CN107703313A

CN107703313A - 一种检测肌红蛋白免疫荧光定量试纸条

Info

Publication number: CN107703313A
Application number: CN201711181761.1A
Authority: CN
Inventors: 何平; 梁婷婷; 李冰; 陈润文; 周琼华
Original assignee: Chuan Yi Biochemical Engineering Co Ltd Of Zhongshan City
Current assignee: Chuan Yi Biochemical Engineering Co Ltd Of Zhongshan City
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2018-02-16

Abstract

本发明公开了一种检测肌红蛋白免疫荧光定量试纸条，本发明所制备的肌红蛋白免疫荧光定量试纸条标准曲线相关系数高，检测准确率高，稳定性好，精密度高，灵敏度高。本发明所用到的储存液具有较高的层析回收率，试纸条上几乎没有荧光微球残存在结合垫或跑到吸水纸上，几乎都被捕获。适合临床上检测，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

Description

一种检测肌红蛋白免疫荧光定量试纸条

技术领域

本发明免疫学检测领域，更具体地涉及一种检测肌红蛋白免疫荧光定量试纸条。

背景技术

肌红蛋白(myoglobin，MYO)是骨骼肌和心肌特异性氧结合蛋白，分子量为17.8kD，由于分子量较小，主要分布于心肌和骨骼肌组织约占肌肉总量的0.1％～0.2％。当心肌或骨骼肌损伤时，MB会从肌肉组织释放到循环血中，并且能经肾小球滤过，出现在尿中。因此血液和尿中MB测定可用于某些肌病和心脏病的诊断，如急性心肌梗死(AMI)、急性肌损伤、急慢性肾衰竭、严重充血性心力衰竭、长时间休克、肌营养不良、肌萎缩和多发性肌炎等疾病。测定血清肌红蛋白肌红蛋白可作为急性心肌梗死(AMI)诊断的早期最灵敏的指标。但特异性差,骨骼肌损伤、创伤、肾功能衰竭等疾病,都可导致其升高。MYO阳性虽不能确诊AMI,但可用于早期排除AMI诊断的重要指标,如MYO阴性,则基本排除心肌梗死,还可用于再梗死的诊断,结合临床,如Myo重新升高,应考虑为再梗死或者梗死延展。

目前肌红蛋白的检测方法主要有酶联荧光分析法、放射免疫法、酶联免疫吸附法、化学发光等。放射免疫法有放射性物质，会造成放射性污染；酶联免疫法测定周期长，不适合急诊的快速检测，对操作人员有较高的专业要求；化学发光成本较高，且检测所需仪器较为昂贵。

荧光免疫层析定量检测技术是免疫层析技术和荧光标记技术的结合，其具有检测仪器精巧轻便、操作简单迅速、结果精准等优点，被广泛应用于多类抗原物质的检测。其中，抗体-荧光微球偶联物实施荧光免疫层析定量检测的关键分子之一，其稳定性关乎抗原荧光定量检测的准确度及其产品的保存期。因此，对抗体-荧光微球偶联物的储存液的要求很高。因此寻找一种助稳性能更好、能提高检测准确度、层析回收率高的储存液对检测肌红蛋白非常具有现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测肌红蛋白免疫荧光定量试纸条。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测肌红蛋白免疫荧光定量试纸条，包括吸水垫、硝酸纤维素膜、质控线、检测线、结合垫、样品垫、PVC底板；其中，结合垫上喷有鼠源肌红蛋白单克隆抗体-荧光微球偶联物；检测线为鼠源肌红蛋白单克隆抗体，质控线为羊抗鼠IgG多克隆抗体，且检测线和质控线依次固定于硝酸纤维素膜上；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并承载于PVC底板；鼠源肌红蛋白单克隆抗体-荧光微球偶联物使用储存液进行浸渍处理、保存和稀释；所述的储存液配方为：PB的质量浓度为15～50mM、BSA的百分浓度为1.6％～10％、Tween-80的百分浓度为0.4％～10％、葡萄糖的百分浓度为0.4％～10％、甘氨酸的百分浓度为1.5％～10％、PEG4000的百分浓度为0.8％～5％、PEG20000的百分浓度为1％～8％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.01％～1.5％，余量为水，pH为6.5～9.0。

