CN102680704B - 一种快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法 - Google Patents
一种快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件及制备方法，试纸条组件包括试纸条和独立包装的铂卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬、吸水垫、包被分析膜及样品垫，该包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线包被的特异抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体，质控线包被的特异抗体为兔IgG抗体；铂卟啉标记特异抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体；检测卡组件包括试纸条、由盖板和背板组成的卡盒以及独立包装的铂卟啉标记特异抗体，本发明检测人尿液中微量白蛋白，操作简单、快速、灵敏和特异性好，且具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制备方法。
背景技术
血清白蛋白部分可由肾小球通过，但几乎皆被肾小管重吸收，当肾小球病变时其滤过量增多，以致超过肾小管的重吸收而从尿中排出，便形成尿微量白蛋白(MA)。尿微量白蛋白是指尿中白蛋白的排泄率每分钟超过20g或24h超过30mg，浓度为30-200mg/L，用常规方法无法检出。大量研究已证明尿微量白蛋白阳性是肾损伤尤其是肾小球损伤的早期标志，其排出量的多少与肾小球基底膜损伤的程度呈正相关，与1型糖尿病、2型糖尿病的预后有密切关系。近年来的大量研究表明，MA同时也是高血压、冠心病、自身免疫性疾病等造成肾损伤的早期诊断指标，在临床上受到越来越广泛的重视。
糖尿病(DM)患病率逐年增加，早期发病多隐匿无症状，晚期因严重并发症而危及人的健康和生命，因此，其早期发现、诊断和治疗至关重要。对糖尿病患者尿分别用于化学试纸法进行蛋白定性及免疫透射比浊法进行尿微量白蛋白定量检测，结果发现，尿蛋白定性试验的阳性率仅为8.46％，而尿微量白蛋白的阳性率为53.7％，说明MA的检测更能及早地提示糖尿病性肾损伤。
近年来，有关原发性高血压的研究越来越深入，特别是高血压造成的靶器官损害已成为中老年人致死致残的主要因素，业已证明，高血压也是加重肾功能恶化的重要因素之一，25％的终末期肾病与高血压有关。原发性高血压引起的小动脉病变常累及肾血管，使肾小球滤过膜损害，造成尿MA的排出量增加。高血压患者伴有MA较为普遍，且随着年龄、病程和高血压的严重程度而升高。有报道在正常高值血压人群和高血压人群，MAU的发生率分别为15.0％和26.2％，明显高于正常血压者的6.5％。因此，对高血压病人的前瞻性研究中MAU被认为是一个预测心血管发病率和死亡率的较好的早期标志。
一些研究表明微量白蛋白尿可作为一项评价内皮功能不全以及动脉粥样硬化的可靠指标，它的出现提示发生冠心病的危险性将明显增加。测定非糖尿病的冠心病患者尿中自蛋白的含量，发现其MA水平明显高于对照组患者，并且随着冠状动脉病变数量和程度的增加，MA的阳性率均进行性升高，提示MA与动脉粥样硬化的发生、发展和病变程度关系密切，MA可能是冠状动脉粥样硬化的标志。
因此，MA的检测不仅对肾脏疾病的诊断有重要价值，而且与非肾源性疾病如糖尿病、心血管疾病等有着密切的联系，因此，将MA作为一项常规检测，对这些疾病的早期诊断、病情发展、预后以及临床指导用药等有着重要的临床意义。
临床实验室常采用放射免疫测定法(RIA)、免疫比浊法(IT)、荧光免疫测定(FIA)、酶免疫测定(EIA)、时间分辨荧光免疫测定法(TRFIA)、间接胶乳凝集试验、Micral-Test和溴酚蓝(BPB)染料结合法测定尿MA，这些方法的参考值范围变动很大，从5mg/L到超过200mg/L。随着人们对于低水平MA与心血管疾病关系的认识，这些测定方法的灵敏度远远不能满足要求。疾病的早期诊断和及时治疗是至关重要的。但目前的检测方法，要么需要昂贵的仪器设备和试剂，要么只是半定量的手工方法，操作规范性差。
金属卟啉是自然界中广泛存在的一类大环化合物，如血红素、叶绿素、VB12等，它们在生命体的新陈代谢以及很多基本生物过程中都起着不可忽视的作用。卟啉分子由4个吡咯环通过次甲基连结，形成一四配位卟啉核。卟啉环非常稳定，可与直径为3.7埃的金属发生配位；它与过渡态金属形成的络合物尤其稳定，比如，Zn四苯基卟啉(ZnTPP)，其稳定常数为1029。大部分金属都与卟啉形成1∶1的络合物，只有Na、K、Li络合物的配合比为2∶1，两个金属原子分别位于卟啉环平面的上方和下方。卟啉的电子吸收光谱主要有Soret带(又名B带)和Q带。Soret带位于400～450nm之间，摩尔吸光系数高(2～5×105mol-1.L.cm-1)。而金属卟啉的Soret带吸收较弱，当环侧有亲电子基团时，Soret带将向长波方向移动。卟啉的Q带一般在450～650nm之间，有4个相关峰；当吡咯环氮上的氢被金属离子取代形成金属卟啉后，4个相关峰减弱或消失。卟啉和金属卟啉由于具有18电子大π离域结构，所以，以其B带或Q带作为激发波长，均在600～700nm间(或更长的波长范围)有不同程度的荧光发射；一般情况下，金属卟啉的荧光强度要弱于卟啉。室温下，卟啉本身不发磷光，当与某些金属形成络合物并与有序介质(如：表面活性剂、蛋白质和核酸等生物大分子)共存时才在近红外区发射磷光；但只有极少数的金属卟啉发磷光，最常见的为钯卟啉和铂卟啉。钯/铂卟啉具有极强的磷光，其特点是长寿命(ms)，长波长(600～1000nm)。最常见的有水溶性meso-四(4-磺酸苯基)卟啉(H2TSPP4-)和meso-四(4-N-三甲氨基苯基)卟啉(H2TMAP4+)的钯/铂络合物，以及非水溶性的八乙基卟啉(OEP)和四苯基-四苯并卟啉(Ph4TBP)的钯/铂络合物等。600～1000nm的近红外区是研究生物物质发光探针和光化学传感器的一个极为有用的区域。所以，具有特殊磷光特性的钯/铂卟啉便成为生物分析方面非常有效的探针分子，结合一些简单的检测仪器便可提供很高的灵敏度和选择性。
