CN1092424A - 对特定波长光敏的卟菲花青和扩增的类卟啉化合物及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

一组新的扩大的类卟啉化合物——卟菲花青 (Porphacyanine)(Pc)及类卟菲花青化合物，其最大 吸光范围为400—850nm，可有效用来检测和治疗目 标组织、细胞和病毒。使用本发明的Pc允许以不能 被血液吸收的波长的光线照射。本发明的Pc还可 与诸如免疫球蛋白或其片段的靶特异性部分共轭来 标定待放射处理的特异性组织或细胞。使用这些物 质使得透入治疗更深且对目标组织或细胞更有特 效。通过与适当的顺磁性离子或放射性同位素偶 合。本发明的Pc适用于核磁共振成像和放射成 像。本文公开了合成本发明Pc的新方法。

Description

本申请部份地是1992年10月30日的申请案No.07/968966的继续，该申请所公开的内容被引入本文作为参考。
本发明涉及新的扩增的，对特定波长光敏的卟菲花青（Por-phacyanine）和扩增的类卟啉化合物、制备它们的新方法，以及将这些化合物用作媒介，通过放射检测或破坏靶细胞或组织。具体地说，本发明涉及在250-850毫微米（nm）波长范围内具有最大吸收作用的卟菲花青和其它类卟菲花青化合物及其衍生物的制备，以及将它们用作媒介照射待检测或欲破坏的细胞或组织，还涉及将这些化合物或其共轭物用于在特定靶组织上照射时的聚焦作用。此外，本发明涉及将卟菲花青和类卟菲花青化合物及其衍生物用于放射成象方法和磁共振成象方法。
虽然人们已付出了可观的努力致力于合成和研究卟啉和其它四吡咯大环化合物，但关于更大的含芳族吡咯的体系，即所谓“扩增的卟啉”却鲜为人知。这种体系由于含有更大量的π电子，附加的配位杂原子和更大的中心结合核心，而可以赋予超出卟啉的许多优点。
对这些化合物的研究是在几十年前随着首先报道的由三吡烷（tripyrrane）二羧酸和双吡咯二羧基醛合成Sapphyrin而开始的。（Woodward，R.B.，Aromaticity  Conferenee，Scheffield，England，1966;并参看Broadhurst等人，J.Chem.Soc.Perkins  Trans.（1972）1∶2111和Bauer等人（1983）J.Am.Chem.Soc.105∶6429）。1970年M.M.King报告了由双吡咯二羧基醛和吡咯二吡咯基甲烷二羧酸合成Smaragdyrin。（Ph.D.Dissertation，Harvard  University，Cambridge，MA）
过酞菁的铀酰配合物是另一种具有历史价值的五吡咯大环化合物。这种化合物通过将二氰基苯和二氯铀酰直接模板缩合而制备，但其自由碱是不稳定的（Day等（1975）J.Am，Chem.Soc.97∶4519）。脱金属作用导致环的收缩，结果形成酞菁（Marks，T.J.和D.R.Stojakovic（1978）J.Am.Chem.Soc.100∶1695）。
Gossauer通过将双-α-三吡烷与三吡烷二醛缩合，继而氧化而合成了第一个hexaphyrin（Bull.Soc.Chim.Belg.（1983）92∶793）。在hexaphyrin中存在的六个次甲基桥连中，两个具有E构型（Id.）。Charriere则报告说hexaphyrin与几种过渡金属形成双金属配合物（1987，Thesis，University  de  Fribourg，Suisse）。另一种六吡咯体系即rubyrin已在最近被合成并作了结构表征（Sessler等人（1991a）Angew.Chem.Int.Ed.Engl.30∶977）。
插烯卟啉或Platyrin是R.A.Berger和E.LeGoff首先描述的另一重要类型的含吡咯大环化合物（Tetra.Lett.（1978）44∶4225，并参看LeGoff，E.和O.G.Weaver（1987）J.Org.Chem.52∶711;以及Franck等人（1988）Proc.SPIE  Int.Soc.Opt.Eng.，Ser.5，997∶107）。这些化合物一般是将二吡咯甲烷与乙烯醛取代的二吡咯甲烷反应而合成（Beckman等人（1990）Angew.Chem.Int.Ed.Ehgl.29∶1395）。双插烯的扩增的卟啉被进一步扩增成四插烯卟啉，在它当中全部四个正常的单个原子的中间桥连都被扩大。四插烯卟啉是通过N保护的吡咯取代的烯丙醇经酸催化自身缩合而制得的。四插烯卟啉具有很强的距离一般卟啉大于150nm的类似索瑞带的移位（Gos-mann，M.和B.Franck（1986）Angew.Chem.Inc.Ed.Ehgl.25∶1100;Knubel，G.和B.Franck（1988）Angew.Chem.Int.Ed.Engl.27∶1170）。此外，最近已有合成双插烯porphycent的报导（Jux等人。（1990）Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29∶1385;Vogel等人（1990）Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29∶1387）。
另一类型的含大环吡咯是由texaphyrin代表的席夫碱化合物（Sessler）等人（1987）J.Org.Chem.52∶4394;Sessler等人（1988）J.Am.Chem.Soc.110∶5586）。texaphyrin由三吡烷二醛与O-苯二胺经过酸催化缩合而成。texaphyrin的几种类似物使用相似的对策被制备（Sessler等人（1991b）Abstract  of  the  201st  Natl.Soc.Mtg.，Inorganic  Division;Sessler等人（1992）Inorg.Chem.28∶529）。
将卟啉与照射相结合用于检测和治疗恶性细胞到现在已有相当长的历史（例如参看PORPHYRIN  PHOTOSENSITIZATION，Kessl，D.等人，eds.Plenum  Press，1983）。某些卟啉似乎有“天然地”测定恶性细胞位置的能力。在照射时，卟啉具有两个使其有用的特性。首先，当用紫外线或可见光照射时，它们可发出荧光，因而可被用于与检测恶性肿瘤有关的诊断方法中（例如参看Kessel等人，Supra;Gregory，H.B.Jr.等人，Ann.Surg.（1968）167∶827-829）。