进一步的，所述的储存液配方为：PB的质量浓度为20～40mM、BSA的百分浓度为0.5％～4.8％、Tween-80的百分浓度为0.5～6.0％、葡萄糖的百分浓度为0.5～3.0％、甘氨酸的百分浓度为2.0～7.0％、PEG4000的百分浓度为1.0～3.0％、PEG20000的百分浓度为1.5～4.0％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03～0.1％，余量为水，pH为7.0～8.0。

上述所述试纸条的检测方法，将该试纸条加样层析后，检测质控线和检测线的荧光信号强度，并以质控线荧光信号强度校正检测线的荧光信号强度，实现肌红蛋白的定量检测。

一种检测肌红蛋白免疫荧光定量试纸条的制备方法，包括如下步骤：

将荧光微球活化后与鼠源肌红蛋白单克隆抗体偶联，偶联完毕后加入封闭剂，保存于储存液中；

将鼠源肌红蛋白-荧光微球偶联物用储存液稀释后，喷于结合垫上，干燥保存；

将鼠源肌红蛋白单克隆抗体固定于硝酸纤维素膜上作为检测线，将羊抗鼠IgG多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜上作为质控线；

在PVC底板上依次搭接地粘贴：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，并剪切成适当宽度即成为荧光免疫层析试纸条，其中，样品垫材质为玻璃纤维素膜或滤血膜，结合垫材质为玻璃纤维素膜；

所述的储存液配方为：PB的质量浓度为120～40mM、BSA的百分浓度为0.5％～4.8％、Tween-80的百分浓度为0.5～6.0％，葡萄糖的百分浓度为0.5～3.0％、甘氨酸的百分浓度为2.0～7.0％、PEG4000的百分浓度为1.0～3.0％、PEG20000的百分浓度为1.5～4.0％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03～0.1％，余量为水，pH为7.0～8.0。

进一步的，所述的储存液配方为：PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8％、Tween-80的百分浓度为0.5％，葡萄糖的百分浓度为0.5％、甘氨酸的百分浓度为2％、PEG4000的百分浓度为1％、PEG20000的百分浓度为1.5％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03％，余量为水，pH为7.5。

进一步的，鼠源肌红蛋白-荧光微球偶联物在储存液中的保存浓度为0.1～10mg/mL。

本发明的有益效果是：

本发明所制备的肌红蛋白免疫荧光定量试纸条标准曲线相关系数高，检测准确率高，稳定性好，精密度高，灵敏度高。本发明所用到的储存液具有较高的层析回收率，试纸条上几乎没有荧光微球残存在结合垫或跑到吸水纸上，几乎都被捕获。

附图说明

图1为利用本发明储存液制备的肌红蛋白免疫荧光定量试纸条检测贝克曼肌红蛋白标准曲线；

图2为利用本发明储存液制备的肌红蛋白免疫荧光定量试纸条检测肌红蛋白重组抗原的检测值与理论值散点图；

图3为不同储存液制备的试纸条检测含不同浓度肌红蛋白的病人血清样本的荧光检测折线图；

图4为不同储存液制备的试纸条检测含肌红蛋白的病人血清样本检测值与贝克曼-DxI800检测值的相关图。

具体实施方式

实施例1储存液配方及其配制方法

本发明储存液的一个优选配方：PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8％、Tween-80的百分浓度为0.5％，葡萄糖的百分浓度为0.5％、甘氨酸的百分浓度为2％、PEG4000的百分浓度为1％、PEG20000的百分浓度为1.5％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03％，PH7.5。

储存液制备方法：称取0.25g葡萄糖，用45mL纯水溶解。加入1mL事先配好的100mM的PB母液，振荡混匀。先后加入1g甘氨酸，0.5gPEG4000，0.75gPEG20000和0.9gBSA，振荡混匀；用加样枪加入0.25mLTween-80，反复打匀；加入15μL的Proclin300，振荡混匀；用1M的HCl将PH调至7.5。最后室温定容至50mL，过滤除菌，制得储存液。

