CN102707056B - 快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法 - Google Patents

Abstract

一种快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的试纸条组件，包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的铂卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬、依次接合在底衬上的吸水垫、包被分析膜及样品垫，该包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线包被的特异抗体为抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体，质控线包被的特异抗体为兔IgG抗体；铂卟啉标记特异抗体为抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体；本发明还公开了上述检测试纸条组件的制备方法，及应用该试纸条组件的检测卡及其制备方法，该检测试纸条组件可以简单、快速、灵敏地检测人体内心肌肌酸激酶同工酶的水平，用于诊断急性心肌梗塞。

Description

快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法

技术领域

本发明涉及检验医学领域，特别是涉及一种快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法。

背景技术

肌酸激酶(creatine kinase, CK)是一种二聚体，由M和B两个亚基组成，形成CK–MM、CK-MB和CK–BB同工酶。CK–BB存在于脑组织中，CK–MM和CK-MB存在于各种肌肉组织中。不同组织中，CK同工酶的比例不同，骨骼肌中98％～99％是CK–MM，1％～2％是CK-MB；心肌内80%左右也是CK–MM，但CK-MB占心肌总CK的l5%～25%。

血清CK-MB测定的最重要意义在于诊断急性心肌梗塞。急性心肌梗塞胸痛发作后4～6小时，病人血清CK-MB先于总活性开始升高，12～36小时达峰值；多在72小时内恢复正常。其最高值达对照组4.9～22倍以上。如果梗塞后3～4天，CK-MB仍持续不降，表明心肌梗塞仍在继续进行，如果已下降的CK-MB再次升高则提示原梗塞部位病变扩展或有新的梗塞病灶；如果胸痛患者在48小时内尚未出现CK-MB升高，或小于总活性的2，即可排除急性心肌梗塞的诊断。临床上常以CK-MB超过CK总活性的3（离子交换柱层析法）或10（免疫抑制法）倍作为急性心肌梗塞的诊断依据。用CK-MB诊断急性心肌梗塞时必须注意无论是CK-MB的绝对活性或占总活性百分率的界限值，均不适用于14岁以下的儿童，因为婴幼儿和儿童的CK-MB均高于成人。各种类型的心脏手术后可引起血清CK-MB活性增强，在并发术间或术后心肌梗塞时升高更为显著。进行性肌营养不良病人血清CK-MB亦升高。

CK-MB分析测定有多种方法。测定其活性（U/L）的常用方法为免疫抑制分析。申请号201110073890.5 提供了一种采用免疫抑制原理的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂及其制造方法。但是， CK-MB活性在发病后44小时的诊断阳性率仅为5％，国内报道发病后5小时的阳性率约40％，这意味着在发病64小时内有很大部分病例的CK-MB活性还没有升高，以致于造成该指标的漏诊率偏高。同时，CK-MB活性的酶易于老化，引起CK-MB活性检测降低。而血液中非典型CK、巨CK-1、CK-BB和CK-MM等都会产生干扰现象，导致结果偏高。

一种新的检测方法采用吖啶酯作为化学发光示踪物，利用抗CK-MB单克隆抗体标记吖啶酯，抗CK-BB单克隆抗体包被磁微粒，采用双抗体夹心磁微粒化学发光免疫测定CK-MB的蛋白（μg/L），避免了活性测定中可能遇到（如巨CK等）的干扰，具有高度的敏感性（最低检测限<1μg）和准确性，测定时间短（最快仅需7分钟），适合于自动分析，已被广泛认可。但由于其检测需要昂贵的设备，使其大规模临床应用受到了限制，尤其不利于基层医院使用。

国内现有类似的CK-MB检测方法的有关专利有：专利号ZL200720140932.1，其提供的免疫层析法定性检测CK-MB，不能定量，无法根据CK-MB含量高低对心肌梗塞确诊。

