DE69729004T2

DE69729004T2 - Photodynamische therapie zur behandlung von osteosrthritis

Info

Publication number: DE69729004T2
Application number: DE69729004T
Authority: DE
Inventors: Kenneth Trauner; Tayyaba Hasan
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1996-10-10
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2017-10-11
Also published as: EP0959879A1; DE69729004D1; EP0959879B1; EP0959879A4; WO1998015273A1; US5942534A

Description

Diese Erfindung wurde teils mit Regierungsunterstützung unter Zuschussnummer DEFG02-91-ER61228, die vom „Department of Energy" erteilt wurde, durchgeführt. Die US-Regierung hat bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung ist eine photodynamische Therapie.
Die photodynamische Therapie (PDT) wurde zuerst als eine experimentelle Behandlung bei Krebs entwickelt. Die Behandlung basierte auf der Beobachtung, dass Krebszellen photoaktivierbare Verbindungen zurückhalten und selektiv abgetötet werden konnten, wenn diese Verbindungen im Anschluss daran mit absorbiertem Licht interagierten (siehe z. B. Bottiroli et al., Photochem. Photobiol. 47: 209–214, 1988; Salet et al., Photochem. Photobiol. 53: 391–393, 1991; Gross, in: Photobiological Techniques, Valenzeno et al., Hrsg., Plenum Press, New York, 1991; und Jon et al., in: Photodynamic Therapy of Neoplastic Disease, Hrsg. Kessel, CRC Press, Boca Raton, FL, 1989). Eine photodynamische Verbindung, die weithin verwendet wird, wird als Photofrin^® auf dem Markt angeboten. Photofrin^®/HPD (Hämatoporphyrin-Derivat) war der erste von der FDA zugelassene Photosensibilisator, der für PDT-Studien zur Verfügung stand. Photofrin^® wurde in der Folge ausgiebig auf die Zerstörung multipler Tumoren in zahlreichen medizinischen Fachbereichen getestet (Dougherty et al., in: Photodynamic Therapy of Neoplastic Disease, Hrsg. Kessel, vorstehend).
Der Wirkmechanismus für Hämatoporphyrin-Derivate, wie zum Beispiel Photofrin^®, bei der Behandlung neoplastischer Erkrankungen ist gut beschrieben. Große Molekülaggregate der Porphyrine akkumulieren sich um die Neovaskulatur des Tumors herum. Diese Akkumulation wird durch unzulängliche lymphatische Drainage aus den neoplastischen Geweben veranlasst. Sobald sie im Gewebe sequestriert sind, dissoziieren die Molekülaggregate, und die hydrophoben Komponenten des Porphyrins veranlassen es, sich in Zellmembranen, primär in die zellulären und mitochondrialen Membranen aufzuteilen.
Die Initiierung der photodynamischen Aktivität wird durch Anregung der photodynamischen Verbindung durch Licht ausgelöst, das in ihre Absorptionsbande fällt. Die Wellenlängenspezifität hängt von der Molekülstruktur der photodynamischen Verbindung ab; ein größerer Konjugationsgrad in einem Molekül führt zu größerer Absorption bei längeren Wellenlängen. Die Aktivierung photodynamischer Verbindungen tritt mit subablativen Lichtfluenzen auf. Toxizität wird durch die O₂-Radikalen-Toxizität erreicht. Das Singlett-O₂ reagiert zum Beispiel mit Doppelbindungen zur Herstellung reaktiver Spezies, wie zum Beispiel Organoperoxiden. Diese initiieren wiederum Radikalkettenreaktionen, welche die Membranen abbauen und disorganisieren, die oxidative Phosphorylierung entkoppeln und zur Zelldisruption führen (Jon et al., vorstehend; Weishaupt et al., Cancer Res. 36: 2226–2329, 1976). Nukleinsäuren und Proteine werden auch durch die Photooxidation geschädigt (Henderson et al., in: Porphyrin Localization and Treatment of Tumors, Doiron et al., Hrsg. Liss, New York, 1984).
Studien, welche die Zerstörung der Synovialis ohne signifikante Nebenwirkungen nachweisen, weisen darauf hin, dass die photochemische Synovektomie eine wirksame Behandlung der rheumatoiden Arthritis darstellt (US-Patent 5363841).
WO 94/28889 offenbart eine Reihe von Verbindungen, die zur photodynamischen Behandlung einer entzündlichen Gelenkerkrankung verwendet werden können.
US-A-5430051 offenbart eine Reihe von Verbindungen zur photodynamischen Diagnose und Therapie der Arthritis.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten erfindungsgemäßen Aspekt ist ein In-vitro-Verfahren zum Testen der Fähigkeit einer photoaktivierbaren Verbindung zur Verminderung der Konzentration eines von Chrondrozyten gebildeten Abbauenzyms bereitgestellt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) Kontaktieren der Chondrozyten mit einer photoaktivierbaren Testverbindung oder einem Präkursor davon;
(b) Verabreichung von Licht einer photoaktivierbaren Wellenlänge zur Aktivierung der photoaktivierbaren Testverbindung; und
(c) Bestimmung, ob die Konzentration des von den Chondrozyten gebildeten Abbauenzyms vermindert ist.

Es ist erfindungsgemäß weiter die Verwendung einer photoaktivierbaren Verbindung oder eines Präkursors davon bei der Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer osteoarthritischen Erkrankung, wie zum Beispiel eines osteoarthritischen Gelenkes, bereitgestellt, worin die Verbindung wie oben ausgewählt, und an einen Patienten verabreicht und durch Licht einer photoaktivierenden Wellenlänge aktiviert werden soll, worin die Menge der therapeutischen Zusammensetzung und die Menge des verabreichten Lichtes zur Reduktion des Grades der osteoarthritischen Erkrankung beim Patienten ausreichend sind.
Folglich wird erfindungsgemäß eine Behandlung für einen an einem osteoarthritischen Gelenk leidenden Patienten, durch Verabreichung einer photoaktivierbaren Verbindung oder eines Präkursors davon und Verabreichung von Licht einer Wellenlänge, welche die Verbindung aktiviert, bereitgestellt. Die Erfindung kann zur Behandlung eines humanen Patienten oder eines anderen Säugers, wie zum Beispiel eines Hundes, einer Katze, eines Kaninchens, eines Pferdes, einer Kuh, eines Schafs oder eines nicht humanen Primaten verwendet werden.
Photoaktivierbare Verbindungen können gemäß etablierter Leitlinien an einen Patienten verabreicht werden, damit die Konzentration der Verbindung im Zielgewebe (d. h. im Gelenk) größer als die Konzentration der Verbindung im umgebenden Gewebe ist. Das Verhältnis der Verbindung im betroffenen Gewebe zur Verbindung im umgebenden Gewebe liegt bevorzugt bei 2 : 1 oder größer. Die Verbindung kann überdies dergestalt verabreicht werden, dass eine angemessene Konzentration der Verbindung im Zielgewebe aufrechterhalten wird. Im Allgemeinen kann dieses Ziel, d. h. eine angemessene Konzentration einer differenziell lokalisierten Verbindung, unter Verwendung von Standardverfahren, die den fachlich kompetenten Pharmakologen bekannt sind, erreicht werden, worin selbstverständlich die Clearance-Zeit Berücksichtigung findet.
Die Verbindungen können entweder systemisch oder lokal an den Gelenkbereich verabreicht werden. Systemisch oder lokal verabreichte Verbindungen, die erfindungsgemäß nützlich sind, schließen die ein, die bevorzugt vom Zielgewebe aufgenommen werden oder diejenigen, die von den Zielgeweben wesentlich länger zurückgehalten werden als von den umgebenden Geweben eines Patienten. Photoaktivierbare Verbindungen können überdies allein oder in Gemischen, enthaltend zwei oder mehr dieser Verbindungen verabreicht werden. Wenn Verbindungen kombiniert werden, muss Licht einer wirksamen Wellenlänge für jede Verbindung im Gemisch zur Photoaktivierung der Verbindungen verwendet werden.