PB母液配制方法为：称取29g的Na₂HPO₄·12H₂O和2g的K₂HPO₄，加入1L纯水溶解配成为100mM的PB母液。

实施例2肌红蛋白免疫荧光定量试纸条的制备方法

肌红蛋白免疫荧光定量试纸条的制备过程如下：

(1)储存液的制备：PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8％、Tween-80的百分浓度为0.5％，葡萄糖的百分浓度为0.5％、甘氨酸的百分浓度为2％、PEG4000的百分浓度为1％、PEG20000的百分浓度为1.5％、Proclin300百分浓度为0.03％、PH7.5按上述配方配制混匀后过滤除菌，制得储存液；

(2)样品垫的制备：用样品垫处理液浸泡玻璃纤维膜10min，置于干燥间37℃湿度30％，烘干3h，制得样品垫，备用；

(3)结合垫的制备：用结合垫处理液浸泡玻璃纤维素膜10min，浸泡处理后，置于干燥间37℃湿度30％，烘干3h，制得结合垫，备用；

(4)将1mg的200nm聚苯乙烯荧光微球先后加入20μL的0.5mg/mL的EDC和0.5mg/mL的NHS，在活化缓冲液37℃活化1h；

(5)加入0.1mg鼠源肌红蛋白单克隆抗体，在200μL偶联缓冲液中与荧光微球偶联，完毕后加入封闭液20μL，制得鼠源肌红蛋白单克隆抗体-荧光微球偶联物，18000rpm离心15min后，加入200μL储存液，制得鼠源肌红蛋白单克隆抗体-荧光微球偶联物浓度为5mg/mL，2～8℃保存；

(6)用储存液将鼠源肌红蛋白单克隆抗体-荧光微球偶联物稀释到0.5mg/mL，用喷金划膜仪喷于经结合垫处理液处理后的结合垫上，用鼓风干燥箱干燥7h。铝箔袋密封置于20-25℃、湿度约30％的条件下存放备用；

(7)将1mg/mL羊抗鼠IgG多克隆抗体和1mg/mL鼠源肌红蛋白单克隆抗体分别用包被液包被，以条带状1.0mm用喷金划膜仪分别固定于硝酸纤维素膜上分别作为质控线和检测线；

(8)在PVC底板上依次搭接地粘贴：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸，并剪切成宽度4.1mm即成为肌红蛋白荧光定量试纸条；

(9)将上步切好的试纸条装卡，过压壳机，准备检测；

(10)样品垫处理液：100mMPBS、1％Triton X-100、0.75％BSA、0.5％PVA、0.9％NaCl、0.3％葡聚糖、0.05％Proclin300，pH7.8；

(11)结合垫处理液：2％Tween-80、1.5％PVA、0.5％BSA、1％海藻糖，PH7.05-7.10；

(12)活化缓冲液为75mM MES，pH5.5；

(13)偶联缓冲液：20mM PB，pH7.5；

(14)封闭液：20％甘氨酸；

(15)包被液：20mMPBS，1.2％异丙醇、0.4％葡聚糖20000、1.5％BSA、0.5％Tween-80、0.03％Proclin300，pH7.0。

实施例3

配制对照储存液，具体配方为：PB的质量浓度为50mM、BSA的百分浓度为1％、Tween-80的百分浓度为1％，葡萄糖的百分浓度为1％、甘氨酸的百分浓度为0.5％、PEG4000的百分浓度为2％、Proclin300百分浓度为0.3％。

采用实施例1制备的优选储存液(以下简称储存液2)与对照储存液(以下简称储存液1)进行助稳性能和精密度对比，实施方法和结果如下：

用储存液1和储存液2，对相同工艺标记肌红蛋白(MYO)单抗的荧光微球进行喷膜干燥，分别组装成40个试纸条，放铝箔袋、干燥剂封口。一袋放置冰箱4℃保存7天(对照组)，另外一袋放置温箱37℃加速7天。完整7天后，取出卡条，分别加入浓度为50ng/mL和200ng/mL的MYO重组抗原检测。根据理论37℃加速7天相当于4℃保存1年，模拟1年后的抗原检测情况，结果如下表1、表2所示。