发明内容

为克服现有CK-MB检测技术，如免疫抑制分析阳性率低，漏诊率高的缺点及前述吖啶酯检测方法设备昂贵、普及困难的缺点，根据免疫荧光技术特点和CK-MB抗原抗体系统特点，提供一种检测CK-MB快速、灵敏、特异性好的试纸条。

本发明的一方面提供了一种快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件以及应用该试纸条组件制成的检测卡组件。

一种快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的试纸条组件，包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的铂卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬、依次接合在底衬上的吸水垫、包被分析膜及样品垫，该包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线包被的特异抗体为抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体，质控线包被的特异抗体为兔IgG抗体；铂卟啉标记特异抗体为抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗IgG抗体。

优选地，所述试纸条的所述底衬一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定所述吸水垫、包被分析膜及样品垫，其中所述包被分析膜粘附在所述底衬的中间，所述底衬的两侧分别与所述吸水垫和样品垫连接。

优选地，所述试纸条的所述吸水垫为一种滤纸，该滤纸为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫粘附在所述底衬上，同时所述吸水垫与所述包被分析膜重叠1-2mm连接。

优选地，所述包被分析膜由硝酸纤维素膜组成，所述包被分析膜上喷涂抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和兔IgG抗体。

优选地，所述样品垫为磷酸盐缓冲液缓浸泡过的玻璃纤维膜，所述样品垫与所述包被分析膜重叠1-2mm连接。

优选地，所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体为抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含有如下组分的0.01M磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得：0.01%-0.5%聚乙醇、1%-5%牛血清蛋白、5%-20%甘油和0.01%-0.05%表面活性剂。

优选地，所述的铂卟啉标记的激发光波长范围为390-420nm，发射光波长范围为600nm-700nm。

一种上述快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件的制备方法，包括以下步骤，

1）抗体的制备：

选用纯化的基因工程表达的抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG抗体；

2）包被分析膜的制备：

采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上画检测线和质控线，划线细致均匀，检测线与质控线间隔5mm；

用检测线包被缓冲液稀释抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上；

用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体喷印在硝酸纤维膜的质控线上；

将喷膜后的硝酸纤维膜放入25-50℃的真空干燥箱内干燥 ，干燥后取出密封备用；

3）样品垫的制备：

玻璃纤维膜用含0.01%-0.5%聚乙二醇、1%-5%牛血清蛋白、0.01%-0.05%表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液浸泡后，在25-50℃干燥，干燥后取出密封备用；

4）免疫荧光试纸条的制备：

先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上，在包被分析膜一侧粘附吸水垫，二者重叠1-2mm；在包被分析膜另一侧粘附样品垫，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜、吸水垫和样品垫的底衬裁切成细条；

5）铂卟啉标记特异抗体的制备：

将所述抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，并分别加入30-50mg的铂卟啉溶解液解液，搅匀，室温孵育1-2小时，然后用凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的铂卟啉标记抗体，用0.01M磷酸盐缓冲液稀释混匀；

6）独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液的制备：

将抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体，采用含5%-20%甘油、1%-5%牛血清白蛋白、0.1-2%甘氨酸、0.01%-0.05%表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液一并稀释，分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖，其中每个塑料试剂瓶的分装量为0.3-3ml，在2-8℃下保存。

优选地，所述检测线包被缓冲液为含甲醇0.8%、海藻糖0.8%、牛血清蛋白0.5%、抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体1mg/ml的用25mM pH7.6 磷酸盐缓冲液。

优选地，所述检测线包被缓冲液为含甲醇0.8%、蔗糖1%、牛血清蛋白0.6%、抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体1mg/ml的20mM pH7.6的 三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液。

优选地，所述质控线包被缓冲液为含甲醇0.7-1%、牛血清蛋白0.5-0.8%、兔IgG抗体0.5mg/ml的50mM pH7.6 磷酸盐缓冲液。

一种应用上述的快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件，包括试纸条组件，用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板和背板组成的卡盒；所述背板包括放置所述试纸条组件的卡槽和用于与所述盖板合的卡齿，所述盖板包括可观测检测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔和用于与所述背板的卡齿结合的固定孔；所述试纸条组件通过所述卡齿与所述固定孔结合而嵌合在所述背板和所述盖板之间；所述包被分析膜正对所述检测窗，所述样品垫正对所述加样孔；所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。