Im Allgemeinen muss die photoaktivierbare Verbindung eine ausreichend geringe Toxizität aufweisen, um die Verabreichung an einen Patienten mit einem medizinisch unbedenklichen Grad der Sicherheit zu erlauben. Es sind verschiedene photoaktivierbare Verbindungen bekannt, die in der erfindungsgemäßen praktischen Ausführung verwendet werden können. Diese Verbindungen weisen in der Regel chemische Strukturen auf, die mehrfache konjugierte Ringe einschließen, welche Lichtabsorption und Photoaktivierung erlauben. Sie unterscheiden sich hinsichtlich der Eigenschaften der Lichtabsorption und Fluoreszenz, Biodistribution, zeitlichen Aufnahme und Clearance. Zu den Klassen photoaktivierbarer Verbindungen zählen Hämatoporphyrine (Kessel, Cancer Lett. 39: 193–198, 1988), Uroporphyrine, Phthalocyanine (Kreimer-Birnbaum, Sem. in Hematol. 26: 157–173, 1989), Purpurine (Morgan et al., Photochem. Photobiol. 51: 589–592, 1990; Kessel, Photochem. Photobiol. 50: 169–174, 1989), Acridinfarbstoffe, Bakteriochlorophylle (Beems et al., Photochem. Photobiol. 46: 639–643, 1987; Kessel et al., Photochem. Photobiol. 49: 157–160, 1989) und Bakteriochlorine (Gurinovich et al., J. Photochem. Photobiol. B – Biol. 13: 51–57, 1992). Spezifische photoaktivierbare Verbindungen, die zur Behandlung der Osteoarthritis verwendet werden können, sind teilweise in Tabelle 1 zusammengefasst. Jede Photoaktivierungsverbindung, die keine systemische Toxizität aufweist und die zur photodynamischen Therapie von Neoplasien nützlich ist, kann im Allgemeinen bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein. Photofrin^® (bei dem es sich um ein halbgereinigtes Hämatoporphyrin-Derivat handelt), Benzoporphyrin-Derivate oder Aminolävulinsäure werden bevorzugt erfindungsgemäß verabreicht. TABELLE 1 VERBINDUNGEN ZUR PHOTODYNAMISCHEN THERAPIE DER OSTEOARTHRITIS

1.	Photofrin^®
2.	Synthetische Diporphyrine und Dichlorine
3.	Hydroporphyrine, wie zum Beispiel Chlorine und Bakteriochlorine der Tetra(hydroxyphenyl)porphyrin-Reihe;
4.	Phthalocyanine (PC); mit oder ohne Metallsubstituenten; z. B. Chloraluminiumphthalocyanin (CASP) mit oder ohne variierende(n) Substituenten;
5.	O-substituierte Tetraphenylporphyrine (picket-fence-Porphyrine):
6.	3,1-meso-Tetrakis(o-propionamidophenyl)porphyrin;

7.	Verdine
8.	Purpurine Zinn- und Zinkderivate von Octaethylpurpurin (NT2) Etiopurpurin (ET2)
9.	Chlorine Chlorin e6, Mono-1-aspartyl-Derivat von Chlorin e6 Di-1-aspartyl-Derivat von Chlorin e6
10.	Benzoporphyrin-Derivate (BPD) Benzoporphyrin-Monosäure-Derivate Tetracyanoethylen-Addukte von Benzoporphyrin Dimethylacetylen-dicarboxylat-Addukte von Benzoporphyrin Diels-Alder-Addukte Monosäurering-„A"-Derivat von Benzoporphyrin
11.	sulfoniertes Aluminium-PC sulfoniertes AlPc disulfoniertes (AlPcS₂) tetrasulfoniertes Derivat sulfonierte Aluminium-Naphthalocyanine
12.	Naphthalocyanine mit oder ohne Metallsubstituenten mit oder ohne variierende(n) Substituenten
13.	Anthracendione
14.	Anthrapyrazole
15.	Aminoanthrachinon
16.	Phenoxazin-Farbstoffe
17.	Phenothiazin-Derivate
18.	Chalkogenapyrylium-Farbstoffe kationische Selena- und Tellurapyrilium-Derivate
19.	Ring-substituiertes kationisches PC
20.	Pheophorbid-Derivat
21.	Hämatoporphyrin (HP)
22.	andere natürlich vorkommende Porphyrine
23.	5-Aminolävulinsäure und andere endogene metabolische Präkursoren
24.	Benzonaphthoporphyrazine
25.	kationische Imminiumsalze
26.	Tetracycline

Außer den freien photoaktivierbaren Verbindungen können photoaktivierbare Verbindungen in verschiedenen Formulierungen, einschließlich liposomaler, Peptid-/Polymer-gebundener oder Detergens-enthaltender Formulierungen abgegeben werden.
Eine Alternative zur Verabreichung der photoaktivierbaren Verbindung selbst besteht in der Verabreichung eines Präkursors dieser Verbindung. Dieser Ansatz wird durch die Verwendung von 5-Aminolävulinsäure erläutert, welche die endogene Bildung der photoaktivierbaren Verbindung Protoporphyrin IX veranlasst (Morgan et al., J. Med. Chem. 32: 904–908, 1989).
Licht der entsprechenden Wellenlänge für eine bestimmte Verbindung kann mittels einer dem Durchschnittsfachmann bekannten Reihe verschiedener Verfahren verabreicht werden. Diese Verfahren können einen Laser, Nichtlaser oder ein Breitbandlicht beinhalten und können in entweder extrakorporaler oder intraartikulärer Erzeugung des Lichtes der geeigneten Wellenlängen resultieren. Erfindungsgemäß verwendetes Licht kann unter Verwendung jedweder Vorrichtung verabreicht werden, die die geeignete Wellenform erzeugt, einschließlich, aber nicht beschränkt darauf, Faseroptikinstrumenten, arthroskopischen Instrumenten oder Instrumenten, die Transillumination bereitstellen, wie einem Durchschnittsfachmann bekannt sein wird.
Das hierin beschriebene therapeutische Verfahren kann eine wirksame Behandlung für osteoarthritische Gelenke und die Entzündung, die jedwede mechanische Verletzung eines Gelenkes begleiten kann, bereitstellen. Die photoaktivierbaren Chemikalien werden, wie hierin beschrieben, verabreicht, und die lokale Gelenkregion wird dann dem Licht über optische Fasern, die durch Injektionsnadeln mit kleinem Gauge gefädelt werden, ausgesetzt. Die Lichtquelle kann als Alternative extrakorporal durch Transillumination bereitgestellt werden. Die photodynamische Therapie bietet folglich eine wirksame neue und minimal invasive Behandlung, von der eine große Anzahl an Patienten profitieren kann; 60–80% der Bevölkerung entwickeln während ihrer Lebenszeit einen gewissen Grad an Osteoarthritis.
Das erfindungsgemäße In-vitro-Verfahren zum Screening auf eine photoaktivierbare Verbindung, die bei der PDT von Osteoarthritis nützlich ist, beinhaltet das Kontaktieren von Chondrozyten mit der photoaktivierbaren Testverbindung, wobei Licht einer geeigneten Wellenlänge verabreicht und bestimmt wird, ob diese Behandlung die Anzahl der lebensfähigen Chrondrozyten vermindert hat. Verbindungen, welche die Anzahl lebensfähiger Chondrozyten nach der Behandlung mit Licht vermindert, kann für die PDT von Osteoarthritis nützlich sein.