这种以铂为基础的卟啉在外界激发下，在650nm发出强磷光，持续时间100-微秒(吸收波范围390-410nm)，在670nm发出强磷光持续时间500-微秒(吸收波范围400-420nm)。这些卟啉粒子也有很大的stokes位移(均为280nm)。与其它发光材料相比较，铂卟啉的优势在于极微的光漂白，使用便宜的强光源，如发光二极管就能有效激发了。此外，生物样本和硝酸纤维素膜的背景荧光在390-420nm激发比在365nm时都低。尽管390-420nm光透过硝酸纤维素膜也不尽理想，但优于365nm光，更适合于透射式测量。铂卟啉还可共价标记抗体，为检测各种样本提供了一个灵敏的快速检测技术。
目前，免疫层析技术中所使用的标记物通常是酶、胶体金以及各种彩色微球标记物，这些标记物应用于免疫层析技术中有相同的特点：物理吸附方式标记和通过颜色判断检测结果。其中物理吸附方式标记(即疏水性和静电吸附原理)的特点使得其容易形成非特异性干扰，需要在生产工艺配方中添加非特异性干扰消除试剂，如吐温20等表面活性剂等，但使用这类试剂的同时，也容易造成基于这类标记物的假阳性或假阴性的结果。另外通过颜色判读结果在使用时必然受观察者主观影响大，尤其是弱阳性结果，且只能做出定性判断，而无法实现精确的定量判定。这些缺点大大限制了免疫层析技术在临床检测中的应用范围。
因此，建立一种检测时间尽量缩短，并且检测除了能在实验室进行外，还要求能够进行床旁检测，同时能定量测定MA方法，从而为临床提供准确的诊断依据，是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种快速、简单、灵敏度高、可靠稳定且可以定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件，其包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的铂卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬、依次接合在底衬上的吸水垫、包被分析膜及样品垫，该包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线包被的特异抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体，质控线包被的特异抗体为兔IgG抗体；铂卟啉标记特异抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体。
优选地，所述试纸条的所述底衬一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定所述吸水垫、包被分析膜及样品垫，其中所述包被分析膜粘附在所述底衬的中间，所述底衬的两侧分别与所述吸水垫和样品垫连接。
优选地，所述试纸条的所述吸水垫为一种滤纸，该滤纸为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫粘附在所述底衬上，同时所述吸水垫与所述包被分析膜重叠1-2mm连接。
优选地，所述包被分析膜由硝酸纤维素膜组成，所述包被分析膜上喷涂抗微量白蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体。
优选地，所述样品垫为磷酸盐缓冲液缓浸泡过的玻璃纤维膜，所述样品垫与所述包被分析膜重叠1-2mm连接。
优选地，所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含如下组分的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得：5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.1-2％甘氨酸和0.01％-0.05％表面活性剂。
优选地，所述独立包装的铂卟啉标的激发光光源波长范围为390-420nm，发射光波长范围为600nm-700nm。
一种制备上述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其包括以下步骤：
1)抗体的制备：
选用纯化的基因工程表达的抗微量白蛋白单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG抗体；
2)包被分析膜的制备：
采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上划检测线和质控线，划线细致均匀，检测线与质控线间隔5mm；
用检测线包被缓冲液稀释抗微量白蛋白单克隆抗体至浓度为5-20ug/ml，采用喷膜机将抗微量白蛋白单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上；
用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为5-20ug/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体喷印在硝酸纤维膜的质控线上；
将喷膜后的硝酸纤维膜放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用；
3)样品垫的制备：
用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液浸泡，缓冲液PH为7.2-7.6，浸泡处理后，将样品垫放入65℃的真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用；
4)免疫荧光试纸条的制备：
先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上，在包被分析膜一端粘附吸水垫，二者重叠1-2mm；在包被分析膜另一端粘附样品垫，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜、吸水垫和样品垫的底衬裁切成细条；
5)铂卟啉标记特异抗体的制备：
将抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.05-0.2M、pH9.5-11.0碳酸氢钠溶液稀释至1-2mg/ml，分别加入30-50mg的铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1-2小时，孵育过程中每隔15-20分钟分别混匀一次，最后分别用规格型号为G25的凝胶柱过柱分离纯化，分别收集铂卟啉标记好的抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，各自用0.01-0.1M、pH7.2-7.6磷酸盐缓冲液稀释混匀后于-20℃保存；
