-
Hintergrund der Erfindung
-
Die
Erfindung betrifft die Verwendung eines molekularen Konjugats, das
einen Photosensibilisator und einen zielenden Rest umfaßt, und
Verfahren zur Verwendung des Konjugats.
-
Infektiöse Erkrankungen
führen
nach wie vor zu ernsthaften medizinischen Problemen. Dies ist zum
Teil die Folge des Auftretens von Bakterienstämmen, die gegenüber mehreren
Antibiotika resistent sind, von neu entdeckten viralen Erkrankungen
und der Ausbreitung von Erkrankungen, die durch Pilze und Protozoen
verursacht werden. Beispielsweise ruft das jüngste Auftreten von Stämmen von
Mycobacterium tuberculosis mit Arzneimittelmehrfachresistenz, die
der Tuberkulose zugrunde liegende Ursache, ein Problem der öffentlichen
Gesundheit epischen Ausmaßes
hervor. Untersuchungen mit Hilfe von Computermodellen und Feldstudien
von geographisch isolierten menschlichen Gemeinschaften weisen darauf
hin, daß die
Tuberkulose in Wirtspopulationen endemisch werden kann, die so wenige
wie 200 zusammenhängende
Individuen aufweisen (ein dramatischer Gegensatz zu Krankheiten,
wie z. B. Masern und Pocken, die sich lediglich in Gemeinschaften
aufrecht erhalten können,
die mehr als 200.000 zusammenhängende
Individuen aufweisen). Darüber hinaus
ist die Immunantwort auf M. tuberculosis nicht eradikativ. Infizierte
Individuen können
ein Leben lang chronische Erkrankungen oder latente Infektionen
entwickeln, die als langwährende
Reservoire für die Übertragung
dienen können.
Soukos, N. et al.: "Targeted
Antimicrobial Photochemotherapy",
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Band 42, Oktober 1998 (1998-10);
Seiten 2595-2601, XP001055607 offenbart eine Untersuchung der Photodestruktion
von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterienspezies des Mundes,
während
eine orale epitheliale Zellinie geschont wird. In dieser Studie
wird ein Konjugat zwischen Poly-L-Lysin und Chlorin-e6 verwendet.
-
Maliz
Z. et al.: "New
trends in photobiology (invited review) Bactericidal effects of
photoactivated porphyrins – an
alternative approach to antimicrobial drugs", Journal of Photochemistry and Photobiology, B.
Biology, 5 (1990) 281-293, lehrt, daß photoaktivierte Porphyrine
eine zytotoxische Aktivität
gegenüber einer
Vielzahl von Gram-positiven Bakterien, Mycoplasmen und Hefen aufzeigt,
nicht jedoch gegenüber Gram-negativen
Zellen.
-
US 5,091,385 offenbart die
Verwendung eines therapeutischen Mittels, das von einer photoaktiven
Verbindung abgeleitet wurde, bei der Behandlung von Tumoren und
anderen pa thogenen biologischen Kontaminanten. Die photoaktive Verbindung wird,
bevor sie mit dem zu behandelnden Gewebe in Kontakt gebracht wird,
aktiviert.
-
US 5,512, 675 offenbart
Porphocyanin-Photosensibilisatoren und zielende Konjugate davon
sowie deren Verwendung in Therapie und Diagnose.
-
US 5,332,567 offenbart Konjugate,
die einen zielenden Antikörper
und ein gebundenes therapeutisches Mittel zur Behandlung von Infektionen
umfassen.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Viele
ernsthafte Infektionskrankheiten sind gekennzeichnet durch die Fähigkeit
eines pathogenen Organismus, in die Zellen eines Wirtsorganismus
(der Wirt wird hier als "der
Patient" bezeichnet) einzudringen
und sich darin zu reproduzieren.
-
Mycobakterien,
die sich in dieser Weise verhalten, sind verantwortlich für Tuberkulose,
Lepra, die MAI-Mehrfachinfektion von AIDS-Patienten und für andere
Krankheiten (wie z. B. Buruli ulcer).
-
Im
Anschluß an
die Infektion werden Mycobakterien von Makrophagen phagozytiert,
wo sie gegenüber
vielen antibiotischen Arzneimitteln und gegenüber dem Immunsystem des Patienten "abgeschirmt" sind. Dies trifft
insbesondere zu für
die Lungen-Tuberkulose, bei der sich infizierte Makrophagen in Granuloma
in der Lunge sammeln.
-
Die
Erfindung betrifft die Verwendung eines molekularen Konjugats für die Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung einer Störung in Verbindung mit einem
intrazellulären
Pathogen, wobei die Störung
eine Krankheit ist, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Tuberkulose, Leishmaniose und Toxoplasmose,
und wobei das molekulare Konjugat folgendes umfaßt:
- (a)
einen Photosensibilisator, der in der Lage ist, bei Bestrahlung
eine zytotoxische Wirkung zu erzeugen, und
- (b) einen liposomalen zielenden Rest, der in der Lage ist, das
Konjugat auf das intrazelluläre
Pathogen oder auf eine infizierte Wirtszelle zu richten.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist das intrazelluläre Pathogen eine Bakterienzelle.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist die Bakterienzelle ein Mycobacterium.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist das Mycobacterium Mycobacterium tuberculosis.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist das Mycobacterium Mycobycterium bovis BCG.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt befindet sich das intrazelluläre Pathogen in einem Phagozyten.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist der Phagozyt ein Makrophage.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist das intrazelluläre Pathogen innerhalb einer
Vakuole, eines Vesikels oder einer Organelle einer Zelle des Subjekts
(Patienten).