一种制备上述快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件的检测卡组件的方法，包括以下步骤,

1）制成背板和盖板：

用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板和盖板，所述背板包括放置所述试纸条组件的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔以及用于与所述背板的卡齿结合的固定孔；

2）组装：

将试纸条组件放在所述背板的卡槽内，通过所述背板的卡齿与所述盖板的固定孔结合，将试纸条组件嵌合在背板和盖板之间，其中，包被分析膜正对所述检测窗，样品垫正对所述加样孔；所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。

3）包装：

将1人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的铂卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存的进行保存。

本发明的原理为固相双抗体夹心法的免疫荧光层析法。待测样品与适当比例的荧光标记抗体在液相均质介质中充分混和均匀，在此过程中样品中的CK-MB能专一性地与荧光标记抗CK-MB抗体充分结合，然后再转加到检测卡上，流经检测卡中的NC膜时，其中所含的、已反应结合在一起的CK-MB-抗CK-MB荧光抗体复合物能为膜上检测线上固定的抗CK-MB的另一个抗体特异性捕获，所发出的荧光可用专用仪器定量测定，荧光强度与样品中CK-MB浓度成正比。

本发明的有益效果是：

1）应用本发明提供的试纸条检测人体内CK-MB水平，成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，只需要配套专用荧光检测仪，因此可广泛应用于各级医疗检验场所，尤其是基层医疗机构，包括乡镇卫生院等均可开展。

2）本发明可定量测定CK-MB，其对于心脑血管事件发生的预防有极为重要的意义。

3）本发明利用了荧光的高灵敏特点，且样品与荧光标记抗体在试剂瓶内反应后再加入检测卡。由于样品与荧光标记抗体在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，同时增加了样品的稀释倍数，去除了样品的基质效应，使定量结果有很好的可重复性，而且此方法省略了直接加样步骤，提高了定量结果的精密度和准确度，可满足同时检测高值和低值的临床诊断要求。

附图说明

图1是本发明试纸条的结构示意图。

图2是本发明检测卡的结构示意图。

图3是铂卟啉发光材料的发射光谱曲线。

图4为本发明的反应方式示意图。

图5为本发明的检测结果示意图。

图6为本发明的检测标准工作曲线。

图中：底衬1、吸水垫2、包被分析膜3、检测线4、质控线5、样品垫6、加样孔7、检测窗8、项目名称9、固定孔10、盖板11、卡槽12、背板13、卡齿14、铂卟啉标记特异抗体15、心肌肌酸激酶同工酶16、检测线抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体17、质控线兔IgG抗体18。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1：

如图1所示，一种快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的试纸条组件，包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的铂卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬1、依次接合在底衬上的吸水垫2、包被分析膜3及样品垫6，该包被分析膜3上设有检测线4和质控线5，检测线4包被的特异抗体为抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体，质控线5包被的特异抗体为兔IgG抗体；铂卟啉标记特异抗体为抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体。

其中，试纸条的底衬1一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定吸水垫2、包被分析膜3及样品垫6，其中包被分析膜3粘附在底衬1的中间，底衬1的两侧分别与吸水垫2和样品垫6连接。

吸水垫2为一种滤纸，该滤纸为吸水纸或滤油纸；吸水垫2粘附在底衬1上，同时吸水垫2与包被分析膜3重叠1-2mm连接。

包被分析膜3由硝酸纤维素膜组成，包被分析膜3上喷涂抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和兔IgG抗体。

样品垫6为磷酸盐缓冲液缓浸泡过的玻璃纤维膜，样品垫6与包被分析膜3重叠1-2mm连接。

独立包装的铂卟啉标记特异抗体为抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体，用含0.01%-0.5%聚乙二醇、1%-5%牛血清蛋白、5%-20%甘油、0.01%-0.05%表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料试剂瓶密封包装。