6)独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液的制备：
按照需要确定适当浓度的铂卟啉标记的抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，采用含5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.1-2％甘氨酸、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液一并稀释，分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖，其中每个塑料试剂瓶的分装量为0.3-3ml，在2-8℃下保存。
优选地，所述检测线包被缓冲液的制备方法：用20mM、pH7.6的磷酸盐缓冲液稀释，使含甲醇1.0％、蔗糖1.5％、牛血清白蛋白0.6％的抗微量白蛋白单克隆抗体的浓度至1mg/ml；质控线包被缓冲液的制备方法：用50mM、pH7.6的聚丁烯缓冲液稀释，使含甲醇0.7％、牛血清白蛋白0.5％的兔IgG抗体的浓度至0.5mg/ml；包被分析膜的制备：调试喷膜机，膜液量为25ul/40cm，机器划线，检测线与质控线间隔5mm，划线细致均匀，放置25℃-37℃真空干燥箱处理1.5小时，装袋密封备用。
优选地，标记抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体的铂卟啉标记的铂卟啉溶解液为30-50mg。
优选地，样品垫的制备中，用含0.4％聚乙二醇、1.5％牛血清白蛋白、0.02％表面活性剂的0.02M磷酸盐缓冲液浸泡，将浸泡后的所述样品垫放入65℃真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用。
一种由上述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件，其包括试纸条、由用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板组成的卡盒以及独立包装的铂卟啉标记特异抗体，所述背板包括放置试纸条的卡槽和用于与盖板结合的卡齿，所述盖板包括可观测检测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔和用于与背板的卡齿结合的固定孔，所述试纸条通过所述卡齿与所述固定孔结合而嵌合在所述背板和所述盖板之间，其中，所述包被分析膜正对所述检测窗，所述样品垫正对所述加样孔；另外，独立包装的铂卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。
一种制备上述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的方法，其包括以下步骤：
1)制成背板和盖板：
用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板和盖板，所述背板包括放置所述试纸条的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可观测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔以及用于与所述背板的卡齿结合的固定孔；
2)组装：
将试纸条放在所述背板的所述卡槽内，通过所述背板的卡齿与所述盖板的固定孔结合，将试纸条嵌合在背板和盖板之间，其中，包被分析膜正对所述检测窗，样品垫正对所述加样孔。
3)包装：
将1人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的铂卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存的进行保存。
本发明提供的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件，利用荧光的高灵敏特点，样品与铂卟啉标记抗体反应后再加入检测卡，使得样品与铂卟啉标记抗体在液相中全面接触、反应充分，这样的检测成本低廉，操作简单、快速、灵敏度高、可靠稳定且特异性好，只需要配套专用荧光检测仪，即可定量测定微量白蛋白，其对于肾脏疾病、心脑血管事件发生的预防有极为重要的意义，因此可广泛应用于各级医疗检验场所。
附图说明
下面结合附图中的实施例对本发明作进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制。
图1是本发明试纸条的结构示意图。
图2是本发明检测卡的结构示意图。
图3是铂卟啉发光材料的发射光谱曲线。
图4为本发明的反应方式示意图。
图5为本发明的检测结果示意图。
图6为本发明的微量白蛋白检测标准工作曲线。
图7为本发明的微量白蛋白检测结果相关性分析曲线。
图中：底衬1、吸水垫2、包被分析膜3、检测线4、质控线5、样品垫6、加样孔7、检测窗8、项目名称9、固定孔10、盖板11、卡槽12、背板13、卡齿14、铂卟啉标记特异抗体15、微量白蛋白16、检测线抗微量白蛋白单克隆抗体17、质控线兔IgG抗体18。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
实施例1：
参阅图1所示，本发明的一种基于铂卟啉发光技术的快速定量检测微量白蛋白(MA)的免疫荧光试纸条组件，其包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的铂卟啉标记特异抗体15。试纸条包括底衬1、粘附在底衬1中间位置的包被分析膜3、位于包被分析膜3两端且与其重叠1-2mm连接的吸水垫2及样品垫6。该包被分析膜3上设有通过喷膜机喷印形成的检测线4和质控线5，检测线4包被的特异抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体，质控线5包被的特异抗体为兔IgG抗体。铂卟啉标记特异抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体。