Unter dem Begriff „osteoarthritische Erkrankung", wie hierin verwendet, versteht man, dass sie die primäre Osteoarthritis umfasst, die von unbekannter Ätiologie sein kann, und die sekundäre Osteoarthritis, die aufgrund einer degenerativen Arthrose auftreten kann. Ein an Osteoarthritis und demgemäß an einem „osteoarthritischen Gelenk" leidender Patient kann oder kann keine offensichtliche fokale Schädigung, wie zum Beispiel Läsionen, an den Gelenkflächen eines betroffenen Gelenks aufweisen. Es wird erwartet, dass die meisten Patienten, die sich des hierin beschriebenen Behandlungsverfahrens bedienen, symptomatisch sind, die Behandlung kann aber auch als eine prophylaktische Maßnahme angewendet werden.
Unter dem Begriff „Präkursor" versteht man eine Verbindung, die nach Verabreichung an einen Patienten metabolisch in eine photoaktivierbare Verbindung umgewandelt wird.
Sofern nicht anderweitig definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe, wie von einem Durchschnittsfachmann, an den sich diese Erfindung wendet, allgemein erkannt werden wird, die gleiche Bedeutung. Im Falle von Widersprüchlichkeiten ist das vorliegende Dokument, einschließlich der Definitionen maßgeblich. Bevorzugte Verfahren und Materialien sind nachstehend beschrieben, obwohl Verfahren und Materialien ähnlich oder äquivalent zu den hierin beschriebenen bei der erfindungsgemäßen praktischen Ausführung oder dem Testen verwendet werden können. Sofern nicht anderweitig angezeigt, sind diese Materialien und Verfahren lediglich als erläuternd und nicht als einschränkend beabsichtigt. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere hierin erwähnten Referenzen sind lediglich als erläuternd und nicht als einschränkend beabsichtigt.
Andere erfindungsgemäße Merkmale und Vorteile, z. B. die Behandlung der humanen Osteoarthritis, werden aus der folgenden Beschreibung, aus den Zeichnungen und aus den Ansprüchen erkannt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A–1D sind Liniendiagramme, die die Wirkung von PDT auf die Lebensfähigkeit von Chrondrozyten unter Verwendung von BPD-MA (1A), Ce6 (1B), PF (1C) oder CASP ( 1D) als den Photosensibilisator beschreiben.
2 stellt ein Liniendiagramm dar, wobei die Wirkung der PDT auf die Proliferation von Chondrozyten veranschaulicht wird.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Photoaktivierbare Chemikalien lokalisieren sich selektiv an der Synovialis oder der Gelenkflüssigkeit und können zur Behandlung der osteoarthritischen Erkrankung verwendet werden. Die entzündungshemmende Wirkungen der PDT und ihre Fähigkeit, die Enzymaktivität in Chondrozyten zu modulieren, kann die bei der Osteoarthritis festgestellte Pathologie vermindern. Die verminderte Bildung, Freisetzung oder Aktivierung von zum Beispiel Metalloproteinase-Enzymen kann bei der Osteoarthritis eine verlängerte Erhaltung von Gelenkflächen ermöglichen. Photofrin^® stellt eines von vielen Beispielen eines photoaktivierbaren Therapeutikums dar, das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann. Seine relevanten Merkmale, welche die Lokalisierung am Synovialgewebe und besondere Clearance-Merkmale einschließen, sind für viele andere photoaktivierbare Verbindungen typisch.
Osteoarthritis ist eine Krankheit, die durch mechanisch und biologisch induzierten Abbau von Gelenkknorpel gekennzeichnet ist. Die Degeneration des Knorpels aufgrund biologischer und mechanischer Einwirkungen verändert die Belastungstransmission durch die Gelenke und ruft schmerzhafte Symptome hervor. Die Schmerzen können auch auf die Entzündung des Gelenkauskleidungsgewebes (Synovialis), das auf frei schwebende Knorpelpartikel (meniskal oder artikulär) reagiert, hervorgerufen werden. Der degenerative Knorpel veranlasst zwei Dinge: (a) er bildet Enzyme, welche die extrazelluläre Matrix aufschließen und (b) er bildet inflammatorische Mediatoren, die sich über das gesamte Gelenk hinweg ausbreiten und zur Entzündung der Synovialis führen. Die synoviale Entzündung bei Osteoarthritis ist eine Response auf irritierende Knorpelpartikel und ist nicht auf eine Autoimmunantwort zurückzuführen. Die PDT der Osteoarthritis kann die Bildung von degradativen Enzymen verlangsamen, die inflammatorischen Mediatoren in der Gelenkflüssigkeit zerstören und die Entzündung im Synovialgewebe modulieren.
Zur Abgabe von sowohl Photosensibilisatoren als auch Lichtenergie an die Gelenke liegen zahlreiche Möglichkeiten vor. Die Bestimmung der geeignetsten Parameter für jedwede photodynamische Verbindung, die zur Behandlung von Osteoarthritis verwendet werden soll, kann unter Verwendung der hierin bereitgestellten experimentellen Verfahren durchgeführt werden.
I. ABGABE PHOTOAKTIVIERBARER VERBINDUNGEN
Therapeutische photoaktivierbare Verbindungen können gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren entweder in die Gelenke injiziert oder systemisch verabreicht werden. Die Wahl von lokalisierter versus systemischer Verabreichung wird teilweise durch die Anzahl der während eines bestimmten therapeutischen Regimes zu behandelnden Gelenke bestimmt. Wenn eine kleine Anzahl von Gelenken der Behandlung bedarf, können die therapeutischen Verbindungen lokal verabreicht werden. Wenn hingegen viele Gelenke der Behandlung bedürfen, können die therapeutischen Verbindungen systemisch verabreicht werden.
Die zur Verwendung bei der photodynamischen Therapie zu verabreichenden therapeutischen Verbindungen können zur pharmazeutischen oder veterinären Verwendung durch Kombination mit einem verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Hilfsstoff und/oder in einer Einheitsdosierungsform formuliert werden. Durch Verwendung therapeutischer Verbindungen in den erfindungsgemäßen Verfahren können herkömmliche pharmazeutische oder veterinäre praktische Ausführungsformen zur Bereitstellung geeigneter Formulierungen oder Zusammensetzungen eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können folglich parenteral, wie zum Beispiel durch intravenöse, intraartikuläre, subkutane, intramuskuläre, intraventrikuläre, intrakapsuläre, intraspinale, intraperitoneale, topische, intranasale oder intrapulmonale Verabreichung appliziert werden. Die Patienten können auch durch orale bukkale, rektale oder vaginale Verabreichung behandelt werden.
Parenterale Formulierungen können in der Form flüssiger Lösungen oder Suspensionen vorliegen; orale Formulierungen können in der Form von Tabletten, Flüssigkeiten, Pulvern oder Kapseln vorliegen und intranasale Formulierungen können in der Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen vorliegen.