一种上述快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤，

1）抗体的制备：

选用纯化的基因工程表达的抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG。

2）包被分析膜3的制备：

采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上画检测线4和质控线5，划线细致均匀，检测线4与质控线5间隔5mm；

用检测线包被缓冲液稀释抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将抗肌钙蛋白T单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线4上；

用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG喷印在硝酸纤维膜的质控线5上；

将喷膜后的硝酸纤维膜放入25-50℃的真空干燥箱内干燥 ，干燥后取出密封备用；

3）样品垫6的制备：

玻璃纤维膜用含0.01%-0.5%聚乙二醇、1%-5%牛血清蛋白、0.01%-0.05%表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液浸泡后，在25-50℃干燥，干燥后取出密封备用；

4）免疫荧光试纸条的制备：

先将包被分析膜3粘附在底衬1中间位置上，在包被分析膜3一侧粘附吸水垫，二者重叠1-2mm；在包被分析膜另一侧粘附样品垫，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜3、吸水垫2和样品垫6的底衬1裁切成细条；

5）铂卟啉标记特异抗体的制备：

将抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入30mg荧光素Alexa Flour 647溶解液，搅匀，室温孵育1小时，每隔15分钟混匀一次。最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用含0.01%-0.5%聚乙二醇、1%-5%牛血清蛋白、5%-20%甘油、0.01%-0.05%表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。

6）独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液的制备：

将抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体，采用含5%-20%甘油、1%-5%牛血清白蛋白、0.1-2%甘氨酸、0.01%-0.05%表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液一并稀释，分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖，其中每个塑料试剂瓶的分装量为0.3-3ml，在2-8℃下保存。

其中，检测线包被缓冲液采用25mM pH7.6 磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液），含甲醇0.8%、海藻糖0.8%、牛血清蛋白0.5%、抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体1mg/ml。

质控线包被缓冲液采用50mM pH7.6磷酸盐缓冲液（PB缓冲液），含甲醇1%、牛血清蛋白0.8%、兔IgG抗体0.5mg/ml。

用包被缓冲液将抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和IgG抗体分别稀释至浓度为10-20ug/ml。

如图2所示，一种快速定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件，其包括试纸条、由用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板11和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板13组成的卡盒。所述背板13包括放置试纸条的卡槽12和用于与盖板结合的卡齿14；所述盖板11包括可观测检测结果的检测窗8、可滴加样品的加样孔7和用于与背板13的卡齿14结合的固定孔10。所述试纸条通过所述卡齿14与所述固定孔10结合而嵌合在所述背板13和所述盖板11之间，即形成了检测卡。其中，所述包被分析膜3正对所述检测窗8，所述样品垫6正对所述加样孔7；另外，独立包装的铂卟啉标记特异抗体15分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。

本发明提供一种制备快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的方法，其包括以下步骤：

1）制成背板13和盖板11：

用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板13和盖板11，背板13包括放置所述试纸条组件的卡槽12和用于与盖板11结合的卡齿14，盖板11包括可测结果的检测窗8、可滴加样品的加样孔7以及用于与背板的卡齿14结合的固定孔10；

2）组装：

将试纸条放在背板13的卡槽12内，通过背板13的卡齿14与盖板11的固定孔10结合，将试纸条嵌合在背板13和盖板11之间，其中，包被分析膜3正对检测窗8，样品垫6正对加样孔7；

3）包装：

将1人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的铂卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存的进行保存。

检测原理：

其中，铂卟啉标记特异抗体的激发光波长范围为390-420nm，发射光波长范围为600nm-700nm。参阅图3所示，铂卟啉发光材料的发射光谱曲线进行分析，发现铂卟啉所具有的特征光谱的激发光光源范围为390-420nm，发射光波长范围为600-700nm。由于铂卟啉发光标记物的特点，使得以其作为标记物的免疫荧光试纸条可与仪器结合，使得基于铂卟啉发光技术的免疫层析试纸条可进行灵敏度极高的多重分析、且对目标被检测物进行灵敏度极高的精确定量检测。