试纸条的底衬1一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定吸水垫2、包被分析膜3及样品垫6；吸水垫2为一种滤纸，该滤纸为吸水纸或滤油纸；包被分析膜3由硝酸纤维素膜组成，包被分析膜上喷涂抗微量白蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体；样品垫为磷酸盐缓冲液缓浸泡过的玻璃纤维膜。
独立包装的铂卟啉标记特异抗体15为抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，用含5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.1-2％甘氨酸、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料试剂瓶密封包装。
本发明还提供一种制备所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其包括以下步骤：
1)抗体的制备：
选用纯化的基因工程表达的抗微量白蛋白单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG抗体；
2)包被分析膜3的制备：
采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上划检测线和质控线，划线细致均匀，检测线与质控线间隔5mm；
用检测线包被缓冲液稀释抗微量白蛋白单克隆抗体至浓度为5-20ug/ml，采用喷膜机将抗微量白蛋白单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上；
用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为5-20ug/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体喷印在硝酸纤维膜的质控线上；
将喷膜后的硝酸纤维膜放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用；；
3)样品垫的制备：
用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液浸泡，缓冲液PH为7.2-7.6，浸泡处理后，将样品垫放入65℃的真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用；
4)免疫荧光试纸条的制备：
先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上，在包被分析膜一端粘附吸水垫，二者重叠1-2mm；在包被分析膜另一端粘附样品垫，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜、吸水垫和样品垫的底衬裁切成4mm宽的细条；
5)铂卟啉标记特异抗体15的制备：
将抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.05-0.2M、pH9.5-11.0碳酸氢钠溶液稀释至1-2mg/ml，分别加入适量的铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1-2小时，孵育过程中每隔15-20分钟分别混匀一次，最后分别用规格型号为G25的凝胶柱过柱分离纯化，分别收集铂卟啉标记好的抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，各自用0.01-0.1M、pH7.2-7.6磷酸盐缓冲液稀释混匀后于-20℃保存；
6)独立包装的铂卟啉标记特异抗体15工作液的制备：
按照需要确定适当浓度的铂卟啉标记的抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，采用含5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.1-2％甘氨酸、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液一并稀释，分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖，其中每个塑料试剂瓶的分装量为0.3-3ml，在2-8℃下保存。
参阅图2所示，一种由快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件，其包括试纸条、由用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板11和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板13组成的卡盒以及独立包装的铂卟啉标记特异抗体15。所述背板13包括放置试纸条的卡槽12和用于与盖板结合的卡齿14；所述盖板11包括可观测检测结果的检测窗8、可滴加样品的加样孔7和用于与背板13的卡齿14结合的固定孔10。所述试纸条通过所述卡齿14与所述固定孔10结合而嵌合在所述背板13和所述盖板11之间，即形成了检测卡。其中，所述包被分析膜3正对所述检测窗8，所述样品垫6正对所述加样孔7；另外，独立包装的铂卟啉标记特异抗体15分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。
本发明提供一种制备快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的方法，其包括以下步骤：
1)制成背板和盖板：
用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板13和盖板11，所述背板包括放置所述试纸条组件的卡槽12和用于与所述盖板结合的卡齿14，所述盖板11包括可观测结果的检测窗8、可滴加样品的加样孔7以及用于与所述背板的卡齿结合的固定孔10；
2)组装：
将试纸条放在所述背板13的所述卡槽12内，通过所述背板13的卡齿14与所述盖板11的固定孔10结合，将试纸条组件嵌合在背板13和盖板11之间，其中，包被分析膜3正对所述检测窗8，样品垫6正对所述加样孔7。
3)包装：