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist die Störung
eine aktive Störung.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist die Störung
eine latente Störung.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist der Photosensibilisator in der Lage, bei Bestrahlung
durch einen Laser eine zytotoxische Wirkung zu erzeugen.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt liegt das Medikament in einer intravenös verabreichbaren
Form vor.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt liegt das Medikament in einer parenteral verabreichbaren
Form vor.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt liegt das Medikament in einer topisch verabreichbaren
Form vor.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist der Photosensibilisator ausgewählt unter
Chlorin, Porphyrin und aktiven Derivaten davon und Purpurin.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist das Porphyrin Chlorin e6.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist das Porphyrin ein Benzoporphyrinderivat.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist der Photosensibilisator Poly-L-Lysinchlorin
e6 (pl-ce6) oder Benzoporphyrin (BPD).
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist das Medikament für die Verabreichung in wenigstens
zwei Dosen formuliert.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt umfaßt
das Medikament weiterhin ein Antibiotikum.
-
Das
Medikament kann so formuliert sein, daß das molekulare Konjugat vor,
während
oder nach der Verabreichung des Antibiotikums verabreicht wird.
Das intrazelluläre
Pathogen kann eine Bakterienzelle, wie z. B. ein Mycobacterium,
beispielsweise Mycobacterium tuberculosis, sein. Der Photosensibilisator
kann bestrahlt werden, indem vorzugsweise eine Wellenlänge verwendet
wird, die dazu führt,
daß der
Photosensibilisator eine zytotoxische Wirkung erzeugt. Vorzugsweise
ist die zytotoxische Wirkung im wesentlichen ausreichend, um wenigstens
50%, vorzugsweise wenigstens 70% und besonders bevorzugt wenigstens
90%, der pathogenen Zellen abzutöten.
Die Strahlungsquelle kann jede beliebige der hierin beschriebenen
Quellen sein, z. B. ein Laser.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt ist das Medikament für die Verabreichung des molekularen
Konjugats vor dem Antibiotikum formuliert.
-
Die
Strahlung kann auf die Infektionsquelle ausgerichtet werden. Zum
Beispiel kann im Falle einer Lungeninfektion eine Bestrahlung der
Lunge bereitgestellt werden durch eine Lichtquelle, die in die Bereiche
eingeführt
wird, durch welche Luft eingeatmet wird. Alternativ kann die Bestrahlung
der Lunge bereitgestellt werden durch eine Lichtquelle, die durch
die Brustwand eingeführt
wird. In gleicher Weise kann die Bestrahlung auf bestimmte Bereiche
des Körpers
oder bestimmte Teile eines Organs oder Gewebes ausgerichtet werden.
Beispielsweise kann im Falle einer Lungeninfektion die Bestrahlung
der Lunge auf die Lungenbasis, auf die Lungenspitze oder auf beides
ausgerichtet werden.
-
Der
Begriff "Patient" wird hier so verwendet, daß er ein
lebendes Tier, einschließlich
einen Menschen, bezeichnet, welches/welcher einen unerwünschten
Organismus trägt,
wobei das hierin beschriebene molekulare Konjugat auf diesen unerwünschten
Organismus zielt. Dementsprechend kann der unerwünschte Organismus als der "Zielorganismus" bezeichnet werden.
Der Patient kann ein Säugetier
sein, wie z. B. ein Mensch, oder ein nicht menschliches Säugetier
(z. B. ein Hund, eine Katze, ein Schwein, eine Kuh, ein Schaf, eine
Ziege, ein Pferd, eine Ratte oder eine Maus). Der Patient kann immundefizient
sein, sich gleichzeitig oder zuvor einer Krebsbehandlung (z. B.
durch Chemotherapie oder Strahlentherapie) unterziehen bzw. unterzogen haben
oder sich gleichzeitig oder zuvor einer antibiotischen Therapie
oder einer immunsuppressiven Therapie unterziehen bzw. unterzogen
haben.
-
Das
intrazelluläre
Pathogen kann in einer Wirtszelle enthalten sein, wie z. B. in einem
Phagozyten (z. B. einem Makrophagen). Weiterhin kann das Pathogen
innerhalb der Zelle (teilweise oder vollständig) innerhalb einer Vakuole,
eines Vesikels oder einer Organelle enthalten sein.
-
Das
molekulare Konjugat zur Verwendung bei dieser Erfindung kann bestrahlt
werden. Typischerweise wird die Bestrahlung (z. B. diejenige, die durch
einen Laser erzeugt wird) eine Wellenlänge aufweisen, die dazu führt, daß der Photosensibilisator
(ein Teil des Konjugats) eine zytotoxische Wirkung erzeugt (z. B.