本发明采用免疫荧光快速检测技术，利用荧光的高灵敏特点，待测样品与铂卟啉标记先在试剂瓶内反应，由于待测样品与铂卟啉标记在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，同时增加了待测样品的稀释倍数，去除了待测样品的基质效应，使定量结果有很好的可重复性，而且此方法省略了直接加样步骤，提高了定量结果的精密度和准确度，可满足同时检测高值和低值的临床诊断要求，参照附图4，铂卟啉标记特异抗体与待测样品中充分结合形成一复合物；然后复合物转加到检测卡上，在吸水垫2的吸力下流经到检测卡中的包被分析膜3上，如果该复合物具有心肌肌酸激酶同工酶，其能被检测线4上的抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体捕获17，在绿色光照射下以红外光光信号的形式表现出来，所发出的荧光可用专用仪器定量测定，荧光强度与样品中心肌肌酸激酶同工酶的浓度成正比；如果复合物中心肌肌酸激酶同工酶低于最低检测标准，则检测线4不会发出荧光；试纸条有效的情况下，质控线5上的兔IgG抗体18均会与复合物反应发出荧光。请参阅图5中的a、b、c所示，即检测线4与质控线5均发光，试纸条检测结果呈阳性；只有质控线5发光，试纸条检测结果呈阴性；两条线均未发光，试纸条检测结果无效。

本发明的工作标准曲线的绘制：

首先，将提纯的心肌肌酸激酶同工酶标准品用1:10稀释的正常人血清(采用pH7.2 0.02M PB缓冲液稀释)作为稀释液配制系列浓度标准品，浓度为：0ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份样品。其次，每个样品分别用10个MA试纸条检测10次，10次检测仪器判读的样品检测T值和对照C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出每个浓度对应的T/C结果，列于表1。

表1为本发明不同浓度下的T/C值

以T/C值作为X坐标，以本发明中的肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白浓度作为Y坐标绘制标准工作曲线，经统计拟合标准工作曲线的表达式为：Y = 0.6919X + 1.5387，拟合系数的平方为R²=0.999。结果见图6：本发明检测标准工作曲线。

实施例2

步骤2中，检测线包被液制备方法是：20mM pH7.6三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液（TAPS缓冲液），含甲醇0.8%、蔗糖1%、牛血清蛋白0.6%、10M50抗体1mg/ml。质控线包被液的制备：50mM pH7.6磷酸盐缓冲液（ PB缓冲液），含甲醇0.7%、牛血清蛋白0.5%、兔IgG0.5mg/ml。包被膜的制备：调试BIO-DOT喷膜机，膜液量为20ul/40cm，机器划线，检测线与质控线间隔5mm，划线细致均匀，放置25℃-37℃真空干燥箱处理1.5小时，装袋密封备用。

实施例3：

本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于：

步骤3中，将抗CK-MB单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入40mg荧光素铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1.5小时，每隔15分钟混匀一次。最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用含0.01%-0.5%聚乙二醇、1%-5%牛血清蛋白、5%-20%甘油、0.01%-0.05%表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。

实施例4：

本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于：

步骤3中，将抗CK-MB单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入50mg荧光素铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育2小时，每隔15分钟混匀一次。最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用含0.01%-0.5%聚乙二醇、1%-5%牛血清蛋白、5%-20%甘油、0.01%-0.05%表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。

实施例5：

本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于：

步骤4中，用含0.4%聚乙二醇、3.5%牛血清蛋白、0.02%表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液，采用BIO-DOT喷膜机分别喷印在样品垫上，将喷印后的样品垫放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥4小时后取出密封备用。