Im Stand der Technik zur Herstellung von Formulierungen weithin bekannte Verfahren können zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, neueste Auflage, gefunden werden. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können zum Beispiel als Hilfsstoffe steriles Wasser oder Kochsalzlösung, Polyalkylenglycole, wie zum Beispiel Polyethylenglycol, Öle pflanzlicher Herkunft oder hydrierte Naphtalene, enthalten. Biokompatible, biologisch abbaubare Lactid-Polymere oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere in der Form von Mikrosphären können zur Kontrolle der In-vivo-Freisetzung der vorliegenden Verbindungen verwendet werden. Andere potenziell nützliche parenterale Abgabesysteme für die Verbindungen schließen Ethylen-Vinylacetat-Copolymerpartikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssyteme, Liposomen und Antikörper-Konjugate, einschließlich zum Beispiel Liposomen, in die für das Gelenkgewebe spezifische Antikörper inkorporiert wurden, ein. Formulierungen zur Inhalation können einen Hilfsstoff, wie zum Beispiel Lactose enthalten; oder können wässrige Lösungen darstellen, die zum Beispiel Polyoxyethylen-9-laurylether, Glycocholat und/oder Desoxycholat enthalten; oder sie können ölige Lösungen zur Verabreichung in der Form von Nasentropfen darstellen; oder ein intranasal zu applizierendes Gel darstellen. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können auch Glycocholat zur bukkalen Verabreichung, Methoxysalicylat zur rektalen Verabreichung oder Zitronensäure zur vaginalen Verabreichung einschließen.
Die vorliegenden Faktoren können als der alleinige Wirkstoff verwendet werden oder können in Kombination mit anderen aktiven Bestandteilen verwendet werden.
Die Konzentration der in den erfindungsgemäßen Formulierungen vorliegenden Faktoren variieren in Abhängigkeit von einer Anzahl von Punkten, einschließlich der zu verabreichenden Dosierung und der Verabreichungsroute.
In allgemeiner Hinsicht können die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer wässrigen physiologischen Pufferlösung bereitgestellt werden, die ca. 0,1 bis 10% (Gew/V) Verbindung zur parenteralen Verabreichung enthält. Allgemeine Dosisbereiche zur systemischen Verabreichung liegen bei ca. 0,01 mg/kg bis ca. 20 mg/kg des Körpergewichts; ein bevorzugter Dosisbereich liegt bei ca. 0,2 mg/kg bis 2 mg/kg Körpergewicht. Wenn sie direkt an das Gelenk verabreicht werden, können die Verbindungen bei 0,01 bis 10 mg pro Gelenk gegeben werden. Die zu verabreichende bevorzugte Dosierung hängt wahrscheinlich vom Typ und dem Ausmaß der Progression der zu behandelnden Gelenkerkrankung, des Gesundheitszustands des Patienten insgesamt, der Größe des Patienten, der Körperoberfläche, dem Alter und Geschlecht, der Formulierung und der Verabreichungsroute ab.
II. ABGABE VON PHOTOAKTIVIERENDEM LICHT
Neuere photosensibilisierende Verbindungen, die keine systemische Photosensitivität der Haut verursachen, ermöglichen die Aktivierung in der Nähe von Infrarot- und längeren Wellenlängen im Spektrum des sichtbaren Lichts. Dies ermöglicht die Transillumination des Gelenks, die unter Verwendung einer Reihe verschiedener Vorrichtungen, die Laser- oder Nichtlaserquellen, d. h. Lichtkasten oder konvergierende Lichtstrahlen beinhalten. Als Alternative können optische Fasern entweder durch Arthroskope, die das direkte visuelle Targeting und die Aktivierung der Verbindungen ermöglichen oder direkt durch Injektionsnadeln, die bevorzugt ein kleines Gauge aufweisen, geführt werden. Licht kann auch über perkutane Instrumentierung unter Verwendung optischer Fasern oder kanülierter Wellenleiter geleitet werden. Aktivierung kann auch anhand offener Arthrotomie durchgeführt werden.
III. SCREENING-VERFAHREN VON THERAPEUTIKA ZUR VERWENDUNG BEI DER PHOTODYNAMISCHEN THERAPIE DER OSTEOARTHRITIS
A. MODELLE OSTEOARTHRITISCHER GELENKE
Die folgenden Protokolle können zur Generierung eines Modells von einem osteoarthritischen Gelenk in einem Säuger verwendet werden. Die Säuger können zum Beispiel eine Ratte, eine Maus, ein Meerschweinchen, ein Kaninchen, ein Hund, eine Katze oder ein nicht humaner Primat sein, sind aber nicht darauf beschränkt. In der wie nachstehend beschriebenen Weise vorbereitete Säuger können zum Screening verschiedener photoaktivierbarer Verbindungen auf ihre Anwendung zur Behandlung mechanisch verletzter Gelenke verwendet werden.
I. ABSCHNITT DER MEDIALEN KOLLATERAL- UND BEIDEN KREUZBÄNDER KOMBINIERT MIT DER RESEKTION DES MEDIALEN MENISKUS
Das folgende Verfahren wird mit weißen Neuseeland-Kaninchen durchgeführt, andere Kaninchen-Spezies und jedwede Säuger mit analogen Gelenkstrukturen können jedoch auch verwendet werden.
Erwachsene weiße Neuseeland-Kaninchen, mit einem Gewicht im Bereich von drei bis sechs Kilogramm und die durch röntgenologischen Nachweis des Epiphysenschlusses als matur erachtet wurden, können verwendet werden. Jedes Tier wird (zum Beispiel mit Diabutal ergänzt mit Xylocain^TM) anästhesiert, und der Zugang zum rechten Kniegelenk erfolgt durch eine mediale parapatellare Inzision. Das mediale Kollateralband, beide Kreuzbänder und die Sehne des langen Zehenbeugers (der Muskel weist beim Kaninchen einen intraartikulären Ursprung auf) werden gespalten, und der mediale Meniskus wird exzidiert. Die Kapsel wird dann locker angenähert und die Haut wird, zum Beispiel mit einer kontinuierlichen Nylonnaht, geschlossen (Ehrlich et al., J. Bone und Joint Surg. – American Vol. 57: 392–396, 1975).
II. ABSCHNITT DES FIBULAREN KOLLATERAL- UND SESAMOIDEN BANDES UND ENTFERNUNG DES VORDERHORNS DES LATERALEN MENISKUS
Osteoarthritis kann zum Beispiel auch bei erwachsenen Dutch-Belted Kaninchen, wie von O'Byrne et al. (Agents and Actions 39: C157–159, 1993) mittels Durchtrennen der fibularen Kollateral- und sesamoiden Bänder und Entfernung des Vorderhorns des lateralen Meniskus induziert werden. Es wurde gezeigt, dass dieses Verfahren in schwerwiegenden fokalen Läsionen des Bandes an den gegenüberliegenden Oberflächen der Tibia und des Femurs resultiert (O'Byrne et al., vorstehend).
B. MAKROSKOPISCHE PATHOLOGIE
Nach dem Aufwachen kann den Tieren vollständige Aktivität mit Gewichtsbelastung erlaubt werden. In den folgenden drei bis sechs Monaten entwickelt sich eine schwere degenerative Arthritis sekundär zur Instabilität mit sichtbaren Veränderungen, die nach einem Monat offensichtlich werden. Das Kniegelenk kann eine schwere Instabilität aufweisen, gekennzeichnet durch tibiofemorale und patellofemorale Subluxation und gelegentlich durch Dislokation. In den frühen Monaten kann die Gelenkfläche der Femurkondylen, insbesondere die der medialen Kondyle stumpf erscheinen. In späteren Monaten kann fibröses Bindegewebe Anteile der Gelenkfläche der Tibiakondylen bedecken. Wenn den Tieren erlaubt wird, ein Jahr zu überleben, kann der Knorpel auf der Femuroberfläche verdünnt sein und eine fokale Erosion aufweisen. Osteophyten können an der Patella und der patellaren Oberfläche der Femurkondylen gesehen werden.