Erzeugung einer toxischen Sauerstoffspezies, die durch die Bakterienzellwand
diffundieren kann, oder die Erzeugung von reaktiven Stickstoffintermediaten).
Der Photosensibilisator kann ein Porphyrin sein oder ein aktives
Derivat davon (d.h. ein Porphyrin, das wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens
80% (z. B. 85% oder 90%) und besonders bevorzugt wenigstens 95%
der zytotoxischen Aktivität
des Porphyrins behält,
von dem es abgeleitet wurde). Weiter unten werden Tests beschrieben, mit
denen diese Aktivität
bestimmt werden kann. Der Photosensibilisator kann Chlorin e6 sein.
-
Ebenfalls
weiter unten werden Überlegungen
beschrieben, die für
die Verabreichung des Konjugats von Bedeutung sind. Diese schließen die
Verabreichungswege ein, einschließlich intravenöse und parenterale
(z. B. topische) Verabreichung. Das Konjugat kann der Lunge über eine
Vielzahl von Wegen verabreicht werden. Zum Beispiel kann es verabreicht
werden über
die Passagen, durch welche Luft inhaliert wird (d.h. es kann intratracheal,
intrabronchial oder intraalveolär
verabreicht werden). Alternativ kann das Konjugat durch die Körperwand
der Brust verabreicht werden. Das Licht, das auf das Konjugat anzuwenden
ist, sobald dieses verabreicht wurde, kann ebenfalls über diese
Wege angewandt werden (z. B. kann eine Lichtquelle oder ein Teil
davon in der Luftröhre,
in den Bronchien oder den Bronchiolen der Lunge angeordnet werden,
oder sie kann durch die Brustwand eingeführt werden). Das molekulare
Konjugat kann einem Patienten zu mehr als einer Gelegenheit verabreicht
werden (d.h. wenigstens zweimal). Gleichsam kann ein Konjugat, das
verabreicht wurde, zu mehr als einer Gelegenheit beleuchtet werden
(d.h. wenigstens zweimal), und die Beleuchtung (oder Bestrahlung)
kann auf die Lungenbasis, die Lungenspitze oder beides ausgerichtet
werden.
-
Alternativ
kann eine Aminogruppe auf dem Rückgrat
als ein Nukleophil reagieren und hierdurch die Abgangsgruppe von
dem als Photosensibilisator aktiven Ester verdrängen. Vorzugsweise ist der
zielende Rest mit dem Rückgrat über ein
Kopplungsmittel gekoppelt.
-
Bei
einigen Ausführungsformen
umfaßt
das Konjugat nicht (d.h. es ist weder kovalent und nicht-kovalent
gekoppelt mit) einen Antikörper,
ein Enzym, ein Hormon, ein Rezeptor auf der Zelloberfläche oder
den Liganden für
einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche. Allerdings kann das Konjugat
bei anderen Ausführungsformen
einen Antikörper,
ein Enzym, ein Hormon, einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche oder
den Liganden für
einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche umfassen (d.h. es kann
damit, entweder kovalent oder nicht-kovalent, gekoppelt sein).
-
Die
Zusammensetzungen der Erfindung sind vorteilhaft, da sie (i) nicht
in Bakterien internalisiert werden müssen, um Bakterien abzutöten, (ii)
da die Erzeugung von toxischen Spezies (z. B. reaktive Sauerstoff-Intermediate
oder reaktive Stickstoff-Intermediate) eine lokale Wirkung aufweisen
kann, indem die Wirtsimmunantwort stimuliert wird, welche im Gegenzug
bei der Vernichtung von Bakterien unterstützend wirkt sowie bei der Förderung
der Wundheilung, und (iii) da sie eine zytotoxische Wirkung lediglich
in dem Bereich erzeugen, der beleuchtet wird.
-
Kurze Beschreibung der
Figuren
-
1 ist
ein Balkendiagramm, das die Anzahl der koloniebildenden Einheiten
(CFU/ml) wiedergibt, die durch Zellen ausgebildet wurden, welche verschiedenen
molekularen Konjugaten (spezifiziert entlang der Y-Achse) und anschließend Licht
(L) oder Dunkelheit (D) ausgesetzt wurden.
-
Die 2A-2C sind
Balkendiagramme, die die Fraktion von Zellen, die nach Exponierung
gegenüber
den entlang der X-Achse beschriebenen molekularen Konjugaten überlebt
(2A), die Aufnahme von jedem der molekularen Konjugate (2B)
und die sich daraus ergebende relative Phototoxizität (2C)
darstellen.
-
Ausführliche Beschreibung
-
A. Molekulare Konjugate
-
Die
Erfindung stellt molekulare Konjugate vor, die einen Photosensibilisator
umfassen, der mit einem liposomalen zielenden Rest gekoppelt ist.
-
1. Der Photosensibilisator
-
Ein
Photosensibilisator ist eine Substanz, die eine zytotoxische Wirkung
erzeugt, wenn sie mit elektromagnetischer Energie mit einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt
wird. Typischerweise wird ein Photosensibilisator mit Licht einer
geeigneten Wellenlänge
bestrahlt.