对实施例1-5的试纸条进行性能方面的测定，最低检测限为0.01ng/ml。同时对临床样品进行检测。将58例收集自医院的心肌肌酸激酶同工酶临床样品（其中阳性37份，阴性21份）同时用胶体金免疫层析试纸与本系统进行双盲法检测：

胶体金免疫层析试纸法——31份阳性，27份阴性（即6份阳性漏检）；

铂卟啉试纸与仪器法——37份阳性，21份阴性，与实际结果完全吻合。同时，与胶体金免疫层析试纸的定性检测相比，铂卟啉试纸与仪器法给出了每份样品的最终准确浓度。

将此58例收集自医院的心肌肌酸激酶同工酶临床样品，同时与化学发光法检测进行相关性分析，以化学发光检测结果作为X坐标，铂卟啉试纸与仪器法结果作为Y坐标绘制相关性分析曲线，表达式为Y=0.9993X-2.6157，相关性系数为r=0.9988，按照统计学分析，r>95%，P<0.01，具有正相关关系。

在批内精密度方面，利用实施例1-5的试纸条，对含量分别为高值、中值和低值的样品，连续进行至少10次检测，计算变异系数(CV)。对于心肌肌酸激酶同工酶含量高值（200ng/ml）、中值（90ng/ml）、低值（15ng/ml）样品各一份分别测定10次，根据其测定的数据，采用SPSS统计方法分析，以测定结果均值±标准差表示，高值201.8±2.7ng/ml，CV2.3%；中值89.6±1.3ng/ml，CV5.2%；低值15.1±1.2ng/ml，CV7.9%；检测结果CV值均小于15%。

在批间精密度方面，利用实施例1-5的试纸条，对一份心肌肌酸激酶同工酶临床阳性样品用pH7.2 0.02M PB缓冲液稀释10倍，联系进行至少10次检测，结果列于表2。计算该份样品重复检测的变异系数(CV)为1.83%。

有上述检测可见，本发明检测方法具有更高的灵敏度，且在实现精确定量检测的同时具有很好地稳定性。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (11)

1.一种定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液，试纸条包括底衬、依次接合在底衬上的吸水垫、包被分析膜及样品垫，该包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线包被的特异抗体为抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体，质控线包被的特异抗体为兔IgG抗体；铂卟啉标记特异抗体为抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体；

其中所述的定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件的制备方法包括以下步骤，

1)抗体的制备：

选用纯化的基因工程表达的抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG抗体；

2)包被分析膜的制备：

采用喷膜机分别在一硝酸纤维素膜上划检测线和质控线，划线细致均匀，检测线与质控线间隔5mm；

用检测线包被缓冲液稀释抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体至浓度为10-20μg/ml，采用喷膜机将抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体喷印在硝酸纤维素膜的检测线上；

用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为10-20μg/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体对应喷印在硝酸纤维素膜的质控线上；

将喷膜后的硝酸纤维素膜放入25-50℃的真空干燥箱内干燥，干燥后取出密封备用；

3)样品垫的制备：

玻璃纤维膜用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清蛋白和0.01％-0.05％表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液浸泡后，在25-50℃干燥，干燥后取出密封备用；

4)免疫荧光试纸条的制备：

先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上，在包被分析膜一侧粘附吸水垫，二者重叠1-2mm；在包被分析膜另一侧粘附样品垫，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜、吸水垫和样品垫的底衬裁切成细条；

5)铂卟啉标记特异抗体的制备：

将所述抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，并分别加入30-50mg的铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1-2小时，然后用凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的铂卟啉标记抗体，用0.01M磷酸盐缓冲液稀释混匀；

6)独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液的制备：

将铂卟啉标记的抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体，采用含5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.1-2％甘氨酸和0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液一并稀释，分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖，其中每个塑料试剂瓶的分装量为0.3-3ml，在2-8℃下保存。

2.根据权利要求1所述的定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述试纸条的所述底衬一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定所述吸水垫、包被分析膜及样品垫，其中所述包被分析膜粘附在所述底衬的中间，所述底衬的两侧分别与所述吸水垫和样品垫连接。