C. HISTOLOGISCHE ANALYSE DES OSTEOARTHRITISCHEN GELENKS
Zur Untersuchung eines osteoarthritischen Gelenks eingesetzte histologische Studien sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt und schließen die Routinefärbung mit Hämatoxylin und Eosin und Färben mit Safranin O, Echtgrün und Eisenhämatoxylin ein. Hydroxyprolin kann mittels des Verfahrens nach Woessner quantifiziert werden; Hexosamin kann mittels des Verfahrens nach Rondel und Morgan quantifiziert werden; und die saure Phosphatase kann mittels des Verfahrens nach Lowry quantifiziert werden (Lowry, J. Histochem. 1: 420–428, 1953); Lowry et al., J. Biol. Chem. 207: 19–37, 1954). Stoffwechselbestimmungen können unter Verwendung spektrometrischer Assays mittels Flüssig-Szintillation inkorporierter Isotopen nach In-vitro-Exposition, wie von Mankin et al. (J. Bone and Joint Surg. 51: 1591–1600, 1969) beschrieben, durchgeführt werden.
D. TIERSTUDIEN MIT PHOTODYNAMISCHEN VERBINDUNGEN UNTER VERWENDUNG VON TIEREN MIT OSTEOARTHRITISCHEN GELENKEN
Zur Bestimmung, ob eine bestimmte photoaktivierbare Verbindung zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, werden weiße Neuseeland-Kaninchen, die jeweils 3–4 kg wiegen, in 3 Gruppen aufgeteilt: eine Kontrollgruppe bestehend aus normalen, gesunden Tieren (Kontrollgruppe 1), eine Kontrollgruppe bestehend aus Tieren, die sich einem chirurgischen Durchtrennungsverfahren des anterioren Kreuzbandes unterzogen haben, die aber keine PDT erhalten (Kontrollgruppe 2) und einer experimentellen Gruppe, die aus Tieren besteht, die sich diesem chirurgischen Eingriff unterzogen haben und die PDT erhalten. Sobald die Instabilität des Gelenks offensichtlich ist, erhalten 24 Tiere in der experimentellen Gruppe eine systemische Injektion mit 2 mg/kg der zu testenden Verbindung über eine Kanüle (25 Gauge) in eine Ohrvene. Lokalisierte Injektionen können außerdem auch 48 Stunden später oder zu jedweder anderen Zeit, die durch die Arzneimittel-Clearancestudie angezeigt ist, gegeben werden. Eine vergleichbare Anzahl von Tieren in der Kontrollgruppe 1 erhalten auch Injektionen mit dem Therapeutikum. Die Tiere werden mit Rompun und Ketamin gemäß den Standardprotokollen sediert und erhalten Lichtaktivierungsbehandlungen. Beide Knie aller Tiere in der experimentellen Gruppe und ein Knie, bevorzugt das rechte Knie von Tieren in der Kontrollgruppe 1 erhalten Lichtaktivierungsbehandlungen. Lichtenergie einer Wellenlänge von 400 nm – 690 nm oder jedweder Wellenlänge, die für das gewählte Therapeutikum aktivierend ist, wird über eine optische Faser von 400 Mikron durch eine Kanüle (23 Gauge) in die Kniegelenkhöhlen übertragen. Als Alternative kann das Licht extrakorporal appliziert werden. Eine Gesamtlichtenergie von 100 J/cm² oder der Energiebereich, der für eine gegebene Verbindung angemessen gehalten wird, wird über 20 Minuten mit einer durchschnittlichen Laser-Leistungseinstellung von 3–5 Watt oder der Wattzahl und Zeit, die für eine gegebene Verbindung wirksam ist, an jedes Gelenk appliziert.
Sechs Tiere aus der experimentellen Gruppe und aus der Kontrollgruppe 2 und 4 Tiere aus der Kontrollgruppe 1 werden eine, zwei, vier und zehn Woche(n), nachdem der experimentellen Gruppe und Kontrollgruppe 1 die photodynamische Verbindung injiziert wurde, getötet. Nachdem die Tiere getötet wurden, werden Proben von der Synovialis, dem Gelenkknorpel, dem Meniskus und der Sehne entnommen und in Formalin fixiert. Die Proben werden dann in Paraffin eingebettet, Schnitte angefertigt, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und dann mikroskopisch auf Entzündungsanzeichen, Narbenbildung und Nekrose untersucht.
Es wird erkannt werden, dass spezifische Modifikationen hinsichtlich der Dosierung, des Zeitpunkts, der Lichtwellenlänge und Dauer für jede getestete therapeutische Verbindung notwendig sein können. Diese allgemeinen Parameter sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und sind teilweise in den folgenden hierin angeführten Arbeiten und Referenzen zusammengefasst, die unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit inkorporiert sind: Gomer, J. Photochem. Photobiol. 54: 1093–1107, 1991; Maziere et al., J. Photochem. Photobiol. 8: 351–360, 1991; Allison et al., Photochem. Photobiol. 54: 709–715, 1991; Allison et al., Photochem. Photobiol. 52: 501–507, 1990; Poon et al., J. Neurosurg. 76: 679–686, 1992; Reddi et al., Br. J. Cancer 61: 407–411, 1990; Richter et al., Br. J. Cancer 63: 87–93, 1990.
Dieses Protokoll erlaubt dem Arzt mit der Pathologie Folgendes zu dokumentieren: (1) die Fähigkeit einer photoaktivierbaren Verbindung, zum Beispiel Entzündung am Gelenk und (2) die nicht schädlichen Wirkungen einer aktivierten photodynamischen Verbindung auf den Gelenkknorpel, Meniskus und andere periartikulären Gewebe zu bewirken.
Zur Dokumentation von (1) werden Synovialproben aus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung beendeter Tiere fixiert, in Paraffin eingebettet, mit einem histologischen Farbstoff gefärbt und mikroskopisch untersucht. Zur Dokumentation von (2) wird mit Proben von Gelenkknorpel, Meniskus, Sehne und Muskel das gleiche Verfahren befolgt. Makroskopische Beobachtungen zum Zeitpunkt der Entnahme sollten auch notiert werden. Eine Entzündung des Knies zum Zeitpunkt der Lichtapplikation wird klinisch untersucht und aufgezeichnet. Eine Testverbindung, die zum Beispiel die Entzündung des Gelenks oder die Produktion proteolytischer Enzyme durch Chondrozyten ohne gleichzeitige schädliche Wirkungen auf den Gelenkknorpel, Meniskus und andere periartikuläre Gewebe ablatiert oder verringert, könnte eine nützliche Verbindung für die PDT der Osteoarthritis darstellen.
Die folgenden Beispiele sind zur erfindungsgemäßen Erläuterung beabsichtigt.
IV. BEISPIELE
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Chondrozytenisolation. Die Chondrozyten wurden durch etablierte Kollagenaseaufschlussverfahren gewonnen. Der Gelenkknorpel wurde aseptisch von den Femurkondylen und Patellen von Kalbskniegelenken präpariert. Von Kondylenoberflächen abgeschabtes Material wurde fein zermahlen und über Nacht bei 37°C mit Kollagenase 1 mg/ml (Typ II; 355 E/mg Trockengewicht (TG) und Hyaluronidase 0,1 mg/ml (1060 USP/NF Einheiten/mg TG) (Worthington Biochemicals, Inc., Freehold, NJ) in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Mediatech, Herndon, VA) ergänzt mit 20 mM HEPES, 100 E/ml Penicillin G, 100 μg/ml Ascorbinsäure (serumfreies TCM) aufgeschlossen. Die resultierenden Zellsuspensionen wurden durch ein Zellsieb filtriert und zweimal mit serumfreiem TCM gewaschen. Die Zellen wurden im gleichen Medium, enthaltend 5% hitzeinaktiviertes fötales Kalbserum (BioWhittaker, Walkerville, MD) (FCS-TCM) zum Ansetzen einer Kultur resuspendiert. Die Zellzahl wurde unter Verwendung eines Hämocytometers bestimmt. Die Zelllebensfähigkeit, die mittels Trypanblau-Exklusion bestimmt wurde, war für alle Präparationen größer als 99%. Die Zellen wurden bei einer Dichte von 1,5 × 10⁶ Zellen/ml in Falcon-Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) für die Cytotoxizitäts- und Zellproliferationsexperimente und in Falcon-Zellkulturplatten mit 6 Vertiefungen für die Aufnahmestudien des Photosensibilisators ausplattiert. Die Chondrozytenkulturen wurden bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO₂ für eine Woche vor der Initiierung der Photosensibilisierungsstudien aufrechterhalten.