-
Viele
Photosensibilisatoren erzeugen Singulettsauerstoff. Während der
elektromagnetischen Bestrahlung auf dem geeigneten Energieniveau
und bei einer geeigneten Wellenlänge
wird der Photosensibilisator in eine energiereiche Form umgewandelt,
die mit atmosphärischem
Sauerstoff so reagieren kann, daß beim Rückfall des Photosensibilisators
in das nicht energetisierte Stadium Singulettsauerstoff produziert
wird. Singulettsauerstoff ist hoch reaktiv und gegenüber in der
Nähe befindlichen
Zielorganismen toxisch, genauso wie reaktive Stickstoff-Intermediate.
-
Ein
molekulares Konjugat, das einen Photosensibilisator enthält, sollte
elektromagnetische Energie der geeigneten Wellenlänge effizient
mit einer hohen quantitativen Ausbeute absorbieren, um die energiereiche
Form des Photosensibilisators effizient zu erzeugen. Die Toxizität gegenüber dem
Zielorganismus sollte sich während
der Bestrahlung wesentlich erhöhen,
vorzugsweise 10-fach, 100-fach oder sogar 1.000-fach. Idealerweise
sollte ein Photosensibilisator geringe Grundtoxizität zeigen,
d.h. er sollte in Abwesenheit von Bestrahlung mit Energie der geeigneten
Wellenlänge
nicht toxisch sein. Darüber
hinaus sollte ein Photosensibilisator der Erfindung in einer Vielzahl
von Lösungsmitteln
leicht löslich
sein, einschließlich
denjenigen, in denen er mit dem zielenden Rest gekoppelt wird, und
denjenigen, in denen er einem Patienten verabreicht wird. Der Fachmann
wird erkennen, daß das,
was im Zusammenhang mit der Löslichkeit
wünschenswert
ist, in Abhängigkeit
von den Bedingungen, unter denen der Photosensibilisator zur Ausbildung
eines Konjugast gekoppelt wird (oder den Bedingungen, unter denen das
Konjugat verabreicht wird) unterschiedlich sein wird. Der Photosensibilisator
und der zielende Rest können
beispielsweise in einer Reaktion miteinander gekoppelt werden, die
die Löslichkeit
in DMSO, Wasser, Ethanol oder einem Gemisch davon (z. B. ein 1:1-Gemisch
von DMSO:H2O oder 5% Ethanol in Wasser)
erfordert.
-
Die
Photosensibilisatoren umfassen ohne Beschränkung hierauf Hämtoporphyrine,
wie z. B. Hämatoporphyrin
HCl und Hämatoporphyrinester (Dobson
et al., Arch. Oral Biol. 37:883-887),
Dihämatoporphyrinester
(Wilson et al., Oral Microbiol. Immunol 8:182-187, 1993), Hämatoporphyrin
IX und dessen Derivate (Russell et al., Can. J. App. Spectros. 36:103-107,
erhältlich
von Porphyrin Products, Logan, UT), 3,1-meso-Tetrakis(o-propionamidphenyl)-Porphyrin,
Hydroporphyrine, wie z. B. Chlorin, Herein und Bacteriochlorin der
tetra-(Hydroxyphenyl)-Porphyrin-Reihen
und synthetische Diporphyrine und Dichlorine, o-substituierte Tetraphenylporphyrine (picket-fence
Porphyrine), Chlorin-e6-Monoethylendiaminmonamid (CMA, Goff et al.
70:474-480, 1994, erhältlich
von Porphyrin Products, Logan, UT), Mono-1-Aspartyl-Derivate von
Chlorin e6 und Mono- und Di-Aspartyl-Derivate von Chlorin e6, das
Hämatoporphyringemisch
Photofrin II (quardra Logic Technologies, Inc., Vancouver, BC, Kanada),
Benzoporphyrinderiva te (BPD), einschließlich Benzoporphyrin-Monobase
Ring A (BPD-MA), Tetracyanoethylen-Addukte, Dimethylacetylendicarboxylat-Addukte,
Diels-Alder-Addukte und monobasische Ring-"a"-Derivate, ein Naphthalocyanin
(Biolo, Photochem and Photobiol. 5959:362-365, 1995), Toluidinblau
O (Wilson et al., Lasers in Medical Sci. 8:69-73, 1993), Aluminium-sulfoniertes
und -disulfoniertes Phthalocyanin ibid. und Phthalocyanine ohne Metallsubstituenten
und mit verschiedenen anderen Substituenten, ein tetrasulfatiertes
Derivat, sulfonierte Aluminium-Naphthalocyanine,
Methylenblau (ibid.), Nilblau, Kristallviolett, Azur-β-Chlorid
und Bengalrosa (Wilson, Intl. Dent. J. 44:187-189, 1994). Zahlreiche
Photosensibilisator-Gebilde sind offenbart in Wilson et al., (Curr.
Micro. 25:77-81, 1992) und in Okamoto et al. (Lasers in Surg. Med.
12:450-485, 1992).