将1人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的铂卟啉标记特异抗体15，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体15装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存的进行保存。
检测原理：
参阅图3所示，铂卟啉发光材料的发射光谱曲线进行分析，发现铂卟啉所具有的特征光谱的激发光光源波长范围为390-420nm，发射光波长范围为600-700nm。由于铂卟啉发光标记物的特点，使得以其作为标记物的免疫荧光试纸条可与仪器结合，使得基于铂卟啉发光技术的免疫层析试纸条可进行灵敏度极高的多重分析、且对目标被检测物进行灵敏度极高的精确定量检测。
本发明采用免疫荧光快速检测技术，利用荧光的高灵敏特点，待测样品与铂卟啉标记先在试剂瓶内反应，由于待测样品与铂卟啉标记在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，同时增加了待测样品的稀释倍数，去除了待测样品的基质效应，使定量结果有很好的可重复性，而且此方法省略了直接加样步骤，提高了定量结果的精密度和准确度，可满足同时检测高值和低值的临床诊断要求，铂卟啉标记特异抗体与待测样品中充分结合形成一复合物；然后复合物转加到检测卡的加样孔7的样品垫6上，如图4所示，在吸水垫2的吸力下该复合物流经到检测卡中的包被分析膜3上，如果该复合物具有微量白蛋白，其能被检测线4上的抗微量白蛋白单克隆抗体捕获17，在绿色光照射下以红外光光信号的形式表现出来，所发出的荧光可用专用仪器定量测定，荧光强度与样品中微量白蛋白的浓度成正比；如果复合物中微量白蛋白低于最低检测标准，则检测线4不会发出荧光；试纸条有效的情况下，质控线5上的兔IgG抗体18均会与复合物反应发出荧光。请参阅图5中的a、b、c所示，即检测线4与质控线5均发光，试纸条检测结果呈阳性；只有质控线5发光，试纸条检测结果呈阴性；两条线均未发光，试纸条检测结果无效。
本发明将铂卟啉发光材料与免疫层析技术相结合，为传统的免疫层析技术带来了突破性的变革：
一、铂卟啉发光标记物的特点，使得以其作为标记物的免疫层析试纸条可与仪器结合，对目标被检测物进行灵敏度极高的精确定量检测；
二、铂卟啉所具有的特征光谱(激发光谱和发射光谱)，使得基于铂卟啉发光技术的免疫层析试纸条可进行灵敏度极高的多重分析，即一次性对生物样品中的多个目标被检测物进行检测；
三、铂卟啉独特的大Stock位移的发光现象，使其作为标记物的检测过程排除了由于目标被检测物自发荧光造成干扰的可能，提高了信噪比，从而提高了检测的灵敏度和特异性；
四、通过共价方式交联生物活性分子，在保证检测灵敏度的前提下提高了检测系统的可靠性和稳定性。
本发明标准工作曲线：
首先，将提纯的微量白蛋白标准品用1∶10稀释的正常人血清(采用pH7.20.02M PB缓冲液稀释)作为稀释液配制系列浓度标准品，浓度为：0ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份样品。其次，每个样品分别用10个MA试纸条检测10次，10次检测仪器判读的样品检测T值和对照C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出每个浓度对应的T/C结果，列于表1。
表1、不同浓度下的T/C值
以T/C值作为X坐标，以MA浓度作为Y坐标绘制标准工作曲线，经统计拟合标准工作曲线的表达式为：Y＝0.692X+1.5386，拟合系数的平方为R2＝0.999。结果见图6：MA检测标准工作曲线。
实施例2：
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，不同点在于：
步骤2中，检测线包被缓冲液制备方法是：用20mM pH7.6磷酸盐缓冲液稀释，使含甲醇1.0％、蔗糖1.5％、牛血清蛋白0.6％的抗微量白蛋白单克隆抗体的浓度至1mg/ml。质控线包被缓冲液的制备：用50mM pH7.6磷酸盐缓冲液稀释，使含甲醇0.7％、牛血清蛋白0.5％的兔IgG抗体的浓度至0.5mg/ml。包被膜的制备：调试喷膜机，膜液量为25ul/40cm，机器划线，捕获线与质控线间隔5mm，划线细致均匀，放置25℃-37℃真空干燥箱处理1.5小时，装袋密封备用。
实施例3：
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，不同点在于：
步骤3中，将抗微量白蛋白单克隆抗体1和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入40mg荧光材料铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1.5小时，每隔15分钟混匀一次；最后用规格型号为G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光材料铂卟啉标记抗体，用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。
实施例4：
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，不同点在于：
步骤3中，将抗微量白蛋白单克隆抗1和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入50mg荧光素铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育2小时，每隔15分钟混匀一次。最后用规格型号为G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。
实施例5：
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，不同点在于：
步骤4中，用含0.4％聚乙二醇、1.5％牛血清蛋白、0.02％表面活性剂的0.02M磷酸盐缓冲液浸泡，将浸泡后的样品垫放入65℃的真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用。
对实施例1-5的试纸条进行性能方面的测定，最低检测限为0.01ng/ml。同时对临床样品进行检测。将58例收集自医院的微量白蛋白临床样品(其中阳性37份，阴性21份)同时用胶体金免疫层析试纸与本系统进行双盲法检测：