此外，当用紫外线（UV）、可见光或接近红外的光照射时，某些卟啉在被测定出位置的细胞上呈现出细胞毒性的作用（例如参看diamond，I.等人.，Lancet（1972）2∶1175-1177;Dougher-ty，T.J.等人，Cancer  Research（1978）38∶2628-2635;Dougherty，T.J.等人，THE  SCIENCE  OF  PHOTO  MEDICINE  625-638，（J.D.Regan  &  J.A.Parrish，eds.，1982）;Dougherty，T.J.等人，CANCER：PRINCIPLES  AND  PRACTICE  OF  ON-COLOGY  1836-1844（V.T.Devita  Jr.等人，eds.，1982））。某些扩增的卟啉如Sapphyrin、texaphyrin和插烯的卟啉拥有单一长度的波长和单谱线产生氧的特性，这种特性使它们作为潜在的用于肿瘤光线疗法的光敏材料而引起注意（Maiya等人（1990）J.Phys.Chem.94∶3597;Sessel等人（1991c）SPIE  Soc.1426∶318;Franck等人，Supra）。
虽然某些卟啉，例如血卟啉与对目标细胞有特异性的免疫球蛋白的共轭作用可以改善某些卟啉导向所希望细胞或组织的能力，但这仍然没有解决另一个对于这种通常的治疗处理而言是次要的问题，即为活化某些卟啉所需的照射波长（在630nm范围内）也是一种能量，它易于被其它的卟啉和正常存在于血液和其它组织中的天然发色团吸收。因而，由于吸收光的天然发色团如血红蛋白的阻挡作用，使有效的治疗深度被限于几个毫米。据此，希望引入化合物作为照射的媒介，使它能在较长的波长被激发，因而避免遍及被照射生物体存在的天然发色团的阻挡作用。
除了光线疗法之外，扩增的卟啉用于磁共振成象（MRI）。MRI是一种非侵入式非电离的方法，它使正常的和不正常的组织在较早的发展阶段被观察和识别。然而此时MRI有一个显著的缺点，即其中患病组织相对正常组织而言，其信号的增强程度经常不足以使这种方法用于许多临床情况。为克服这个问题，正在进行的大量的尝试是研究MRI的造影剂。顺磁金属配合物，例如由钆（Ⅲ）（Gd）衍生的配合物近来在临床实验中被证明特别有效。
到现在为止，在MRI造影剂中配置钆已通过使用羧酸盐型配位体的方法完成。（例如参看Lauffer，R.B.（1987）Chem.Rev.87∶901;Kornguth等人（1987）J.Neursurg.66∶898;Koenig等人（1986）Invest.Radiol.21∶697;Chacheris等人（1987）Inorg.Chem.26∶958;Loncin等人（1986）Inorg.Chem.25∶2646;Chang，C.A.和V.C.Sekher（1987）Inorg.Chem.26∶1981）。公知的体系全部是高度热力学稳定性但又是高度内部不稳定性的。另一方面，某些扩增的卟啉能与Gd（Ⅲ）形成稳定的配合物，而Gd（Ⅲ）却不与一般的卟啉形成稳定的配合物。结果他们提出了一种作为MRI造影剂的改进方式。Sessler等人的报告宣称在体外将texaphyrin形成了一种极稳定的Gd（Ⅲ）配合物（Sessler等人（1989）Inorg.Chem.28∶3390）。除了Gd（Ⅲ）以外，已有报告称将texaphyrin与多种过渡金属如Cd和Eu形成了配合物（Sessler，J.L.和A.K.Burrell（1992）Top.Cur.Chem.161∶177）。
本发明提供了适用于检测和/或治疗靶组织、细胞和病原体的新的吸收光的化合物。本发明还提供了制备新的扩增卟啉（卟菲花青）的新方法，该方法或是提高卟菲花青的产量或是大大简化合成工艺。由于它们在以高浓度存在于血液或其它组织内的组分的正常吸收之外的能量范围内吸收射线的能力，特别是卟啉残基与血红蛋白和肌红蛋白的正常结合，从而使这些化合物可以以较低的剂量给药。因而，通过提供这些具有更高活性波长的新的扩增的类卟啉化合物，照射治疗可以在这样的波长下进行，在该波长下，天然发色团不能与具有该活性化合物的光子竞争。这就导致了更大的光线穿透深度。这些化合物与非靶组织和细胞比较优先地保持在靶组织和细胞中。据此，使用放射性同位素或顺磁离子标记或与它们共轭时，卟菲花青和类卟菲花青化合物分别作为放射成象和磁共振成象的造影剂是特别有效的。此外，可获得的结合金属芯的稳定性的提高和可用于连接金属的更多数目的原子使卟菲花青和类卟菲花青化合物作为磁共振造影剂变得特别有效。本发明的卟菲花青和其它新的类卟菲花青化合物及其含有一种金属元素的共轭物的另一个优点，是当暴露于UV、可见射线和近红外射线时它们能够发光。因此，这些化合物对于检测损伤和肿瘤是特别有用的。这种发荧光的衍生物的集合在本文中被称做“卟菲花青”（Porpha-cyanine）和“类卟菲花青化合物。
卟菲花青的示例是式Ⅰ的化合物，其中R是一个非干扰的取代基，它包括但不限于以下物组：取代的和未取代的烷基、链烯基、炔基;取代的和未取代的芳基;烷基或芳基磺酰基;烷基或芳基氰基;卤素;氰基;硝基;氨基;羧基;烷酯基或其酯，酰胺或盐等等。
Figure 931207274_IMG5
按照一般的定义，本文所使用的羧基是-COOH，而烷酯基是-COOR，而烷酯基是-COOR，其中R是烷基（1-6C）。本文中使用的烷基是1-6个碳原子的饱和直链或支链的烃，例如甲基、乙基、2-甲戊基、t-丁基、n-丙基，等等。
芳基（6-10C）是用1-3个取代基任意取代的苯基，该取代基各自选自卤（氟、氯、溴或碘）、低级烷基（1-4C）或低级烷氧基（1-4C）。本文规定烷氧基是-OR，其中R是烷基。
芳基（6-10C）或烷基（1-6C）磺酰基部份的结构式为SO2R，其中如以上所规定的R是烷基或是芳基。
本发明的化合物还包括-COOH的盐、酯和酰胺。为了在体内使用，这些盐、酯和酰胺必须是药用许可的并且是无毒的;这种要求与体外使用无关。“盐、酯和酰胺”指的是由无机或有机碱，包括由药用许可的无毒无机和有机碱衍生的盐，还指的是由ROH或RNH2或R2NH的醇或伯胺或仲胺生成的烷基酯或酰胺（本文规定R是烷基）。适宜的无机碱包括钠、钾、锂、铵、钙以及镁的氢氧化物等等。特别优选的是钾盐和钠盐。药用许可的有机无毒碱包括伯、仲、叔和季胺、包括环状胺，以及碱性离子交换树脂。其实例包括异丙基胺、三甲基胺、乙醇胺、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡碱、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、聚胺树脂;等等。