-
Weitere
potentielle Photosensibilisatorzusammensetzungen umfassen ohne Beschränkung hierauf
Pheophorbide, wie z. B. Pyropheo-Phorbid-Verbindungen, Anthracendione,
Anthrapyrazole, Aminoanthrachinone, Phenoxazin-Farbstoffe, Phenothiazin-Derivate,
Chalcogenpyrylium-Farbstoffe, einschließlich kationische Selen- und
Tellur-Pyrylium-Derivate, Verdine, Purpurine, einschließlich Zinn- und
Zink-Derivate von Octaethylpurpurin und Etiopurpurin, Benzonaphthoporphyrazine,
kationische Imminiumsalze und Tetrazykline.
-
Die
Eignung eines Photosensibilisators zur Verwendung in einem Konjugat
kann nach hier beschriebenen Verfahren oder nach Verfahren, die
dem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden.
-
Die
Effizienz, mit der ein Photosensibilisator ein Zielmolekül oxidiert,
ist ein Maß für dessen
Nützlichkeit.
Die Effizienz der Oxidation eines Zielmoleküls durch einen Photosensibilisator
kann in vitro bestimmt werden. Die Beispiele für Substrate umfassen 4-Nitroso-N,N-dimethylanilin (RNO,
Hasan, et al., Proc. AACR 28:395 Abstr. 1,568, 1987) und Tryptophan
oder Histidin (Lambert et al., Photochem. Photobiol. 44:595-601,
1986). Bei diesen Tests kann die Fähigkeit eines Photosensibilisatorkandidaten,
das Substrat zu "bleichen" spektroskopisch
beobachtet werden. Der Vorteil eines chemischen Tests besteht darin,
daß eine
große
Zahl putativer Photosensibilisatorzusammensetzungen simultan gescreent
werden kann. Die Parameter, die variiert werden können, umfassen
die Photosensibilisatorkonzentration, die Substratkonzentration,
die optimale Intensität
der Bestrahlung und die optimale Wellenlänge der Bestrahlung. Technologien
mit hohem Durchsatz, die Multi-Well-Kunststoffschalen, automatisierte
Mehrfach-Pipettiergeräte
und spektrophotometrische Online-Plattenauslesegeräte umfassen,
können
verwendet werden. Die ungewünschten
Kandidaten, z. B. Zusammensetzungen, die unter nicht bestrahlten
Bedingungen ein hohes Rauschen haben, die ein ineffizientes Energieeinfang-
oder ein ineffizientes reaktives Potential aufzeigen, können identifiziert
und ausgeschlossen werden.
-
Zur
Evaluierung eines Photosensibilisators hinsichtlich Zytotoxizität von dessen
Grund- und aktivierten
Formen können
in vivo-Tests mit Zellen von einem oder mehreren Modell- Zielorganismen verwendet
werden. Die Effizienz der Abtötung
des Organismus in der Gegenwart des bestrahlten und nicht bestrahlten
Photosensibilisators kann gemessen werden und mit dem Überleben
der nicht behandelten Kontrollzellprobe verglichen werden. Dieser
Test kann automatisiert werden. Die Anwendung der Auszählung der
koloniebildenden Einheiten (CFU) oder des Zellwachstums kann die
Inkubation der Proben erforderlich machen, die auf ein Nährstoffmedium aufgebracht
worden sind, mit einer damit einhergehenden Verzögerung der angemessenen Wachstumsperiode
zur Ermöglichung
der Koloniebildung.
-
Das Überleben
der Zellen des Modell-Zielorganismus kann alternativ durch einen
Test eines biochemischen Vorgangs beobachtet werden, z. B. durch
einen Test auf DNA-Synthese. Bei diesem Ansatz kann die Wirksamkeit
eines Photosensibilisatorkandidaten durch dessen Wirkung auf Zellproben des
Modellorganismus gemessen werden, welche auch einem markierten DNA-Präkursor,
wie z. B. mit Tritium markiertes Thymidin, ausgesetzt werden. Die Zellen
werden dann gesammelt, zur Entfernung von nicht inkorporiertem Präkursor gewaschen
und auf die Aufnahme des Präkursors
und die Inkorporation in ein in Säure unlösliches Präzipitat kontrolliert, was ein
Maß für die Quantität der DNA-Synthese
ist. Bei diesem Test, der ebenfalls automatisiert werden kann, kann
die quantitative Evaluierung der Wirkungen der Anwesenheit von bestrahlten
Photosensibilisator-Zusammensetzungen leicht evaluiert und quantifiziert
werden. Bei den nicht bestrahlten Kontrollzellen und den unbehandelten
Zellen erhöht
sich die DNA-Synthese logarithmisch als eine Funktion des Zellwachstums.
Ein positives Ergebnis, welches das Vorliegen eines möglicherweise
erfolgreichen neuartigen Photosensibilisators anzeigt, besteht in einem
Abschalten der DNA-Synthese in Zellen, die in der Gegenwart dieses
Photosensibilisators bestrahlt wurden.