胶体金免疫层析试纸法——31份阳性，27份阴性(即6份阳性漏检)；
铂卟啉试纸与仪器法——37份阳性，21份阴性，与实际结果完全吻合。同时，与胶体金免疫层析试纸的定性检测相比，铂卟啉试纸与仪器法给出了每份样品的最终准确浓度。
将此58例收集自医院的微量白蛋白临床样品，同时与化学发光法检测进行相关性分析，以化学发光检测结果作为X坐标，铂卟啉试纸与仪器法结果作为Y坐标绘制相关性分析曲线，表达式为Y＝0.9993X-2.6157，相关性系数为r＝0.9988。分析结果见图7：微量白蛋白检测结果相关性分析曲线。按照统计学分析，r＞95％，P＜0.01，具有正相关关系。
在批内精密度方面，利用实施例1-5的试纸条，对含量分别为高值、中值和低值的样品，连续进行至少10次检测，计算变异系数(CV)。对于微量白蛋白含量高值(200ng/ml)、中值(90ng/ml)、低值(15ng/ml)样品各一份分别测定10次，根据其测定的数据，采用SPSS统计方法分析，以测定结果均值±标准差表示，高值201.8±2.7ng/ml，CV2.3％；中值89.6±1.3ng/ml，CV5.2％；低值15.1±1.2ng/ml，CV7.9％；检测结果CV值均小于15％。
在批间精密度方面，利用实施例1-5的试纸条，对一份微量白蛋白临床阳性样品用pH7.20.02M PB缓冲液稀释10倍，联系进行至少10次检测，结果列于表2。计算该份样品重复检测的变异系数(CV)为1.83％。
表2为本发明的实施例的检测值
| 重复检测序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| T/C | 36.70 | 35.40 | 37.80 | 36.85 | 38.10 |
| MA浓度(ng/ml) | 30.0 | 29.5 | 31.0 | 30.0 | 31.5 |
| 重复检测序号 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| T/C | 35.45 | 38.20 | 37.60 | 34.75 | 34.80 |
| MA浓度(ng/ml) | 29.5 | 31.5 | 31.0 | 29.0 | 29.0 |
有上述检测可见，本发明检测方法具有更高的灵敏度，且在实现精确定量检测的同时具有很好地稳定性。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。本技术领域的普通技术人员依据以上实施例对本发明公开的内容和各项参数所取范围作出适当的修改和变动，均属于本发明的保护范围。
Claims (13)
1.一种快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的铂卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬、依次接合在底衬上的吸水垫、包被分析膜及样品垫，该包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线包被的特异抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体，质控线包被的特异抗体为兔IgG抗体；铂卟啉标记特异抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体；
其中所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件的制备方法包括以下步骤：
1)抗体的制备：
选用纯化的基因工程表达的抗微量白蛋白单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG抗体；
2)包被分析膜的制备：
采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上划检测线和质控线，划线细致均匀，检测线与质控线间隔5mm；
用检测线包被缓冲液稀释抗微量白蛋白单克隆抗体至浓度为5-20μg/ml，采用喷膜机将抗微量白蛋白单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上；
用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为5-20μg/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体喷印在硝酸纤维膜的质控线上；
将喷膜后的硝酸纤维膜放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用；
3)样品垫的制备：
用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液浸泡，缓冲液PH为7.2-7.6，浸泡处理后，将样品垫放入65℃的真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用；
4)免疫荧光试纸条的制备：
先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上，在包被分析膜一端粘附吸水垫，二者重叠1-2mm；在包被分析膜另一端粘附样品垫，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜、吸水垫和样品垫的底衬裁切成细条；
5)铂卟啉标记特异抗体的制备：
将抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.05-0.2M、pH9.5-11.0碳酸氢钠溶液稀释至1-2mg/ml，分别加入适量的铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1-2小时，孵育过程中每隔15-20分钟分别混匀一次，最后分别用规格型号为G25的凝胶柱过柱分离纯化，分别收集铂卟啉标记好的抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，各自用0.01-0.1M、pH7.2-7.6磷酸盐缓冲液稀释混匀后于-20℃保存；
6)独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液的制备：