表1、2种储存液制得的试纸条测试50ng/mLMYO重组抗原的效果对比

表2、2种储存液制得的试纸条测试200ng/mLMYO重组抗原的效果对比

从表1、2得出，优选的储存液2储在37℃加速七天后，仅下降5％左右，且精密度较好，在10％左右；而对照储存液1在37℃加速七天后，下降15％左右，精密度相对较差，维持在15％左右。

实施例4

将实施例2制备的肌红蛋白免疫荧光定量试纸条建立标准曲线并进行检测，实施方法如下：

(1)建立标准曲线：用MYO标准品配制系列浓度标准品溶液至25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、八个浓度。用制备好的试纸条加样80μL上免疫荧光分析以检测，每个浓度重复3次取平均值。以检测线所出的T峰面积和质控线所出的C峰面积的比值为纵坐标，标准品理论值为横坐标，求出线性回归方程；

标准曲线如图1所示，得线性关系y＝0.0029x-0.0109，R²＝0.9958，用该方程可计算样品中的肌红蛋白含量，实现定量，且相关性好。

(2)样品检测：用抗原稀释液对肌红蛋白重组抗原倍比稀释至25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL、3200ng/mL八个浓度(作为理论值)。抗原稀释液：20mMPBS，0.5％BSA，0.5％Tween-20，PH7.2；将求得T/C峰面代入y＝0.0029x-0.0109中的Y，求得X为所测抗原值(作为测量值)。

结果如图2所示，可以看出实施例1制备的试纸条检测值与理论值偏差小(R²＝0.9981)，检测的准确率高。

实施例5

用储存液1和储存液2(同实施例3)，对相同工艺标记肌红蛋白单抗的荧光微球进行喷膜干燥，组装好试纸条，分别用浓度为31.08ng/mL、54.05/mL、155.3ng/mL、477.5ng/mL、603.2ng/mL、2210.6ng/mL的含肌红蛋白的贝克曼DxI800赋值的病人血清样本对两种试纸条加样检测，随后用配套检测仪器对试纸条窗口信息进行读取。通过仪器激光对窗口的荧光微球进行激发，再采集窗口300个位置(作横坐标)的发射荧光强度(作纵坐标)，利用荧光分析软件将300个点按顺序连在一起形成折线图。

如图3所示，折线图可反映荧光微球在NC膜上的跑膜情况，图中有两个峰，左边为T峰(对应肉眼视卡条为检测线)，右边为C峰(对应肉眼视卡条为质控线)。使用储存液2的整体出峰效果较好，说明储存液2对抗体-荧光微球偶联物从结合垫释放到NC膜效果较好。使用储存液1的则出峰信号不高，基线不平整，前段抬起较明显，影响软件对峰面积的计算，进而影响读值的准确度。

实施例6

用储存液1和储存液3(同实施例3)，对相同工艺肌红蛋白单抗标记的荧光微球进行喷膜干燥，分别组装20个试纸条，用20个不同浓度的含肌红蛋白抗原的病人血清样本同时对两种试纸条加样检测。用配套检测仪器对试纸条窗口信息进行读取，用荧光分析软件计算T峰面积与C峰面积，同时用业界对肌红蛋白项目普遍认可的贝克曼旗下的DxI800全自动血化学发光仪检测的结果值。

以贝克曼DxI800评价2种储存液制备的试纸条检测结果的临床诊断准确性。如图4所示，纵坐标为T峰面积/C峰面积，横坐标贝克曼DxI800结果值，储存液2制备的试纸条检测结果与希贝克曼的DxI800仪器检测结果较吻合(R²＝0.990)，而储存液1的血清线性相关较差(R²＝0.966)，重复性也不好。这与前述储存液2让荧光微球释放效果更好，软件计算面积更加准确有关。

实施例7

用鼠源肌红蛋白标记荧光微球，在标记结束时分别用储存液1和储存液2重悬，在微孔板中加入微孔稀释液80ul，加入0.3ul鼠源肌红蛋白标记的荧光微球，搅拌均匀，剪去结合垫和样品垫部位的包被有鼠源肌红蛋白单克隆抗体和羊抗鼠的试纸条，插进微孔中，让试纸条层析，每个重复10次。