Photosensibilisierungsstudien. Photofrin^® (PF) und Benzoporphyrin-Derivate (BPD-MA) wurden von Quadralogic Technologies (Vancouver, Kanada) erhalten. Chlorin e6 (Ce6) und Chloraluminiumphthalocyanin (CASP) wurden von Ciba Geigy (Basel, Schweiz) und die Porphyrin-Produkte von Logan, UT erhalten. Alle Photosensibilisatoren wurden den Chrondrozyten im Dunkeln 3 Stunden vor der Lichtexposition ausgesetzt. Die Stammlösungen des Photosensibilisators wurden sofort vor jedem Experiment hergestellt; Reihenverdünnungen wurden unter Verwendung von FCS-TCM hergestellt. Alle Bestrahlungen wurden bei den entsprechenden Anregungswellenlängen für jeden Photosensibilisator (BPD-MA 690 nm; Ce6 658 nm; CASP 680 nm; PF 624 nm) unter Verwendung von Licht, das von einem Argon-Ion gepumpten Farbstofflaser (Coherent, Palo Alto, CA) bereitgestellt wurde, durchgeführt. Nach der Lichtexposition wurden die Kontrolle und bestrahlten Zellen 72 Stunden vor der Beurteilung der Zelllebensfähigkeits- und Proliferationsraten aufrechterhalten. Die Zellen wurden täglich mit dem Lichtmikroskop auf morphologische Veränderungen untersucht.
Screening-Studien zur Toxizität bestimmten den Bereich der Dosen und der Lichtresponse für jeden Photosensibilisator. Diese prädeterminierten Bereiche wurden für alle die beschriebenen Studien verwendet. Für CASP wurde keine Dosiswirkung gesehen. Dosierungen größer als 50 μg/ml wurden als nicht klinisch relevant erachtet, und ein Dosisbereich, der sich auf 50 μg/ml erstreckt, wurde für diese Studien gewählt.
Cytotoxizitätsassays. PDT-induzierte Cytotoxizität wurde 72 Stunden nach der Bestrahlung bestimmt. 3-(4,5-Diemethylthiazol-2yl)-2-5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde für die Bestimmung der Zelllebensfähigkeit verwendet (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55–63, 1983). MTT wird über mitochondriale Dehydrogenase-Enzyme zu einem Formazanfarbstoff metabolisiert, der spektrophotometrisch gemessen werden kann.
Cytotoxizität wird als der prozentuale Anteil von gebildetem Formazan in Zellen, die mit sichtbarem Licht verschiedener Wellenlängen und Intensitäten relativ zu Kontrollzellen (Kontrolle (%)) behandelt wurden, ausgedrückt. Die Daten werden als der Mittelwert ± SEM von Experimenten in Dreifachbestimmung ausgedrückt.
Zellproliferationsassays. Die Zellproliferation wurde mittels [³H]-Thymidin-Inkorporation für alle Chondrozytenkulturen 72 Stunden nach dem Arzneimittel und/oder der Lichtexposition bestimmt. Die Zellkulturen wurden mit 5 μCi/ml [³H]-Thymidin (35 Ci/mmol) (ICN, Irvine, CA) in FCS-TCM markiert. Nach der 20-stündigen Inkubation wurde das radioaktive Medium entfernt, und die Zellen wurden dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zur Entfernung der nicht inkorporierten Markierung gespült. Die Zellen wurden dann mit Puffer, enthaltend 150 mM Tris pH 8,0, 200 mM Natriumchlorid, 10% Triton X-100 und 1% SDS lysiert. Die [³H]-Thymidin-Inkorporation wurde durch Flüssig-Szintillationsverfahren bestimmt, und die Daten werden als Mittelwert der Kontrolle (%) ± SEM der bestrahlten Proben ohne Zufügen von Photosensibilisator bestrahlt.
Zell-Imaging: Direkte Immunfluoreszenz (konfokale Mikroskopie). Deckgläser aus Glas wurden mit 20 μg/ml Fibronektin (Collaborative Biomedical Research Corp., Bedford, MA) bei 4°C über Nacht beschichtet. 1,5 – 3 × 10⁶ Chondrozyten wurden auf die mit Fibronektin beschichteten Deckgläser geimpft, die 2 Stunden bei 37°C vor der 15-minütigen Inkubation mit 10 μM Rhodamin aufrechterhalten wurden.
Die Zellen wurden 5 Minuten mit 2% Formalin fixiert und auf histologische Objektträger aufgezogen. Die Rhodaminfluoreszenz wurde unter Verwendung eines Epifluoreszenz-Beleuchtungsmikroskops unter 40X und 100X Vergrößerungen (Axiophot, Zeiss, Oberkochen, Deutschland) untersucht. Die Fluoreszenzbilder resultierten aus der Rhodamin-Anregung unter Verwendung eines Bandpassfilters von 545 nm zur Anregung und eines Bandpassfilters von 625 nm zur Emission.
Lichtmikroskopie. Die Zellen wurden täglich mittels Lichtmikroskopie untersucht. Bei den aufgezeichneten morphologischen Veränderungen handelte es sich um Zelldifferenzierung, Membran-Blebbing und zelluläre Trypanblau-Exklusion.
Aufnahmestudien mit dem Photosensibilisator. Gelenkchondrozyten wurden fünf Tage nach der Plattierung in Primärkultur aufrechterhalten. Die Stammlösungen des Photosensibilisators wurden in Reihe in FCS-TCM verdünnt und den Vertiefungen in Dreifachbestimmung zugefügt. Die Zellen wurden 3 Stunden im Dunkeln inkubiert. Die den Photosensibilisator enthaltende FCS-TCM wurde dann entfernt, und die Zellen wurden mit 1 ml PBS gespült. Zum Aufschluss der extrazellulären Matrix wurden die Zellen dann in 1 ml einer Lösung aus 1 mg/ml Kollagenase und 0,1 mg/ml Hyaluronidase in serumfreiem TCM eingetaucht. Die resultierenden einzelnen Zellsuspensionen wurden in Mikrofugenröhrchen überführt und 5 Minuten bei 3,3 × g zentrifugiert. Die Kollagenase-Lösung wurde entfernt, und die Zellen wurden dreimal mit Calcium/Magnesium-freier PBS gespült. Vor der Zelllyse mit 1 ml 0,1 N NaOH, enthaltend 1% SDS, wurden Aliquote zur Zellzählung entnommen. Die Zellzählung wurde mittels eines Hämocytometers und Coulter-Zählers durchgeführt. Die Fluoreszenzspektren der Zelllysate wurden unter Verwendung eines Spex FluoroMax-Spektrofluorometers (ISA Instruments, Edison, NJ) bei den entsprechenden Anregungs-/Emissionswellenlängen für jeden der vier untersuchten Photosensibilisatoren erhalten. Die Fluoreszenzspektren wurden für Hintergrundfluoreszenz bereinigt. Die relativen Aufnahmewerte wurden durch Regressionsanalyse von Standardkurven bekannter Photosensibilisator-Konzentrationen erhalten. Die Konzentration in den Kulturen, bei der jeder Photosensibilisator die Chondrozytenproliferation (d. h. [³H]-Thymidin-Inkorporation) um 50% (IC₅₀) inhibierte, wurde von Auftragungen der relativen Proliferation (ausgedrückt als ein Prozentwert der Kontrolle) versus der Konzentration des Photosensibilisators in der Kultur berechnet. Die Aufnahmewerte bei der IC₅₀ sind als fg/Zelle ersichtlich. Das durchschnittliche Protein pro Zelle wurde aus den Zellzahlen und der durch den Protein-Assay nach Lowry bestimmten Proteinkonzentration berechnet.