盐衍生物通过用适宜量的药用许可碱处理游离酸而制备。反应可在脱水条件下或在水中单独地或与惰性的可与水混溶的有机溶剂相结合，并在约0℃-约100℃，较佳是在室温下，以本发明化合物对碱的适宜摩尔比的情况下进行。典型的惰性可与水混溶的有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、二恶烷式四氢呋喃。
可通过用酸进行酸化将盐衍生物再转化为它们的相应游离酸，所用酸较佳的是无机酸，例如盐酸、硫酸等，温度条件为约0℃-约50℃，较佳为室温。
上述酯通过用与所需酯相应的醇试剂使相应游离酸酯化而制备。这一反应在诸如三氟化硼、氯化氢、硫酸、P-甲苯磺酸等强酸存在的情况下进行。由于用于酯化反应的醇试剂在反应湿度下是液体，所以醇试剂可以是反应的溶剂。任选地是，反应可以在游离酸和醇试剂能溶于其中的惰性有机溶剂中进行，例如烃溶剂如己烷、异辛烷、癸烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯、;卤代烃溶剂如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷;或其它溶剂如二乙醚、二丁醚、二噁烷、四氢呋喃等等。反应进行的混度为约0℃至反应混合物的回流温度，在15℃-约35℃时较佳地是使用氯化氢。
产物用一般的方法分离，例如用水稀释该反应混合物，用水不混溶的惰性有机溶剂如二乙醚、苯、二氯甲烷等萃取所得的含水混合物，将萃取液合并，用水洗涤萃取液至中性，然后减压蒸发。
可替换的是，该烷基酯可按该技术领域公知的方法通过酯基转移作用而制备。在通过酯基转移作用制备酯时，较佳的是由低级酯变成高级酯，如例如由甲基酯到例如异戊基酯。但是通过使用显著过量的低级醇，也可将高级酯酯基转移成低级酯;因而例如通过使用显著过量的乙醇，经酯基转移作用可将己基酯转化成乙基酯。
在另一个替代方式中，可通过将游离酸的形态与适宜的重氮烷烃，例如二重氮甲烷，二重氮-n-己烷，或者二重氮-i-丙烷在低温下于对质子呈惰性的有机溶剂中反应而制备。
酰胺例如可用硫代烃氧基氯化物（thioxylchloride）活化羧酸的残基，再用适宜的胺处理而获得。
本发明中的靶细胞和组织的实例包括但不限于：肿瘤，包括血瘤，恶性骨髓，病毒感染的血细胞或骨髓，发育异常的细胞或组织，炎症或感染部位，增生层出组织如牛皮癣斑或乳头病毒侵蚀斑（疣）或新内膜增生侵蚀斑，血管增生如红痣和血管瘤，动脉粥样硬化斑，毛囊，自由病毒，细菌，原生动物门或其它的病原体寄生物。
另一方面，本发明涉及一种使用卟菲花青和/或类卟菲花青化合物使某些病毒、细菌、原生动物门和其它病原体寄生物失活的方法。本发明设想的目标病原体包括被膜病毒如人体细胞巨化病毒、Epstein-Barr病毒、Marek病带状病毒、人体带状单形病毒、水痘-带状疮疹病毒、Poxviridae族的成员、Hepadnaviri-dae族的成员如人体甲型肝炎病毒（HAV）、人体乙型肝炎病毒（HBV）和非甲非乙型肝炎病毒（包括人体丙型肝炎病毒）、Or-thomyxoviridae族的成员如甲型、乙型和丙型流感病毒、Retro-viridae族的成员如人体T细胞白血病病毒、人体免疫缺乏病毒、以及Flaviviridae族的成员如蜱媒脑炎病毒或黄热病病毒。
本发明设想的另一类病原体包括寄生虫，例如疟原虫属三日疟原虫，疟原虫属恶性疟，疟原虫属卵，疟原虫属间日疟虫以及锥体虫属Cruzi。
本发明还设想根除的细菌，包括杆菌属枯草杆菌，链球菌属faecadlis，假单胞菌属Spp.，分枝杆菌属Spp.，以及其它的通过光中发荧光的激活作用可治疗的合适的生物体。
此外，可将本发明的卟菲花青和类卟菲花青化合物可与靶特异性部份（Tsm）共轭，该Tsm例如免疫球蛋白，包括多克隆和单克隆抗体及其片段，H2-兴奋剂，类固醇，包括雌激素和睾丸激素，糖类例如甘露糖，以及酞例如T-细胞受体和α-β杂二聚体。卟菲花青和类卟菲花青化合物与Tsms的共轭可以促进它们在所要求的靶组织中聚缩。
因而在一方面，本发明涉及一种式为Tsm-L-Pc的共轭物，这里Tsm代表靶特异性部份如免疫球蛋白或激素，Pc代表在400-850nm范围内具有最大吸收的卟菲花青衍生物，而L代表或是连接这些组成的共价键或是与该Tsm和Pc各共价结合的连接部分。
较佳的是，Pc选自以下物组：使用环化一、二和低吡咯前体以得到含
Figure 931207274_IMG6
大环的方法所获得的卟菲花青和类卟菲花青衍生物。
另一方面，本发明涉及在UV、可见光或近红外光存在的条件下，或是单独的，或是以上述共轭物的形式使用卟菲花青和类卟菲花青化合物对靶细胞的胞毒性起有效作用的方法。
再一个方面，本发明涉及使用卟菲花青和类卟菲花青化合物或其共轭物检测患病组织的方法。本发明的卟菲花青和类卟菲花青化合物可用放射成象（闪烁照相法成象）的放射性同位素或磁共振成象增强剂标记，或者与它们二者共轭，以用作诊断性成象剂。可用来标记卟菲花青和类卟菲花青化合物的放射性同位素实例包括碘-123，碘-131，锝-99m，铟-111和镓-67。当与卟菲花青和类卟菲花青化合物共轭时，可用于MRI成象增强剂的化合物实例包括多种元素如Gd、Mn、Eu、Dy、Pr、Pa、Cr、Co、Fe、Cu、Ni、Ti和v的顺磁离子。
另一个方面，本发明涉及含有这些活性组份的共用组合物。
图1示出了式Ⅰ卟菲花青的结构。
图2说明合成式Ⅰ卟菲花青的一种方法。
图3说明合成式Ⅰ卟菲花青的另一种方法。
图4说明合成式Ⅰ卟菲花青的方法。
图5a，5b，5c，5d示出了本发明类卟菲花青化合物的结构。
图6示出了本发明另一种类卟菲花青化合物的结构。
图7示出了本发明又一种类卟菲花青化合物的结构。
图8示出了本发明再一种类卟菲花青化合物的结构。
图9说明当在456nm被激发时，式Ⅰ卟菲花青的游离碱的放射波长。
图10说明当在456nm被激发时，质子化的式Ⅰ卟菲花青的放射波长。
图11说明合成式Ⅰ卟菲花青的新方法。
图12说明合成式Ⅰ卟菲花青的新的简化方法。
图13说明合成本发明的在两个桥碳原子上含有饱和或未饱和苯基的卟菲花青的新方法。
图14说明合成本发明的在两个桥碳原子之一上含有饱和或未饱和苯基的不对称卟菲花青的新方法。
实践本发明卟菲花青和类卟菲花青化合物的方式
本发明的全部组合物使用作为吸光化合物的新扩增的类卟啉大环衍生物，即卟菲花青和类卟菲花青化合物，它们在400-850nm范围内具有最大的吸光值。卟菲花青和类卟菲花青化合物是大环化合物，其中已知的多吡咯大环的至少一个桥被
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代替。这种化合物核的典型实例示于图1和5-8。