按照需要确定适当浓度的铂卟啉标记的抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，采用含5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.1-2％甘氨酸、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液一并稀释，分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖，其中每个塑料试剂瓶的分装量为0.3-3ml，在2-8℃下保存。
2.根据权利要求1所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述试纸条的所述底衬一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定所述吸水垫、包被分析膜及样品垫，其中所述包被分析膜粘附在所述底衬的中间，所述底衬的两侧分别与所述吸水垫和样品垫连接。
3.根据权利要求1或2所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述试纸条的所述吸水垫为一种滤纸，该滤纸为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫粘附在所述底衬上，同时所述吸水垫与所述包被分析膜重叠1-2mm连接。
4.根据权利要求1或2所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述包被分析膜由硝酸纤维素膜组成，所述包被分析膜上喷涂抗微量白蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体。
5.根据权利要求1或2所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述样品垫为磷酸盐缓冲液浸泡过的玻璃纤维膜，所述样品垫与所述包被分析膜重叠1-2mm连接。
6.根据权利要求1或2所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并用含如下组分的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得：5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.1-2％甘氨酸和0.01％-0.05％表面活性剂。
7.根据权利要求1所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述独立包装的铂卟啉标记的激发光光源波长范围为390-420nm，发射光波长范围为600nm-700nm。
8.一种制备权利要求1所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
1)抗体的制备：
选用纯化的基因工程表达的抗微量白蛋白单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG抗体；
2)包被分析膜的制备：
采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上划检测线和质控线，划线细致均匀，检测线与质控线间隔5mm；
用检测线包被缓冲液稀释抗微量白蛋白单克隆抗体至浓度为5-20μg/ml，采用喷膜机将抗微量白蛋白单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上；
用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为5-20μg/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体喷印在硝酸纤维膜的质控线上；
将喷膜后的硝酸纤维膜放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用；
3)样品垫的制备：
用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液浸泡，缓冲液PH为7.2-7.6，浸泡处理后，将样品垫放入65℃的真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用；
4)免疫荧光试纸条的制备：
先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上，在包被分析膜一端粘附吸水垫，二者重叠1-2mm；在包被分析膜另一端粘附样品垫，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜、吸水垫和样品垫的底衬裁切成细条；
5)铂卟啉标记特异抗体的制备：
将抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.05-0.2M、pH9.5-11.0碳酸氢钠溶液稀释至1-2mg/ml，分别加入适量的铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1-2小时，孵育过程中每隔15-20分钟分别混匀一次，最后分别用规格型号为G25的凝胶柱过柱分离纯化，分别收集铂卟啉标记好的抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，各自用0.01-0.1M、pH7.2-7.6磷酸盐缓冲液稀释混匀后于-20℃保存；
6)独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液的制备：
按照需要确定适当浓度的铂卟啉标记的抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体，采用含5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.1-2％甘氨酸、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液一并稀释，分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖，其中每个塑料试剂瓶的分装量为0.3-3ml，在2-8℃下保存。