用储存液1和储存液2(同实施例2)，对相同工艺肌红蛋白单抗标记的荧光微球进行喷膜干燥，分别组装10个试纸条，直接加80ul抗原稀释液到试纸条，即检测浓度为0ng/mL。

抗原稀释液(同实施例4)：20mMPBS，0.5％BSA，0.5％Tween-20，pH7.2。

微孔稀释液：10mM Tris，1mM EDTA，PH8.0

用荧光分析软件计算T峰面积与C峰面积，求出两峰的信号总和，计算出均值。其中经过储存液喷膜的层析需要经过结合垫的释放过程，而微孔则不需要，当结合垫完全释放时，相当于微孔层析。在跑样时间内检测出的峰面积越接近微孔层析的峰面积，回收率越高，说明储存液的释放效果越好。结果如下表3所示。

表3、2种储存液的层析回收率对比

类型	储存液1(面积均)	储存液2(面积均)
			微孔层析	356519	390975
加样层析	253129	347968
			回收率	71％	89％

从表3得出，优选的储存液2喷膜的试纸条具有较高的层析回收率，而储存液1喷膜的试纸条可能依然有较多的荧光微球残存在结合垫或跑到吸水纸上没有被捕获。

Claims

1.一种检测肌红蛋白免疫荧光定量试纸条，包括吸水垫、硝酸纤维素膜、质控线、检测线、结合垫、样品垫、PVC底板；其中，结合垫上喷有鼠源肌红蛋白单克隆抗体-荧光微球偶联物；检测线为鼠源肌红蛋白单克隆抗体，质控线为羊抗鼠IgG多克隆抗体，且检测线和质控线依次固定于硝酸纤维素膜上；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并承载于PVC底板；其特征在于：鼠源肌红蛋白单克隆抗体-荧光微球偶联物使用储存液进行浸渍处理、保存和稀释；所述的储存液配方为：PB的质量浓度为15～50mM、BSA的百分浓度为1.6％～10％、Tween-80的百分浓度为0.4％～10％、葡萄糖的百分浓度为0.4％～10％、甘氨酸的百分浓度为1.5％～10％、PEG4000的百分浓度为0.8％～5％、PEG20000的百分浓度为1％～8％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.01％～1.5％，余量为水，pH为6.5～9.0。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述的储存液配方为：PB的质量浓度为20～40mM、BSA的百分浓度为0.5％～4.8％、Tween-80的百分浓度为0.5～6.0％、葡萄糖的百分浓度为0.5～3.0％、甘氨酸的百分浓度为2.0～7.0％、PEG4000的百分浓度为1.0～3.0％、PEG20000的百分浓度为1.5～4.0％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03～0.1％，余量为水，pH为7.0～8.0。

3.权利要求1～2任一项所述的试纸条的检测方法，其特征在于，将该试纸条加样层析后，检测质控线和检测线的荧光信号强度，并以质控线荧光信号强度校正检测线的荧光信号强度，实现肌红蛋白的定量检测。

4.一种检测肌红蛋白免疫荧光定量试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将荧光微球活化后与鼠源肌红蛋白单克隆抗体偶联，偶联完毕后加入封闭剂，保存于储存液中；

(2)将鼠源肌红蛋白-荧光微球偶联物用储存液稀释后，喷于结合垫上，干燥保存；

(3)将鼠源肌红蛋白单克隆抗体固定于硝酸纤维素膜上作为检测线，将羊抗鼠IgG多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜上作为质控线；

(4)在PVC底板上依次搭接地粘贴：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，并剪切成需要的宽度即成为荧光免疫层析试纸条；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的储存液配方为：PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8％、Tween-80的百分浓度为0.5％，葡萄糖的百分浓度为0.5％、甘氨酸的百分浓度为2％、PEG4000的百分浓度为1％、PEG20000的百分浓度为1.5％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03％，余量为水，pH为7.5。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：鼠源肌红蛋白-荧光微球偶联物在储存液中的保存浓度为0.1～10mg/mL。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述样品垫的材质为玻璃纤维素膜或滤血膜。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述结合垫材质为玻璃纤维素膜。