可用于本发明的卟菲花青的具体的制备是通过在冰醋酸中将四乙酸铅加入2-苄氧基羰基-3，4-二乙基-5-甲基吡咯中而完成的。加入乙二醇以减少某些残留的Pb（Ⅳ）。加入水并过滤收集5-乙氧基甲基-2-苄氧基羰基-3，4-二乙基吡咯（图3中化合物A）并用附加的水洗涤。将该5-乙氧基甲基-2-苄氧基羰基-3，4-二乙基吡咯加入乙酸水溶液并加热。当将上述溶液冷却至室温时，以大块形式沉淀出固态产物。加水过滤收集该产物，然后用另外的水洗涤。用CH2Cl2萃取滤液，然后蒸发以生成固体产物。将固态产物合并，然后自CH2Cl2和己烷溶液中再结晶。
在氢气氛下并且存在有Pd/c和三乙胺的情况下搅拌5，5′-双（苄氧基羰基）-3，3′-4，4′-四乙基-2，2′-二吡咯甲烷（图3的化合物B）在四氢呋喃（THF）中的溶液。通过硅藻土将催化剂过滤后，将滤液蒸发至干燥得到二羧酸。将二羧酸溶于N，N-二甲基甲酰胺并在氩气氛下加热至沸腾。冷却该溶液并将过量的冷却的苯甲酰氯加入双-α-游离的二吡咯甲烷（化合物B）。搅拌该反应混合物并过滤收集固态产物。将该固态产物加入水中，用NaHCO3碱化并加热至60℃。淡黄色产物由该溶液中结晶，再过滤并用水洗涤。
将3，3′，4，4′-四乙基-5，5′-二甲酰基-2，2′-二吡咯甲烷（图3化合物C）的乙醇溶液用氩气鼓泡，然后加入盐酸胲和乙酸钠。在氩气下加热这种化合物，然后去除溶剂并将产物在试管中干燥过夜。将该双肟溶于乙酐并用氩气饱和。在去除乙酐并真空干燥后，获得一种黑色固体的粗制双腈产物（图3化合物D）。将该产物用0.5%甲醇的CH2Cl2溶液经硅胶柱纯化，继而用10-20%EtOAc经氧化铝柱纯化。蒸发溶剂产生淡桃红色结晶形态的3，3′-4，4′-四乙基-5，5′-氰基二吡咯甲烷。
在一个实施方案中（图3），再将该3，3′-4，4′-四乙基-5，5′-氰基二吡咯甲烷溶于THF并加入到LiAlH4的THF悬浮液中。搅拌所得混合物并加入水。形成固态产物并将其过滤出来。经真空干燥蒸发溶剂后获得双胺产物。将该双胺溶于无水甲醇并加入双醛。用氮气使该溶液鼓泡并引至回流。加入硫氰酸铅（Pb（SCN2）），并使溶液回流。在室温下用氧气通过溶液鼓泡。蒸发溶剂后，将粗制的卟菲花青产物真空干燥。用乙酸乙酯的CH2Cl2溶液经Al2O3柱纯化该产物。收集绿色的洗脱液并浓缩。蒸发溶剂后获得卟菲花青大环化合物晶体。
在一个可替换的实施方案中，将3，3′-4，4′-四乙基-5，5′-氰基二吡咯甲烷的无水THF溶液于0℃的氮气氛中加入LiAlH4的THF悬浮液。搅拌该混合物并加入水以急冷该反应并将沉淀过滤出来。将该金色溶液移至盛有等摩尔份额Pb（SCN）2和无水硫酸钠的两颈烧瓶中。加入无水甲醇并将溶液引至回流。颜色逐步由红紫改变成深绿。中止反应并通过溶液用空气缓慢鼓泡。将该粗制产物溶于二氯甲烷并过滤出固体。将绿色溶液的体积减至近似5ml，然后装在氧化铝柱上并用乙酸乙酯的CH2Cl2溶液洗脱。收集嫩绿色的含有卟菲花青的洗脱液并蒸发至干燥。
在另一个替代实施方案中（图4），通过如图4所示使酰胺键预形成和脱水形成单一的连接基“
Figure 931207274_IMG8
”。
从而获得了图1式Ⅰ所示的化合物，其中R可分别是取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基;取代的或未被取代的芳基;烷基或芳基磺酰基;烷基或芳基氰基;卤素;氰基;硝基;氨基;羧基;烷酯基或其酯，酰胺或盐，等等。
在一种制备式Ⅰ卟菲花青的新方法中（图11），于0℃氮气氛下将3，3′-4，4′-四乙基-5，5′-氰基二吡咯甲烷的无水THF溶液加入LiAlH4的THF悬浮液中。搅拌该混合物，并加水急冷该反应再过滤出沉淀。在0℃气气氛下将10倍过量的在THF/CH2Cl2悬浮液中的2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（DDQ）加入3，3′-4，4′-四乙基-5，5′-双氨甲基-2，2′-二吡咯甲烷的无水THF/CH2Cl2溶液。该溶液立即变为深绿色。将该粗制产物溶于二氯甲烷并过滤出固体。将该绿色溶液的体积减至近似5ml然后装在氧化铝柱上并用乙酸乙酯的CH2Cl2溶液洗脱。收集含卟菲花青的嫩绿色洗脱液并蒸发至干燥。与通过空气氧化获得的产量相比，由这种合成工艺使产量显著提高（48%）。
在制备式Ⅰ卟菲花青的另一种新方法中（图12），将3，3′-4，4′-四乙基-5，5′-双氨甲基-2，2′-吡咯甲烷悬浮于无水EtOH。在0℃下冷却所得的乙醇溶液，并使氨气通过其鼓泡。将烧瓶置于60℃的油浴中72小时。中止反应并在0℃冷却。在旋转蒸发器（roto-Vap）上去除乙醇，残留物用二氯甲烷在中性氧化铝上色谱分离。这种极大简化的合成工艺产出20%或4.6mg八乙基卟菲花青。通过DDQ由更大极性组分的氧化获得另外的1.5mg产物。
在另外的再一个实施方案中，通过图13所示的反应图制备了在两个桥碳原子的每一个上含有一苯基的卟菲花青。从而获得了图13所示的化合物，其中每个X可分别是取代或未被取代的烷基，链烯基，炔基，取代或未被取代的芳基;烷基或芳基磺酰基;烷基或芳基氰基;卤素;氰基;硝基;氨基;羧基;烷酯基或其酯，酰胺或盐，等等。
在另外的又一个实施方案中，通过图14所示的反应图制备了在两个桥碳原子之一上含有一苯基的卟菲花青。
靶特异性部分
卟菲花青和类卟菲花青化合物特别可单独用作瞄准剂，此时它们专门定位到某些患病的组织和细胞，例如肿瘤。这种瞄准能力可通过将卟菲花青偶合到某个专门与位于该组织或细胞表面上的抗原决定基或受体连接的部位而得到加强。因而本发明的靶特异性部份包括类固醇如雌激素和睾丸激素和其衍生物，含有T-细胞受体或α-β杂二聚物的肽，糖类如甘露糖，由于它们单核细胞和巨噬细胞具有受体和H2兴奋剂。
包括有本发明共轭物组分的靶特异性部份也可由免疫特性组份组成。Tsm可由多克隆或单克隆抗体的制备物衍生，并可包含完整的抗体或这些抗体的免疫反应性片段，例如（F（ab1）2、Fab、或Fab′片段。将这种免疫反应性片段用作整个抗体的取代物在该技术领域中是众所周知的。例如参看Spiegelberg，H.L.，Immunoassays in the Clinical Laboratory（1978）3∶1-23。
多克隆抗血清以一般方法制备，即将抗原注射到需要抗体的适宜哺乳动物中而制备，检测血清中相对抗原的抗体含量，并且当滴定度高时制备抗血清。单克隆抗体制剂也可通过惯用的例如Koehler和Milstein的方法制备，即使用取自免疫接种过的动物的周边血淋巴细胞或脾细胞，并或是通过病毒感染、通过与骨髓瘤融合，或是通过其它惯用方法使这些细胞胚质不灭，并以分离的菌落筛选产生的所需抗体。由或是单克隆或是多克隆制剂形成片段则通过Spiegelberg，H.L.，Supra所述的惯用方法完成。