-
Alternativ
kann das Überleben
des Zielorganismus kontrolliert werden, indem man die Inkorporation
von [3H]-Uracil in Nukleinsäuren des
Organismus kontrolliert. Diese Messung kann wie beispielsweise von
McLeod and Remington beschrieben (J. Immunol. Meth. 27:19-29, 1979)
vorgenommen werden. Dieser Test kann verwendet werden, wenn der
Zielorganismus aus der Gattung Toxoplasma, z. B. T. gondii stammt.
-
Falls
große
Kandidatenzahlen gescreent werden sollen, kann es gewünscht sein,
ein zweistufiges Screening anzuwenden, wobei die erste Stufe ein
in-vitro-Screening ist und die zweite Stufe Zellen einsetzt.
-
Eine
geeignete Positivkontrolle für
die Photosensibilisatoraktivität
ist Toluidinblau O.
-
2. Der liposomale
zielende Rest
-
Die
Reste, die mit den Photosensibilisatoren konjugiert werden können, um
auf Makrophagen zu zielen, umfassen low-density-Lipoproteine (Mankertz et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 240:112-115, 1997, von Baeyer
et al., Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. Toxicol. 31:382-386, 1993),
very-low-density-Lipoproteine (Tabas et al., J. Cell Biol. 115:1547-1560, 1991)
und Liposome (Bakker-Woudenberg et al., J. Drug Target. 2:363-371,
1994, Meyers et al., Exp. Lung Res. 19:1-19, 1993, Betageri et al.,
J. Pharm. Pharmacol. 45:48-53, 1993, Muller et al., Biochim. Biophys.
Acta. 986:97-105, 1989, Kole et al., J. Infect. Dis. 180:811-820,
1999). Die bloße
Lipoprotein-Konjugation ist nicht Teil dieser Erfindung.
-
B. Der Zielorganismus
-
Der
Organismus, auf den zum Zwecke der Zerstörung durch die hier beschriebenen
Verwendungen gezielt wird, ist ein unerwünschter Organismus, unerwünscht in
der Hinsicht, daß er
einen Wirtsorganismus (oder eine Zelle davon) infiziert und eine Erkrankung
oder Störung
in diesem Wirt verursacht oder verschlimmert. Besonders bevorzugte
Zielorganismen sind Bakterienzellen, insbesondere der Gattungen
Mycobacteria und Toxoplasma.
-
Die
Organismen, auf die durch die Verwendungen der vorliegenden Erfindung
gezielt werden soll, sind auf allen für Licht zugänglichen Oberflächen oder
in allen für
Licht zugänglichen
Bereichen zu finden, z. B. in menschlichen oder tierischen Patienten, bei
zu dekontaminierenden Materialien oder auf Nutzpflanzen. Im Falle
von Menschen und Tieren sind Infektionen der Epidermis, der Mundhöhle, der Nasenhöhle, der
Nasennebenhöhlen,
der Ohren, der Lungen, des Urogenitaltrakts und des Magen-Darm-Trakts
für Licht
zugänglich.
Die epidermalen Infektionen umfassen diejenigen von unerwünschten
Organismen bakteriellen und tierischen Ursprungs und umfassen subkutane
Infektionen, insbesondere örtliche
Läsionen,
z. B. verursacht durch Protozoen, Parasiten oder durch parasitäre Milben, wobei
diese Infektionen für
Licht zugänglich
sind. Die Infektionen der Bauchhöhle,
wie z. B. diejenigen, die durch Blinddarmdurchbruch verursacht werden,
sind wenigstens über
laparoskopische Vorrichtungen für Licht
zugänglich.
Eine Vielzahl von Hautinfektionen, die gegenüber Antibiotika oder der Langzeitbehandlung
mit antifungalen Mitteln unempfindlich sind, z. B. die Dermatophytosen
des Zehennagels, sind geeignet für
die photodynamische Therapie unter Verwendung der Verfahren und
Verwendungen der Erfindung.
-
Eine
Lungeninfektion kann mit Bakterienspezies auftreten, einschließlich der
klassischen Tuberkulose des Mycobacterium tuberculosis. Da die Pathogenen
der Lunge zunehmend resistent gegenüber klassischen Antibiotikatherapien
sind, bietet die photodynamische Therapie mit den Verwendungen der vorliegenden
Erfindung ein alternatives Verfahren zur Eliminierung des unerwünschten
Organismus, welches unabhängig
von den mikrobiellen Mechanismen der Widerstandsfähigkeit
ist.
-
C. Verabreichung des Medikaments
der Erfindung an einen Wirtsorganismus
-
Die
molekularen Konjugate zur Verwendung bei der Erfindung sollten über den
Verlauf von wenigstens einer einzelnen Behandlungsrunde mit kontinuierlicher
oder gepulster Bestrahlung stabil sein, während welcher der Photosensibilisator
innerhalb des Konjugats vorzugsweise wiederholt auf das energiereiche
Stadium angeregt werden würde,
wobei er mehrere Runden der Erzeugung von Singuletsauerstoff durchlaufen
würde.
-
Die
molekularen Konjugate zur Verwendung bei der Erfindung umfassen
Konjugatmoleküle,
die formuliert wurden für
die topische Verabreichung und auch für die Verabreichung für verschiedene äußere Organe,
wie z. B. das äußere Ohr,
oder für
Organe, die durch externe Verabreichung erreichbar sind, wie z.