Gelatinezymographie. Aliquote des konditionierten Mediums wurden mit 1 ml Aceton gemischt und 16–20 Stunden bei –20°C aufrechterhalten. Die Aliquote wurden 15 Minuten bei 14 000 × g mikrozentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und das präzipitierte Protein wurde in einem Vakuumkonzentrator (Savant, Farmingdale, NY) zur Entfernung des restlichen Acetons getrocknet. Konditionierte Mediumproben wurden mit Probenpuffer (0,4 M Tris pH 6,8, 5% SDS, 20% Glycerol, 0,003% Bromphenolblau) gemischt und direkt, ohne Kochen oder Reduktion, auf 10% Acrylamidgele, enthaltend 1% Gelatine, appliziert. Nach der Entfernung von SDS aus dem Gel durch Inkubation in 2,5% Triton X-100 für eine Stunde bei Raumtemperatur wurden die Gele 16–18 Stunden bei 37°C in Puffer, enthaltend 50 mM Tris pH 7,6, 0,2 M NaCl, 5 mM CaCl₂ und 0,02% Brij 35 inkubiert. Die Gele wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur in 30% Methanol/10% Essigsäure, enthaltend 0,5% Coomassieblau R-250, gefärbt und in der gleichen Lösung ohne Farbstoff entfärbt. Die gelatinolytische Aktivität der Proteine wurde durch klare Banden gegen den blauen Hintergrund der gefärbten Gelatine nachgewiesen.
BEISPIEL 1. STUDIEN ZUR PDT-EFFIZIENZ UNTER VERWENDUNG MEHRERER KLINISCH RELEVANTER PHOTOSENSIBILISATOREN
Wirkungen des Photosensibilisators auf die Chondroryten-Morphologie. Im Hellfeld und auf den entsprechenden Rhodamin-Fluoreszenzbildern von Gelenkchondrozyten, die auf Fibronektin-beschichtete Deckgläser plattiert wurden, wiesen die Zellen eine insgesamt polygonale bis sphäroide Morphologie auf und bildeten konfluente Monolayers in der Primärkultur. Die Zelldichte betrug 70–80% Konfluenz. Beim Plattieren wies die Färbung der Zellen mit 10 μM Rhodamin darauf hin, dass > 99% der Zellen metabolisch aktiv waren. Die subzelluläre Verteilung von Rhodamin als helle, diskrete, punktförmige Fluoreszenzregionen außerhalb der Nuklei deutete auf eine mitochondriale Lokalisierung hin. Dedifferenzierung trat in 5–10% von Kontrollzellen über die siebentägige Protokollperiode auf.
Fluoreszenz der Photosensibilisatoren in Chrondrozyten. Die zellulären und subzellulären Fluoreszenzmuster, wie anhand der konfokalen Mikroskopie bestimmt, variierten unter den bewerteten Photosensibilisatoren. Die stärksten Fluoreszenzsignale wurden mit BPD-MA beobachtet, die diffuse zytoplasmatische Fluoreszenz für alle untersuchten Arzneimittelkonzentrationen nachwiesen. Es wurde keine Kern- oder Membranfärbung beobachtet. Die Fluoreszenz trat gleichmäßig in beiden differenzierten und dedifferenzierten Chondrozyten auf. Für Ce6 wiesen die Zellen erhöhte Niveaus cytoplasmatischer Fluoreszenz auf, die hinsichtlich der Intensität und Verteilung mit BPD-MA vergleichbar war. Mit PF behandelte Zellen wiesen eine ähnliche cytoplasmatische Verteilung, aber niedrigere Fluoreszenzniveaus als BPD-MA auf. Eine Photosensibilisator-Aufnahme wurde nur in differenzierten Chondrozyten beobachtet. Eine minimale CASP-Fluoreszenz wurde bei den untersuchten Arzneimittelkonzentrationen beobachtet; Fluoreszenz bei der höchsten Arzneimittelkonzentration über den Baseline-Niveaus der cytoplasmatischen Autofluoreszenz war schwer sichtbar zu machen.
Photosensibilisator-Wirkungen auf die Zelllebensfähigkeit und -proliferation. Die Bestrahlung von Chrondrozytenkulturen mit Lichtdosierungen bis zu 10 J/cm² in der Abwesenheit von Photosensibilisator bei allen Wellenlängen führte zu keiner Abnahme der Zelllebensfähigkeit. In Anwesenheit eines Photosensibilisators löste die Behandlung von Chondrozytenkulturen mit 1, 5 oder 10 J/cm² Licht allgemeine dosisabhängige Abnahmen der Zelllebensfähigkeit aus (1A–1D). Für BPD-MA (1A) und Ce6 (1B) trat die Sättigung der Toxizitätswirkungen im Lichtdosisbereich von 5 bis 10 J/cm² und für PF (1C) bei 10 J/cm² auf. Für CASP wurden im untersuchten Bereich keine Sättigungswerte beobachtet (1D). BPD-MA produzierte die meisten toxischen Responses in den Chondrozytenkulturen. Bei BPD-MA-Konzentrationen, die über 0,1 μg/ml hinausgingen, nahm die Zelllebensfähigkeit für Bestrahlungen von 5 oder 10 J/cm² Licht um 80% und für 1 J/cm² Licht um 60% ab. CASP war für Gelenkchondrozyten minimal toxisch. Die Bestrahlung von Zellen mit 1, 5 oder 10 J/cm² Licht in Anwesenheit von 5 μg/ml CASP schwächte die Zelllebensfähigkeit um weniger als 20% ab. Die Exposition von Zellen gegenüber mehr als 6 μg/ml Ce6 und 5 oder 10 J/cm² Licht verminderte die Lebensfähigkeit um ca. 50%. Für PF-Konzentrationen größer als 12,5 μg/ml produzierte die Bestrahlung von Zellkulturen mit 1 J/cm² Licht weniger als eine 10%ige Abnahme der Zelllebensfähigkeit, während Bestrahlungen bei den höheren Fluenzen die Zelllebensfähigkeit um nahezu 70% verminderten.
Alle Photosensibilisatoren lösten eine dosisabhängige Inhibitor-Response auf die mittels [³H]-Thymidin-Inkorporation bestimmte Zellproliferationsraten aus (2). BPD-MA produzierte die größten toxischen Wirkungen (IC₅₀ = 50,3 ng/ml) relativ zu Ce6 (IC₅₀ = 4,4 μg/ml) und PF (IC₅₀ = 9,3 μg/ml). Es wurde festgestellt, dass CASP am wenigsten toxisch war. Bei der untersuchten höchsten CASP-Konzentration, 50 μg/ml, wurde die [³H]-Thymidin-Inkorporation nur 25% reduziert. Die durch [³H]-Thymidin-Inkorporation bestimmten photosensibilisierenden Potenziale korrelierten mit den Ergebnissen vom MTT-Assay.
Photosensibilisator-Aufnahmestudien. Die Photosensibilisator-Aufnahme erhöhte sich linear über den für alle Photosensibilisatoren untersuchten Dosisbereich nach einer dreistündigen Inkubationsperiode. Bei den IC₅₀-Konzentrationen wiesen BPD-MA die niedrigste relative Aufnahme auf. Eine höhere Aufnahme wurde für Ce6 beobachtet, die deutlich geringer als für CASP und PF war (Tabelle 2).