本文所示例的特别有效的抗体包括可由Malcolm等人所述方法制备的单克隆抗体制剂CAMAL-1（Ex.Hematol.（1984）12∶539-547;由Mew等人所述的抗M1抗体的多克隆或单克隆制剂（J.Immunol.（1983）130∶1473-1477），以及由Maier等人（J.Immunol.（1983）131∶1843）和Steele等人（Cell  Im-munol.（1984）90∶303）所述方法制备的B16G抗体。
以上所列是举例而显然不是限制;一旦知道了靶组织，就可通过惯用的方法制备对该组织有特异性的抗体。因而本发明可用于产生对抗某些所针对的靶的毒性。
键合
本发明中靶特异性部份与卟菲花青的共轭可通过任何惯用的方法实现，并且要求至少一个R1-R8含有一个羧基。这些部份之间的直接共价键例如可使用脱水剂如碳化二亚胺而实现，在该情况下L代表共价键。将卟菲花青共价键合到靶特性部份上的特别优选的方法是，在基本由二甲亚砜（DMSO）组成的反应介质存在的情况下用1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDCI）处理。使用这种优选步骤的制剂在下文实施例5中说明。
当然，除了惯用的含水和部份含水介质外，其它的脱水剂如二环己基碳化二亚胺或二乙基碳化二亚胺也能被使用。
共轭物的各活性部份也可通过连接化合物而被共轭，该连接化合物是双官能的，并能够共价键合两种活性组份的每一个。这些连接物的大多种类可市售购得，典型的清单可包括例如由Pierce  Chtmical  Co.的目录中查到的连接物。这些连接物或是高双官能的部份或是杂双官能的部份，并包括能够形成二硫化物、酰胺、腙，以及广泛多种其它键的官能度。
其它的连接物包括诸如聚胺，聚醚，聚胺醇的聚合物，它们借助于酮，酸，醛，异氰酸盐或多种其它基团而被衍生成各个组分。
在使共轭物的各活性部份共轭时所使用的技术包括任何标准的方法，而共轭方法并不构成本发明的一部份。从而该技术领域中的任何生产这些共轭物的公知有效技术落入本发明的范围中，并且据此连接物部份被大范围地限定为或是共价键，或是在该技术领域中使用标准方法可得到的或可由此衍生的连接物部份。
给药和使用
使用该技术领域中通常公知的技术，将卟菲花青或其共轭物配制进药用组合物中用于对患者给药。这些药用组合物的说明例如可在REMINGTON′S  PHARMACEUTICAL  SCIENCES中查到（Mack  Publishing  Co.，Easton，Pennsylvania，latest  deition）。
本发明的卟菲花青，类卟菲花青化合物及其共轭物一般应全身地，特别是通过注射给药。注射可以是静脉注射，皮下注射，肌肉内注射，或者甚至是腹膜内注射。注射剂可以惯用的形式制备，或是以液态溶液或悬浮液的形式，即在注射前适于溶解或悬浮于液体中的固态形式，或是乳剂的形式。适宜的赋形剂例如是水、盐水、葡萄糖、甘油等。当然，这些组合物还可含少量的无毒的辅助物质例如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂等等。
全身给药也可通过引入缓释或持续释放系统，以栓剂或如果适当配制以口服形式实现。这些给药方式的配方在该技术领域中是众所周知的，并且这些方法的说明例如可由REMING-TON′S  PHARMACEUTICAL  SCIENCES（Supra）中查到。
如果治疗点是已被定位的，例如对于治疗外层肿瘤或皮肤缺陷，那么卟菲花青，类卟菲花青化合物及其活性共轭物可使用标准的外用组合物，包括洗液、悬浮液、药膏或乳脂进行局部给药。
共轭物或卟菲花青衍生物的给药量取决于所选择的活性成份、待治疗的病况、给药方式、各个患者，以及专业医生的判断。按照制剂的特性，可需要较少或较大的剂量。对于全身给药而言，推荐的剂量范围是约0.05-10mg/kg。对于外用给药，推荐的活性成份浓度为约0.01-20%，较佳为1-5%范围内的剂量。口服给药所建议的总的日剂量范围为约10-30mg。上述的范围仅仅是推荐性的，这是由于对于各个治疗规程而言变量的数目是大的，并且预计会与这些推荐值产生可观的偏离。
本发明的放射成象（闪烁照相成象）法是通过向个体肠胃外注射有效量的卟菲花青放射成象剂来进行。肠胃外是指，如静脉内、动脉内、鞘内、脉间或腔内。值得注意的是，个体的接受剂量为约1mCi-50mCi放射成象剂，该量随具体的放射性同位素种类和给药方式而变。对静脉内注射而言，该量通常为：约10-40mCi，较佳约20mCi的Tc-99m;约2-5mCi，较佳约4mCi的In-111或Ga-67。
放射成象剂通常作为一种可注射制剂，较佳为一种用于人体的无菌可注射剂来给用，用此试剂标定病态组织或细胞，其较佳包含：在可药用无菌注射载体（较佳为生理pH和生理浓度下的磷酸盐缓冲盐水（PBS））中含有效量放射性标记试剂的无菌可注射溶液。可根据肠胃外给药部位的要求而使用其它可药用载体。
本发明的肠胃外给药的代表性制剂通常是在无菌溶液中含约0.1-20mg，较佳约2mg的放射性标记的试剂。
一旦有足够的同位素沉积在靶位，便可或用常规的平面和/或SPECTγ照相机或使用用于外部或内部的手持式γ相机进行扫描以确定炎症或损伤的部位。闪烁图通常由能量在50-500Kev范围的具有一个或多个检测窗口的γ成象照相机拍出。
磁共振成象（MRI）以类似于放射成象的方法进行，不同的是该成象剂将含MRI强化物质而非放射性同位素。应当注意，磁共振现象以不同于放射成象的规则操作。通常，产生的信号与待成象区域中水分子的氢原子核中质子磁矩的松弛时间有关。磁共振成象强化剂的作用是提高松弛速率，从而提高了该成象剂富积区域中的水分子与体内其它部位的水分子间的对比。然而，该试剂的作用是同时提高T1和T2，前者产生较高的对比度，而后者产生较低的对比度。相应地，此现象是浓度决定的，且通常存在使顺磁物质获得最大效用的最佳浓度。该最佳浓度随下列因素而变：所用的具体试剂、成象的部位、成象的方式（即：自旋回声、饱和回复、转化回复以及其它各种强烈依赖T1或T2的成象技术）、以及该试剂溶解或悬浮所在的介质的组成。这些因素及与其相关的重要性是本领域已知的。如见：Pykett，Scientific American（1982）246∶78，和Runge等的Am.J.Radiol.（1987）141∶1209。
通过向个体肠胃外注射有效量的含有与（诸如钆的）金属元素偶合的本发明范围的卟菲花青或类卟菲花青化合物的MRI造影剂来实行本发明的MRI法。应当注意，一个个体所接受的造影剂剂量应足以在靶位将MRI信号强化至少约20%，较佳约50-500%，该量随具体的顺磁物质及给药方式的不同而变。