3.根据权利要求1或2所述的定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述试纸条的所述吸水垫为一种滤纸，该滤纸为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫粘附在所述底衬上，同时所述吸水垫与所述包被分析膜重叠1-2mm连接。

4.根据权利要求1所述的定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述铂卟啉标记特异抗体为抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含有如下组分的0.01M磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得：0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清蛋白、5％-20％甘油和0.01％-0.05％表面活性剂。

5.根据权利要求1所述的定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述的铂卟啉标记的激发光波长范围为390-420nm，发射光波长范围为600nm-700nm。

6.一种权利要求1所述的定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤，

1)抗体的制备：

选用纯化的基因工程表达的抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG抗体；

2)包被分析膜的制备：

采用喷膜机分别在一硝酸纤维素膜上划检测线和质控线，划线细致均匀，检测线与质控线间隔5mm；

用检测线包被缓冲液稀释抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体至浓度为10-20μg/ml，采用喷膜机将抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体喷印在硝酸纤维素膜的检测线上；

用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为10-20μg/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体对应喷印在硝酸纤维素膜的质控线上；

将喷膜后的硝酸纤维素膜放入25-50℃的真空干燥箱内干燥，干燥后取出密封备用；

3)样品垫的制备：

玻璃纤维膜用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清蛋白和0.01％-0.05％表面活性剂的0.04M磷酸盐缓冲液浸泡后，在25-50℃干燥，干燥后取出密封备用；

4)免疫荧光试纸条的制备：

先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上，在包被分析膜一侧粘附吸水垫，二者重叠1-2mm；在包被分析膜另一侧粘附样品垫，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜、吸水垫和样品垫的底衬裁切成细条；

5)铂卟啉标记特异抗体的制备：

将所述抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，并分别加入30-50mg的铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1-2小时，然后用凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的铂卟啉标记抗体，用0.01M磷酸盐缓冲液稀释混匀；

6)独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液的制备：

将铂卟啉标记的抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体和抗兔IgG抗体，采用含5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.1-2％甘氨酸和0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液一并稀释，分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖，其中每个塑料试剂瓶的分装量为0.3-3ml，在2-8℃下保存。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测线包被缓冲液为含甲醇0.8％、海藻糖0.8％、牛血清蛋白0.5％和抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体1mg/ml的25mM pH7.6的磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，检测线包被缓冲液为含甲醇0.8％、蔗糖1％、牛血清蛋白0.6％和抗心肌肌酸激酶同工酶单克隆抗体1mg/ml的20mM pH7.6的三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，质控线包被缓冲液为含甲醇0.7-1％、牛血清蛋白0.5-0.8％和兔IgG抗体0.5mg/ml的50mM pH7.6磷酸盐缓冲液。

10.一种应用权利要求1所述的定量检测心肌肌酸激酶同工酶的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件，其特征在于：所述检测卡组件包括试纸条组件，盖板和背板组成的卡盒；所述盖板和背板用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成；所述背板包括放置所述试纸条的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可观测检测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔和用于与所述背板的卡齿结合的固定孔；所述试纸条通过所述卡齿与所述固定孔结合而嵌合在所述背板和所述盖板之间；所述包被分析膜正对所述检测窗，所述样品垫正对所述加样孔；所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。

11.一种制备权利要求10所述检测卡组件的方法，其特征在于包括以下步骤,

1)制成背板和盖板：

用聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料材质制成背板和盖板，所述背板包括放置所述试纸条的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔以及用于与所述背板的卡齿结合的固定孔；

2)组装：

将试纸条放在所述背板的卡槽内，通过所述背板的卡齿与所述盖板的固定孔结合，将试纸条嵌合在背板和盖板之间，其中，包被分析膜正对所述检测窗，样品垫正对所述加样孔；所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖；

3)包装：

将1人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的铂卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存进行保存。