B. durch orale Anwendung oder durch Spülung der Lunge. Die hier genannten
Beispiele sollen im Hinblick auf die Eigenschaften der konjugierten
Photosensibilisatorzusammensetzungen zur Verwendung bei der Erfindung
oder im Hinblick auf einen bestimmten Verabreichungsweg nicht beschränkend sein, und
es werden hierin zusätzliche
Wege aufgeführt. Gemäß einer
anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung können
die Photosensibilisatorzusammensetzungen durch eine Kombinationstherapie verabreicht
werden, d.h. in Kombination mit anderen Mitteln. Zum Beispiel kann
die Kombinationstherapie eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit
wenigstens einem anderen Photosensibilisator, wenigstens einem Antibiotikum
umfassen, oder irgendeine andere konventionelle Therapie.
-
Die
Photosensibilisatorkonjugate, die in gewisser Weise in einem wäßrigen Lösungsmittel
unlöslich
sind, können
in der Weise, daß sie über die Zeit
freigesetzt werden, angewendet werden, so daß zeitweise unter Verwendung
eines Zeitplans der Beleuchtung alternierend mit Zeiträumen der
Nicht-Beleuchtung eine Beleuchtung angewendet werden kann. Andere
in Erwägung
zu ziehende Therapiepläne,
für welche
eine Formulierung zur Freisetzung über die Zeit geeignet ist,
sind kontinuierliche Perioden mit Beleuchtung auf niedrigem Niveau.
-
Die
Formulierung "pharmazeutisch
verträglicher
Träger" wird hier so verwendet,
daß er
alle beliebigen Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakteriellen und antifungalen
Mittel, isotonischen Mittel und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien,
Beschichtungen, antibakteriellen und antifungalen Mittel, isotonischen
Mittel und die Absorption verzögernden
Mittel und dergleichen umfaßt,
die physiologisch verträglich
sind. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen
ist auf dem Gebiet gut bekannt. Vorzugsweise ist der Träger geeignet
für die
orale, intravenöse,
intramuskuläre,
subkutane, parenterale, spinale oder epidermale Verabreichung (z.
B. durch Injektion oder Infusion). In Abhängigkeit vom Verabreichungsweg
kann die aktive Verbindung überzogen sein
mit einem Material zum Schutz der Verbindung gegenüber der
Wirkung von Säuren
oder anderen natürlichen
Bedingungen, die die Verbindung inaktivieren können.
-
Die
Konjugate können
auch parenteral verabreicht werden. Die Formulierung "parenteral verabreicht" bedeutet hier Verabreichungsarten,
die anders sind als die orale Verabreichung, üblicherweise durch Injektion,
und umfaßt
ohne Beschränkung
hierauf die intravenöse,
intramuskuläre,
intraarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale,
transtracheale, subkutane, subkutikulare, intraartikuläre, subkapsulare, subarachnoide,
intraspinale, epidurale und intrasternale Injektion und Infusion.
-
Eine
Zusammensetzung zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung kann über eine
Vielzahl von auf dem Gebiet bekannten Verfahren verabreicht werden.
Für den
Fachmann ist es offensichtlich, daß der Weg und die Art der Verabreichung
in Abhängigkeit
von den gewünschten
Ergebnissen variieren wird. Die aktiven Verbindungen können mit
Trägern hergestellt
werden, die die Verbindung gegenüber
einer sehr schnellen Freisetzung schützen werden, wie z. B. eine
Formulierung für
die kontrollierte Freisetzung, einschließlich Implantate, transdermale
Pflaster und mikroverkapselte Zuführsysteme. Es können biologisch
abbaubare, biokompatible Polymere verwendet werden, wie z. B. Ethylenvinylacetat,
Polyanhydride, Polyglykolsäure,
Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Viele Verfahren zur Herstellung solcher
Formulierungen sind patentiert oder im allgemeinen dem Fachmann
bekannt. Siehe z. B. Sustained and Controlled Release Drug Delivery
Systems, J. R. Robinson, Hrsg., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
-
Die
Dosierungspläne
werden so eingestellt, daß die
optimale gewünschte
Antwort (z. B. eine therapeutische Antwort) geliefert wird. Zum
Beispiel kann ein einzelner Stoß verabreicht
werden, es können
mehrere getrennte Dosierungen über
die Zeit verabreicht werden oder die Dosis kann je nachdem, wie
es durch die Erfordernisse der therapeutischen Situation angezeigt
ist, proportional abgesenkt oder erhöht werden.
-
Der
Fachmann kann die wirksame Menge der erforderlichen pharmazeutischen
Zusammensetzung bestimmen und verschreiben. Beispielsweise könnte man
mit Dosierungen de bekannten oder neuartigen Photosensibilisatorzusammensetzung
auf Niveaus beginnen, die niedriger als diejenigen sind, die erforderlich
sind, um die gewünschte
therapeutische Wirkung zu erreichen, und man könnte die Dosierung stufenweise
erhöhen,
bis der gewünschte
Effekt erreicht ist.