同样，本发明的造影剂通常作为一种可注射制剂，且较佳为一种用于人体的无菌注射制剂来给用，以将MIR试剂对准病态的组织或细胞，其较佳含有：在可药用无菌注射载体中（较佳是在磷酸盐缓冲盐水中）含有效量造影剂的无菌可注射溶液。可根据肠胃外给药部位的要求使用其它用于肠胃外给药的常规的可药用载体。
本发明的肠胃外给药的代表性制剂通常是在无菌溶液中含约0.1-20mg，较佳约2mg的造影剂。
实施例
下面的实施例意欲解释本发明而不欲限定其范围。
实施例1
卟菲花青的合成  图2
将乙酸高铅（18.2g，0.041mol）加至2-苄氧羰基-3，4-二乙基-5-甲基吡咯（10.1g，0.037mol）于60ml冰醋酸中的被搅拌溶液中。使该混合物快热至60℃。加入10毫升乙二醇还原所有残存Pb（Ⅳ）。加入20毫升水并过滤收集5-乙氧甲基-2-苄氧羰基-3，4-二乙基吡咯（图2中化合物A）再加水洗涤。将5-乙氧甲基-2-苄氧羰基-3，4-二乙基吡咯加至于100ml水中的80%乙酸溶液中并在100℃加热1小时。当上述溶液冷至室温时，沉淀出大块固体产物。加入100ml水并过滤收集产物然后用另加的水洗涤。用CH2Cl2萃取滤液而后蒸发生成固体产物。将固体产物合并，然后自CH2Cl2与己烷的溶液中再结晶。
产量：6.6g，67.4%
C33H38O4N2的摩尔重量计算值：526.2831
高分辨MS：526.2835
CDCl3中1H NMR：1.05（t，6H），1.12（t，6H），2.43（q，4H），2.75（q，4H），3.85（s，2H），5.25（s，4H），7.28-7.40（m，10H），8.70（brs，2H）。
在大气压力和室温并有0.4g  10%Pd/C和5滴三乙胺存在条件下，将5，5′-双（苄氧羰基）-3，3′-4，4′-四乙基-2，2′-二吡咯甲烷（图2中化合物B）（8.1g，0.015mol）于200ml四氢呋喃（THF）中的溶液在氢气下搅拌过夜。将催化剂通过硅藻土过滤之后，将滤液于旋转蒸发器上蒸干，得二羧酸。将该二羧酸溶于100ml N，N-二甲基甲酰胺并在氩气下加热至沸点一个半小时。然后于冰上骤冷该溶液并向双-α-游离二吡咯甲烷（bis-x-free dipyrromethane）（化合物B）滴加过量骤冷的苯甲酰氯（7.2ml）。在5℃下搅拌该反应混合物2小时并过滤收集固体产物。将该固体产物加至50ml水中并用NaHCO3碱化。加热该溶液并于60℃保持1小时。将自该溶液结晶出的淡黄色产物过滤而后用水洗涤。
产量：3.4g，70.0%
C19H26N2O2的摩尔重量计算值：314.1994。
高分辨MS：314.1994
CDCl3中1H NMR：1.10（t，6H），1.25（t，6H），2.50（q，4H），2.70（q，4H），4.00（s，2H），9.55（s，2H），10.90（s，2H）。
将3，3′，4，4′-四乙基-5，5′-二甲酰-2，2′-二吡咯甲烷（图2的化合物C）（1.03g，0.0033mol）于300ml乙醇中的溶液用氩气鼓泡20分钟。加入盐酸胲（0.51g，0.0073mol）和乙酸钠（1.20g，0.015mol）。在氩气下将此混合物于60℃加热两个半小时。在旋转蒸发器上去除溶剂并在真空下使产物干燥过夜。将双肟溶于5ml乙酐并用氩饱和30分钟。去除乙酐后获得呈黑色固体的粗双腈产物（图2的化合物D）并将其于真空下干燥过夜。以用0.5%甲醇的CH2Cl2溶液的硅胶柱（40g）并随后以用10-20%EtOAc的氧化铝柱将产物提纯。蒸发溶剂产出淡粉红色晶体。
产量：0.43g，42%
C19H24N4的摩尔重量计算值：308.2001
高分辨MS：308.2002。
CDCl3中H NMR：1.10（t，6H），1.25（t，6H），2.45（q，4H），2.60（q，4H），3.90（s，2H），8.45（s，2H）。
将3，3′，4，4′-四乙基-5，5′-氰基二吡咯甲烷（0.053g，1.7×10-4mol）溶于10ml无水THF并在N2和0℃下滴加至LiAlH4（0.050g，1.5×10-3mol）的THF悬浮液中。将所得混合物搅拌30分钟并加入两滴水。形成的固体产物被滤除。通过在真空下干燥过夜而蒸发溶剂之后得双胺产物。将该双胺溶于50ml无水甲醇并加入双醛（0.050g，1.6×10-4mol）。对该溶液用N2鼓泡20分钟并使之在N2下回流。加入硫氰酸铅（Pb（SCN2））（0.055g，1.7×10-4mol）并回流该溶液4小时。在室温下整夜通过该溶液用氧气鼓泡。蒸发溶剂之后，使粗制卟菲花青产物于真空下干燥过夜。用采用10%乙酸乙酯的CH2Cl2溶液的Al2O3柱（加入4%水）将产物提纯。收集绿色洗脱液于旋转蒸发器上浓缩之。溶剂蒸发之后获得卟菲花青大环晶体。
产量：19.3g，19.1%大环化合物
C38H48N6的摩尔重量计算值：588.3941
高分辨MS：588.3933
1H NMR（300MHz，CDCl3），-4.50（bs，2H），2.05（t，12H），2.13（t，12H），4.28（q，8H），4.40（q，8H），10.50（s，2H），13.0（s，4H）。
CH2Cl2中UV/VIS，455，592，800nm。
实施例2
卟菲花青的合成，图3
按照实施例1的方法制备3，3′-4，4′-四乙基-5，5′-氰基二吡咯甲烷。在N2和0℃下将0.102g的3.3×10-4mol的3，3′-4，4′-四乙基-5，5′-氰基二吡咯甲烷于10ml无水THF中的溶液缓慢加至20mlLiAlH4的THF悬浮液中。搅拌该混合物30分钟并加入两滴水中止该反应。滤除沉淀物。将金黄色溶液转至盛有等摩尔量Pb（SCN）2和无水硫酸钠的两颈烧瓶中。加入15ml无水甲醇并使该混合物回流。该溶液的颜色由紫红色逐渐变为暗绿色。四个半小时后中止反应并整夜将空气缓慢鼓泡通过溶液。将粗产物溶于二氯甲烷并滤除固体。绿色溶液的体积减至大约5ml，再将其充在氧化铝柱（120g，加入4%水）上，并用10%乙酸乙酯的CH2Cl2溶液洗脱。收集到2升含卟菲花青的亮绿色洗脱液并将其蒸干。
产量：23.4mg，24.1%
本化合物的光谱数据与上面实施例1中制备的化合物的相同。
实施例3
卟菲花青的体外毒性
将细胞在无血清培养基（DME）中洗涤三次，计数并制成107细胞/ml的浓度。
为做“亲合性”测试，在暗处将100μl该细胞悬浮液与100μl该试验或对比化合物混合。在4℃下使“标记”持续1小时，并在暗处每次用3ml培养基将标记的细胞洗涤三次后再悬浮于新鲜培养基中。然后使再悬浮的细胞经受300-850nm光照30分钟。
“直接”测试时，一加入试验或对比化合物就立即照射细胞。采用适合于靶细胞的方法估价照射的效果。