Tabelle 2. In-vitro-Aufnahme von Photosensibilisatoren durch Chondrozyten
Zymographie-Studien. Die PDT-Wirkungen auf die Modulation der Metalloproteinase-Aktivität (MMP2- und MMP9-Aktivität), wie anhand der Zymographie bestimmt, variierte mit dem verwendeten Photosensibilisator, den applizierten Lichtdosen und der Arzneimittelkonzentration. Für BPD-MA und PF nahm die MMP2-Produktion als eine Funktion der Zellabtötung ab. Bei den IC₅₀-Dosen wurde die MMP2-Produktion um ca. 50% reduziert und bei einer hochtoxischen Dosis war die Produktion nicht nachweisbar.
Für Ce6 waren die MMP2-Produktion und MMP9-Produktion bei für die Chondrozyten nicht toxischen PDT-Parameterkonzentrationen reduziert. Bei hohen Dosisraten traten entsprechend größere Abnahmen der MMP-Produktion auf. Bei der IC₅₀-Dosis nahm die MMP2-Produktion um > 95% ab. Die Gesamtproteinkonzentration variierte nicht mit den MMP-Werten.
Für die getesteten CASP-Parameter wurde mittels der MTT-Produktion und [³H]-Thymidin-Inkorporation keine Abnahme der Zelllebensfähigkeit beobachtet. Signifikante Reduktionen der MMP2-Konzentrationen wurden mittels der Zymographie registriert. Bei Arzneimittelkonzentrationen größer als 0,2 μg/ml und einer Lichtdosis von 10 J/cm² nahmen die MMP2-Konzentrationen um 25% ab. Bei einer Arzneimittelkonzentration von 3,12 μg/ml mit einer Lichtdosis von 10 J/cm² (Bedingungen, unter denen keine Abnahme der Zelllebensfähigkeit beobachtet wurde), wurde eine vollständige Reduktion der MMP2-Konzentrationen beobachtet.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Befunde der verminderten MMP-Produktion und [³H]-Thymidin-Inkorporation nach der photodynamischen Behandlung der Zellen auf das Potenzial zur photochemischen Modulation des Krankheitsprozesses bei Osteoarthritis hinweisen. Außer den entzündungshemmenden Wirkungen auf die entzündete Synovialis, können photochemische Behandlungen zur Verzögerung der biologischen Progression der Erkrankung, wie zum Beispiel durch Metalloproteinase-Enzyme vermittelt, verwendet werden. Das in diesem Beispiel beschriebene Verfahren kann zum Testen einer breiten Reihe verschiedener photoaktivierbarer Verbindungen, wie zum Beispiel den in Tabelle 1 gezeigten, zur Verwendung bei der Behandlung von Osteoarthritis verwendet werden.

Claims

In-vitro-Verfahren zum Testen der Fähigkeit einer photoaktivierbaren Verbindung zur Verminderung der Konzentration eines von Chondrozyten gebildeten Abbauenzyms, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Kontaktieren der Chondrozyten mit einer photoaktivierbaren Testverbindung oder einem Präkursor davon; (b) Verabreichung von Licht einer photoaktivierbaren Wellenlänge zur Aktivierung der photoaktivierbaren Testverbindung; und (c) Bestimmung, ob die Konzentration des von den Chondrozyten gebildeten Abbauenzyms vermindert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Abbauenzym Metalloproteinase 2 oder Metalloproteinase 9 darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die unter (a) und (b) ausgewählten Parameter so ausgewählt sind, dass sie für Chondrozyten nicht toxisch sind.
Verwendung einer photoaktivierbaren Verbindung oder eines Präkursors davon bei der Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer osteoarthritischen Erkrankung, worin die Verbindung gemäß einem Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche ausgewählt ist und an einen Patienten verabreicht und durch Licht einer photoaktivierenden Wellenlänge aktiviert werden soll, worin die Menge der therapeutischen Zusammensetzung und die Menge des verabreichten Lichtes zur Reduktion des Grades der osteoarthritischen Erkrankung beim Patienten ausreichend sind.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die photoaktivierbare Verbindung ausgewählt ist aus: 1. Photofrin, einem halbgereinigten Hämatoporphyrin-Derivat; 2. synthetischen Diporphyrinen und Dichlorinen; 3. Hydroporphyrinen, wie zum Beispiel Chlorinen und Bakteriochlorinen der Tetra(hydroxyphenyl)porphyrin-Reihe; 4. Phthalocyaninen (PC); mit oder ohne Metallsubstituenten; z. B. Chloraluminiumphthalocyanin (CASP) mit oder ohne variierenden Substituenten; 5. o-substituierten Tetraphenylporphyrinen, (picket-fence-Porphyrinen): 6. 3,1-meso-Tetrakis(o-propionamidophenyl)porphyrin; 7. Verdinen; 8. Purpurinen; Zinn- und Zinkderivaten von Octaethylpurpurin (NT2) Etiopurpurin (ET2) 9. Chlorinen, Chlorin e6, Mono-1-aspartyl-Derivat von Chlorin e6, Di-1-aspartyl-Derivat von Chlorin e6 10. Benzoporphyrin-Derivaten (BPD), Benzoporphyrin-Monosäure-Derivaten, Tetracyanoethylen-Addukten von Benzoporphyrin, Dimethylacetylen-dicarboxylat-Addukten von Benzoporphyrin, Diels-Alder-Addukten, Monosäurering-„A"-Derivat von Benzoporphyrin; 11. sulfoniertem Aluminium-PC, sulfoniertem ALPc, disulfoniertem (ALPcS₂), tetrasulfoniertem Derivat, sulfonierten Aluminium-Naphthalocyaninen; 12. Naphthalocyaninen, mit oder ohne Metallsubstituenten, mit oder ohne variierenden Substituenten; 13. Anthracendionen; 14. Anthrapyrazolen; 15. Aminoanthrachinon; 16. Phenoxazin-Farbstoffen; 17. Phenothiazin-Derivaten; 18. Chalkogenapyrylium-Farbstoffen, kationischen Selena- und Tellurapyrilium-Derivaten; 19. Ring-substituiertem kationischem PC; 20. Pheophorbid-Derivat; 21. Hämatoporphyrin (HP); 22. anderen natürlich vorkommenden Porphyrinen; 23. 5-Aminolävulinsäure und anderen endogenen metabolischen Präkursoren; 24. Benzonaphthoporphyrazinen; 25. kationischen Imminiumsalzen; und 26. Tetracyclinen.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die photoaktivierbare Verbindung ein Hämatoporphyrin-Derivat darstellt.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die photoaktivierbare Verbindung ein Benzoporphyrin-Derivat darstellt.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die photoaktivierbare Verbindung ein Produkt der Aminolävulinsäure (ALA) darstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, worin die therapeutische Zusammensetzung systematisch abgegeben wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, worin die therapeutische Zusammensetzung lokal an den Bereich des Gelenkes abgegeben wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 10, worin das Licht direkt an das Gelenk verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 10, worin das Licht unter Verwendung eines arthroskopischen Instrumentes verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 10, worin das Licht unter Verwendung eines Faseroptik-Instrumentes verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 10, worin das Licht extern auf das Gelenk verabreicht wird, wobei die periartikuläre Struktur des Gelenks transilluminiert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 14, worin das Licht von einer Laser-Lichtquelle bereitgestellt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 14, worin das Licht von einer Nichtlaser-Lichtquelle bereitgestellt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 14, worin sich das Licht von einer Breitbandlichtquelle herleitet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 17, worin der Patient ein Mensch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 17, worin der Patient aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Katze, einem Hund, einem Kaninchen, einem Pferd, einer Kuh, einem Schaf und einer Ziege.