9.如权利要求8所述的制备权利要求1所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于：检测线包被缓冲液的制备方法为：用20mM、pH7.6的磷酸盐缓冲液稀释，使含甲醇1.0％、蔗糖1.5％、牛血清白蛋白0.6％的抗微量白蛋白单克隆抗体的浓度至1mg/ml；质控线包被缓冲液的制备方法：用50mM、pH7.6的聚丁烯缓冲液稀释，使含甲醇0.7％、牛血清白蛋白0.5％的兔IgG抗体的浓度至0.5mg/ml；包被分析膜的制备：调试喷膜机，膜液量为25μl/40cm，机器划线，检测线与质控线间隔5mm，划线细致均匀，放置25℃-37℃真空干燥箱处理1.5小时，装袋密封备用。
10.如权利要求8所述的制备权利要求1所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于：铂卟啉标记特异抗体的制备中的标记抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔IgG抗体的铂卟啉标记的铂卟啉溶解液为30-50mg。
11.如权利要求8所述的制备权利要求1所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于：样品垫的制备中，用含0.4％聚乙二醇、1.5％牛血清白蛋白、0.02％表面活性剂的0.02M磷酸盐缓冲液浸泡，将浸泡后的所述样品垫放入65℃真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用。
12.一种由权利要求1所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件，其特征在于：包括试纸条、由用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板组成的卡盒以及独立包装的铂卟啉标记特异抗体，所述背板包括放置试纸条的卡槽和用于与盖板结合的卡齿，所述盖板包括可观测检测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔和用于与背板的卡齿结合的固定孔，所述试纸条通过所述卡齿与所述固定孔结合而嵌合在所述背板和所述盖板之间，其中，所述包被分析膜正对所述检测窗，所述样品垫正对所述加样孔；另外，独立包装的铂卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。
13.一种制备权利要求12所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)制成背板和盖板：
用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板和盖板，所述背板包括放置所述试纸条的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可观测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔以及用于与所述背板的卡齿结合的固定孔；
2)组装：
将试纸条放在所述背板的所述卡槽内，通过所述背板的卡齿与所述盖板的固定孔结合，将试纸条嵌合在背板和盖板之间，其中，包被分析膜正对所述检测窗，样品垫正对所述加样孔，另外，独立包装的铂卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖；
3)包装：
将1人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的铂卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存的进行保存。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: immunofluorescence test strip module for rapidly and quantitatively testing microalbumin, test card module made of same and preparation method thereof Effective date of registration: 20190304 Granted publication date: 20150211 Pledgee: Guangzhou Branch of Guangzhou Bank Co.,Ltd. Pledgor: GUANGZHOU HONGQI OPTICAL INSTRUMENT TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: 2019440000084 |
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| PP01 | Preservation of patent right |
Effective date of registration: 20190729 Granted publication date: 20150211 |
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| PP01 | Preservation of patent right | ||
| PD01 | Discharge of preservation of patent |
Date of cancellation: 20220729 Granted publication date: 20150211 |
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| PD01 | Discharge of preservation of patent | ||
| PP01 | Preservation of patent right |
Effective date of registration: 20220729 Granted publication date: 20150211 |
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| PP01 | Preservation of patent right |