当用人体红细胞（RBCs）作为试验细胞时，可目测估价由照射对比物（血卟淋，Hp）标记的和卟菲花青（式Ⅰ）标记的细胞引起的溶血。
当使用鼠体肥大细胞瘤细胞系P815时，其结果如下述方法确定：
采用浓度为10-50ng/ml的Hp作为对比物和式Ⅰ的卟菲花青作为试验物质如上所述来标记细胞。用300-850nm光处理再悬浮细胞30分钟并通过用曙红-Y排除法（区别活细胞和死细胞的标准方法）直接计数来评估生存力的结果。
在如上所述进行的其它测定中，通过按照标准方法将细胞在10μCi/ml的氚标记胸苷中培养18小时来测试从光照中重获的细胞的生存力，在此视胸苷的掺入为生存力。收获细胞并用闪烁计数器测量放射性的摄入。
实施例4
卟菲花青的选择结合
如实施例3所述用1-200ng/ml的Hp或式Ⅰ的卟菲花青培养P815细胞。将该细胞于暗处标记30分钟，洗除未吸收的卟啉，再悬浮，然后曝光于300-850nm光线下经历另外30分钟。在用30μCi/ml氚化胸苷标记并于37℃培养18小时之后，根据氚化胸苷的掺入来确定细胞的生存力。
实施例5
免疫共轭物的制备
这一实施例描述了或用血卟啉（Hp）或用式Ⅰ的卟菲花青（Pc）来制备四种不同抗体制剂的免疫共轭物的方法。所采用的抗体为如上文所述制备的全部CAMAL-1，抗-M1抗体和B16G抗体，以及亲合提纯的兔抗-鼠Ig（RxMIg）。需要对比物时还另外使用提纯的不相关单克隆制剂（C-MAb）。
基本上如Mew等人所述的方法（J.Immunol（1983）130∶1473）来进行一种共轭物的制备。简言之，向220mg  Hp.0.2HCl（Sigma  Chemical  Co.，St.Louis，Mo）于25ml水和0.8mlN，N-二甲基甲酰胺中的溶液加入20mg于0.6ml水中的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳化二亚胺HCl（EDCI）。30分钟后，使此溶液与15mg溶于5ml蒸馏水的抗体蛋白混合并培养5小时。在此期间，监测该溶液的pH并将其调节在6-7之间。然后加入50μl-乙醇胺，并使该溶液于室温下静置过夜。使该溶液对0.001M  pH7.4的磷酸盐缓冲液渗析四天，每昼夜换三次PBS。类似地制备卟菲花青共轭物。
在一较佳方案中，制备2ml于DMSO中含Hp或Pc和脱水剂各5mg的分散液并将其在室温和氮气下搅拌30分钟。向其中加入于2ml  DMSO中含2mg适当免疫球蛋白的分散液，并另外搅拌所得混合物10分钟。然后通过加入5倍体积的含50μl-乙醇胺的PBS，在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释来检测该混合物，再经三次洗换而使其对PBS渗析。
另一方案是，制备2ml含Hp或Pc、连接剂和脱水剂各5mg的分散液并于室温和氮气下将其搅拌近15分钟。然后向其中加入于2ml四氢呋喃中含约2mg免疫特性蛋白的分散液并将所得混合物另外搅拌10分钟。再如上所述来检测该混合物。
上述方法适合于CAMAL-1及前面列出的其余抗体的制剂。
此外，下面的制剂专门用B16G和RαMIg制成：
B16G
在氮气和室温下将11mg血卟啉加11mgEDCI在4ml光谱级DMSO中搅拌30分钟，而后加入于20ml  DMSO中的20mg冻干的B16G抗体（如Maier等在J.Immunol.（1983）131∶1843中所述方法制备）。将所得混合物在室温下搅拌40秒并进行如上所述的检测。该所得产物含近似375μgHp/mg  B16G。以Pc代替Hp进行类似的步骤。
RαMIg
如上所述在氮气和室温下将400μg  EDCI和400μg血卟啉在1ml  DMSO中搅拌30分钟，而后加入800μg于1ml  DMSO中的冻干的RαMIg抗体（如Mew等所述方法制备，J.Immunol.（1983）130∶1473）。将所得混合物搅拌30秒并进行如上所述的检测，获得产物含200μg  Hp/mg  RαMIg。以Pc代替Hp进行类似的步骤。
实施例6
免疫共轭物的体外特异性
伴随适当的对比，通过将共轭物与过当类型的细胞混合，并使标记的细胞接受照射来测试Tsm-Hp和Tsm-Pc共轭物（其中的Tsm由免疫球蛋白组成）对离体细胞的作用。。对CAMAL-1和Anti-M1而言，进行这一测试的步骤分别在Mew等人在Cancer  Research（1985）中和Mew等人在J.Immunol（1983）中的文章中做了详细描述，上面引用的两篇文献均结合入本文参考。
简单地说，对CAMAL-1来说，如上面实施例4所述，用适当的Tsm-Hp或Tsm-Pc制剂来标记三个细胞系WC4，WC6和WC2（WC4和WC6产生CAMAL抗原，而WC2则不）。将各含106细胞的标记的细胞制剂引入Rose室接受630nm激光的光活化。然后顺序记录各种制剂的结果。
对抗M1共轭物来说，用M1肿瘤细胞作为靶细胞并用Tsm-Hp，Tsm-Pc共轭物，或单独的药物或抗体，或抗体与药物的结合体（但未偶合）通过在37℃下于6%CO2增湿的培养器中培养2小时来对其处理。将细胞在PBS中洗涤三遍然后装入平皿并整夜曝露于荧光下。如上所述以氚化胸苷的摄入来评定细胞的生存力。
对B16G共轭物，用A10、P815和L1210细胞作为靶细胞。（A10细胞为分泌B16G-反应性T-抑制因子的T-细胞杂种细胞瘤;P815细胞也有与B16G的反应性）。使用用B16G-Hp或B16G-Pc共轭物的直接法或间接使用未标记B16G抗体及标记的RαMIg-Hp或RαMIg-Pc进行了离体研究。
在直接法中，当以320、160、80、40和20ng药物/ml的Hp或Pc浓度试验或对比时，将5×105细胞悬浮在1ml含适当Tsm-药物共轭物的DME/Hepes中。使该细胞在37℃下于暗处培养1小时，然后在5ml DME/HePes中洗三次，接着在1ml相同缓冲液中再悬浮。将三份100ml的试验分额的标记的制剂分散在平底微量滴定阱中并使剩余的细胞悬浮液（700μl）曝光于20cm远的白炽灯光（22.5mW/cm2）下1小时。然后将另三份100μl等分样移至微量滴定阱。再向所有含100μl等分样的微量滴定阱中加入稀释于DME/Hepes的含20%FCS的氚标记胸苷，使得各阱中加入2μCi标记的胸苷。将培养物在37℃和增湿的10%CO2下培养18小时然后于MASH收获机上收获。用Hp闪烁计数器（Tri-Carb Model 4550）测量胸苷的掺入。
在间接测试中，将如上所述而制备的A10悬浮的细胞在4℃下与50μg/ml或B16G或对比抗体C-MAb接触30分钟，在DME/Hepes中洗涤，然后在4℃下于暗处与在2μg/ml-15ng/ml  Hp或Pc范围的不同浓度的RαMIg-Hp或RαMIg-Pc接触。如上所述用标记的胸苷的摄入来评定细胞的生存力。