-
Die
Einstrahlung der geeigneten Wellenlänge für eine gegebene Verbindung
kann durch eine Vielzahl von Wellenlängen verabreicht werden. Die Verfahren
zur Bestrahlung umfassen ohne Beschränkung hierauf die Verabreichung
von Laser-, Nicht-Laser- oder Breitbandlicht. Die Bestrahlung kann
durch die extrakorporale oder intraartikuläre Erzeugung von Licht der
geeigneten Wellenlänge
erzeugt werden. Das bei der Erfindung verwendete Licht kann verabreicht
werden, indem man eine beliebige Vorrichtung verwendet, die in der
Lage ist, die erforderliche Lichtstärke zuzuführen, einschließlich ohne
Beschränkung
hierauf Faseroptikinstrumente, arthroskopische Instrumente oder
Instrumente, die eine Durchleuchtung liefern. Die Zuführung des
Lichts zu einem verborgenen oder in anderer Weise unzugänglichen
physiologischen Ort kann durch flexible Faseroptiken erleichtert
werden (diese Äußerung impliziert
die Idee, daß man
entweder ein breites Feld, wie z. B. die Lunge oder einen Lungenlappen,
bestrahlen kann oder einen kleinen Bereich, indem sich Bakterienzellen
eingenistet haben mögen).
Die für die Inaktivierung
der Bakterien erforderliche Lichtquelle kann ein günstiger
Diodenlaser oder eine nicht-köhärente Lichtquelle
sein.
-
BEISPIELE
-
Die
Untersuchungen, die folgen, wurden mit Mycobacterium bovis BCG durchgeführt, welcher
in Flüssigkultur
(7H9-Medium) angezogen wurde, mit einer photodynamischen Verbindung
inkubiert wurde, in die Wells einer 96-Well-Gewebekulturplatte aliquotiert
wurde und Licht ausgesetzt wurde (für eine Stunde bei 80 J/cm).
(Die Kontrollversuche erfolgten wie unten). Um die Wirkung dieser
Behandlung auf die Zytotoxizität
zu bestimmen, wurden die Bakterien in Suspension durch zehnfache
Verdünnung
verdünnt
und 10 μl
Aliquots wurden auf Agarplatten (7H10-Medium) getüpfelt. 7-10
Tage später
wurde die Zahl der koloniebildenden Einheiten (CFUs) gezählt.
-
Insbesondere
wurden für
jede untersuchte photodynamische Verbindung 100 μl einer flüssigen M. bovis-Kultur (OD600 = 1) in ein Eppendort-Röhrchen übertragen,
welches zentrifugiert wurde, um die Bakterienzellen zu pelletieren.
Das Medium wurde dann verworfen, und die Zellen wurden in entweder
1 ml Medium oder 1 ml 7H9-Brühe
resuspendiert. Die hieraus hervorgehende Konzentration an Zellen
betrug ungefähr
1 × 106 Zellen/ml. Sobald sie resuspendiert waren,
wurde die photodynamische Verbindung (oder ein äquivalentes Volumen an PBS
als Kontrolle) zu der Zellsuspension zugegeben. Die folgenden photodynamischen
Verbindungen wurden bei dieser Untersuchung getestet: pl-ce6, BPD
und cpd 33.
-
Die
Zellen wurden mit den photodynamischen Verbindungen inkubiert und
dann auf eine Mikrotiterplatte in zwei Parallelen aliquotiert (in
200 μl Aliquots).
Der erste Satz Proben wurde einem Licht ausgesetzt (für eine Stunde
bei 80 J/cm), der Parallelsatz verblieb jedoch im Dunkeln. Jede
Probe wurde dann in einer Serie verdünnt und 10 μl jeder Verdünnung wurden in drei Parallelen
auf eine Mycobakterien-Agarplatte ausgetüpfelt. Man ließ die Platten trocknen
und inkubierte sie dann für
7-10 Tage bei 37°C.
Am Ende des Inkubationszeitraums wurden die koloniebildenden Einheiten
gezählt.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Die Zahl der CFUs war in allen Proben, die mit einer photodynamischen
Verbindung inkubiert wurden und einem Licht ausgesetzt wurden, deutlich reduziert
(L; D = dunkel), außer
die Probe, die mit cpd33 (welches gegenüber BCG unabhängig davon, ob
die Zellen dem Licht ausgesetzt wurden, toxisch war (Daten nicht
dargestellt)) inkubiert wurde. Obwohl in den mit pl-ce6-PEG und
BPD "nicht-liposomal" behandelten Proben
lediglich moderate Zytotoxizität
zu beobachten war, verringerten diese Verbindungen die Größe der Kolonien,
die sich ausbildeten, und veränderten
deren Morphologie.
-
Die
oben beschriebene Studie wurde wiederholt, und die Ergebnisse wurden
im Hinblick auf die Anzahl der getöteten Zellen in Bezug auf die
offenbare Aufnahme der photodynami schen Verbindung untersucht. Diese
Daten sind in den 2A und 2B dargestellt,
und die relative Phototoxizität
der Verbindungen ist in 2C dargestellt.