步包被有微球，其中所述微球负载有所述稀土荧光材料和相应的抗体。
5.如权利要求4的试纸条，其特征在于，所述微球的粒径大小为50nm-400nm。
6.如权利要求5的试纸条，其特征在于，所述微球的粒径大小为100nm-300nm。
7.如权利要求6的试纸条，其特征在于，所述微球的粒径大小为100nm或300nm。
8.如权利要求1的试纸条，其特征在于，所述试纸条的宽度在0.2cm至0.5cm之间。
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