实施例7
卟菲花青及其共轭物的体内细胞毒性
对卟菲花青（Pc）及其共轭物的体内效能也进行评定。关于CAMAL-1和抗-M1共轭物的方法如上面实施例6中引用的Mew等人的两篇文献中所述。关于B16G-Hp和B16G-Pc共轭物以及单独用Pc（式Ⅰ）的体内研究进行如下：
体内试验基于肿瘤上T-抑制因子细胞群体的间接作用，该细胞然后用作评估照射处理效果的试剂。在同基因DBA/2小鼠中生长的P815肥大细胞瘤细胞刺激对肿瘤有特异性的T-抑制因子细胞。这些T-抑制细胞阻抗特异性T-杀伤细胞的发育，换句话说，这些杀伤细胞会有助于肿瘤的退化。上面称为A10的T-细胞杂种瘤分泌与这些T-抑制细胞相联合的T-抑制因子。因此，通过与其中Tsm为细胞表面上对T-抑制因子有特异性的抗体（即B16G）的共轭物反应而选择性杀伤这些T-抑制因子细胞群体，便会在带有P815肿瘤的小鼠体内造成肿瘤的退化。
因此，在这一测试中，向DBA/2小鼠的右胁部位皮下注射104P815细胞以掺入肿瘤。第8天，当肿瘤可触觉（约25-42mm2）时，将小鼠随机分成8组并分别静脉注射150μl PBS及各含Hp或Pc、B16G-Hp或B15G-Pc、B16G加任一药物、单独B16G或C-MAb-Hp或C-MAb-Pc的150μl PBS。在所有情况下每只动物Hp含量为50μg且在所有（适宜）情况下每只动物含B16G 310μg。
将这些动物于暗处放置2小时后曝露于300-850nm和22.5mW/cm2的强光下。随后对这些动物每日进行正常处置和监测。
实施例8
诊断成象
一位32岁的女性患者发烧且腹痛。对该患者持续一星期疗程的抗菌素治疗未见效。CAT扫描没能证明有任何异常结块。用Tc-99m-标记的卟菲花青进行放射成象研究。使用20mCi放射标记卟菲花青注射剂并用γ-相机以SPECT方式对患者扫描。患者腹部的扫描显示有Tc-99m聚积的焦点。进行外科手术，在该Tc-99m活性部位发现一脓肿。
实施例9
卟菲花青的合成，图11
按照实施例1的方法制备3，3′-4，4′-四乙基-5，5′-氰基二吡咯甲烷。将过量10倍的2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（DDQ）加到10ml无水THF中的69mg  3，3′-4，4′-四乙基-5，5′-氰基二吡咯甲烷中。所得溶液立即变为暗绿色。按照实施例2的方法色谱分析残留物。与空气氧化比较，获得的产量明显提高。
产量：32mg，48%
这一化合物的光谱数据与上面实施例1中所制备化合物的等同。
实施例10
卟菲花青的合成，简化法
在合成卟菲花青的另一方法中，按实施例1的方法制备二醛。将25mg  3，3′，4，4′-四乙基-5，5′-二甲酰-2，2′-二吡咯甲烷悬浮于30ml无水EtOH中。在0℃骤冷所得乙醇溶液并用氨气通过该溶液鼓泡30分钟。然后取下气体入口管并将烧瓶在60℃油浴中放置72小时。停止反应并于0℃冷却。在旋转蒸发器上去除乙醇并在中性氧化铝（加4%H2O）上用二氯甲烷色谱分析残留物。
产量：4.6mg，20%
此化合物的光谱数据与上面实施例1中所制备化合物的数据等同。用DDQ氧化更极性的组分，获得另外1.5mg产物。

Claims (16)

1、一种式Ⅰ的卟菲花青(Porphacyanine)：
Figure 931207274_IMG1
其中R1-R8各为独立的非干扰取代基且R9和R10各为独立的-H或
其中各X为独立的非干扰取代基。
2、权利要求1的化合物，其中R1-R8及X各自独立地选自以下物组：-H、取代或未取代的烷基、链烯基、炔基;取代或未取代的芳基;烷基或芳基磺酰基;烷基或芳基氰基;卤素;氰基;硝基;氨基;羧基;烷酯基以及它们的酯、酰胺和盐。
3、权利要求1或2的化合物，其中R9和R10为H。
4、权利要求1或2的化合物，其中R9和R10之一个为H而另一个为
或其中R9和R10都为
Figure 931207274_IMG4
5、权利要求1-4之任一项的化合物，其中R1-R8各自独立为乙基或H。
6、一种式Tsm-Pc的共轭物，
其中Tsm代表靶-特异性部分，而
其中Pc代表其最大吸光在400-850nm范围的卟菲花青，且
其中L代表共价键或通过共价键与Tsm和Pc结合的连接部分。
7、权利要求6的共轭物，其中的Tsm为一免疫球蛋白或一免疫球蛋白片段;或
为甾族化合物;或
为糖化物;或
含有-T-细胞受体;和/或
其中L代表一共价键。
8、一咱对特定细胞或组织有细胞毒性的药物组合物，该组合物包含掺合了至少一种可药用赋形剂的有效量的权利要求1-5之任一项的化合物或权利要求6或7的共轭物。
9、权利要求1-5之任一项的化合物或权利要求6或7的共轭物用于消弱目标细胞、组织或病毒的代谢或有效破坏目标细胞、组织或病毒的方法，该方法包括使所述细胞、组织或病毒与有效量的所述化合物或共的接触并用波长范围为400-850nm的光照射该接触后的细胞、组织或病毒。
10、一种磁共振成象（MRI）造影剂，该造影剂包含权利要求1-5之任一项的化合物和一顺磁离子。
11、权利要求10的诊断造影剂，其中的顺磁离子的元素为钆（Ⅲ）或锰（Ⅱ）。
12、权利要求10或11的试剂用于检测病态组织的方法，该方法包括向需要这类处置的动物投用所述造影剂并随后观察动物体内该造影剂的分布。
13、一种放射成象剂，该成象剂包含权利要求1-5之任一项的化合物及选自锝、铟和镓的一种放射性同位素。
14、权利要求13的试剂用于检测病态组织的方法，该方法包括向需要这种处置的动物投用所述放射成象剂并随后观察动物体内该放射成象剂的分布。
15、一种制备权利要求1的其中R各为非干扰取代基的卟菲花青的方法，包括如下步骤：
（a）向适当取代的5，5′-双氨基甲基-2，2′-二吡咯甲烷加入过量10倍的2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌，生成粗产物;
（b）在氧化铝柱上色谱分离而提纯该粗产物;及然后
（c）蒸发该提纯的卟菲花青至干燥。
16、制备权利要求1的卟菲花青的方法，包括以下步骤：
（a）将适当取代的二甲酰-2，2′-二吡咯甲烷悬浮在无水乙醇中;
（b）将氨气通过步骤（a）的溶液鼓泡;
（c）在至少约60℃将步骤（b）的产物加热至少约72小时;
（d）将步骤（C）的产物冷却至0℃;
（e）在氧化铝柱上经色谱分离提纯粗产物;及然后
（f）蒸发该提纯的卟菲花青至干燥。
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