KR101265525B1

KR101265525B1 - 광역학적 치료를 통한 결핵균 활성 억제 방법

Info

Publication number: KR101265525B1
Application number: KR1020100112761A
Authority: KR
Inventors: 전상훈
Original assignee: 서울대학교병원 (분사무소)
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2013-05-21
Also published as: KR20120051361A

Abstract

본 발명은 광역학적 치료를 통한 결핵균, 즉 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 활성 억제 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 광감작제와 광선을 이용한 광역학적 테라피를 이용하여 결핵 질환을 유발하는 것으로 알려진 마이코박테리움 투베르쿨로시스를 파괴하고, 그 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 내성을 가지지 않은 기존 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주 뿐 만 아니라 기존의 결핵약으로 활성을 억제하기 어려운 것으로 알려진 다약제 내성 결핵균의 효과적인 활성 억제 방법을 제공함으로서, 기존의 결핵 질환을 비롯하여, 슈퍼 결핵 질환의 치료를 가능하게 한다는 효과가 있다.

Description

광역학적 치료를 통한 결핵균 활성 억제 방법{Method for inhibiting activity of Mycobacterium tuberculosis by photodynamic therapy}

본 발명은 광역학적 치료방법을 이용하여, 다제내성(multidrug resistant) 결핵균 또는 광범위 내성(extremely drug resistant) 결핵균의 활성을 억제할 수 있는 방법에 관한 발명이다.

결핵은 결핵균으로 알려진 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)로 인해 유발되는 인류 역사상 가장 많은 생명을 앗아간 감염성 질환이다. 결핵은 개발도상국 국민의 생존을 위협하는 주요 질병일 뿐 아니라 최근 선진국에서도 그 문제성이 증가하고 있으며, 전 세계적으로 매년 약 8백만건이 발생하여 약 3백만명이 사망한다. 또한 최근 AIDS 환자에게서 결핵의 발병율이 높은 것으로 나타나, AIDS가 결핵의 새로운 유포원으로 알려져 그 심각성이 더해지고 있다. 결핵은 초기에는 특별한 증상이 없는 경우가 많으나 병이 진행함에 따라 기침, 가래, 전신 피로감, 오후에 나는 미열, 식은땀, 체중 감소, 객혈 등의 증세가 나타나고, 치료하지 않으면, 심각한 합병증을 초래하고 결국 사망에 이르게 된다.

결핵의 치료를 위해서는, 항생제 등을 이용하여 최소한 6개월 이상의 장기적이고 중단 없는 규칙적인 약물 복용이 필요하다. 이런 오랜 기간의 약물 투여로 인하여 약물에 대한 내성, 위장관 장애, 간에 대한 부작용, 피부 발진, 발열 등의 전신 증상이 나타나며, 리팜핀의 경우에는 혈소판 감소, 에탐부톨의 경우에는 시력 감퇴, 적록색을 구분 못하는 등의 부작용, 피라지나마이드 경우에는 혈중 요산의 증가로 의한 관절의 통증을 유발할 수 있어 문제가 되고 있다.

특히, 근래에 대부분의 항생물질에 내성이 있는 ‘슈퍼박테리아'에 대한 세계적인 관심이 증가하는 가운데 지난해 국내에서 상당수의 치료제가 듣지 않는 ‘슈퍼결핵’으로 진료를 받은 환자가 3천명에 육박한 것으로 나타났다. 건강보험심사평가원이 발행한 항생물질 내성균 감염원 진료환자 자료에 따르면 지난해 슈퍼결핵인 “다제내성 결핵”과 “광범위 약제내성 결핵”으로 병원에서 진료를 받은 환자는 모두 2천717명이었다. 이는 건보심사평가원이 슈퍼결핵 등에 대한 통계를 내기 시작한 2008년(2천330명)에 비해 16.6%가 증가한 수치다. 종류별로는 다제내성 결핵이 2천494명, 광범위 약제내성 결핵이 223명이었으며 성별로는 남성이 1천760명으로 여성(957명)보다 1배가량 더 많았고, 30∼40대 환자가 가장 많은 것으로 집계됐다. 다제내성 결핵은 1∼2차 결핵 치료제 중 1차 치료제(리팜핀 등)에 내성을 보이는 결핵이며, 광범위 약제내성 결핵은 2차 치료제(퀴놀론계열 의약품)에도 내성이 있는 질병으로, 국내외 연구자료 등에 따르면 두 결핵의 치사율은 각각 26%, 50% 정도에 이르는 것으로 알려져, 과거 1950년대 공포의 대상이었던 결핵이 새로운 형태로 국내는 물론 전세계적으로 인류 건강을 위협하는 질병으로 평가받고 있다.

이에, 다양한 결핵 항생제에 내성을 가진 마이코박테리움 투베르쿨로시스로 인해 유발되는 슈퍼 결핵에 대한 새로운 치료방법이 절실히 요구되는 실정이다.

이에 본 발명자들은 결핵균, 즉 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)로 인해 유발되는 기존 결핵 뿐 만 아니라, 약제 내성으로 인해 유발되는 다제내성 결핵과 광범위 약제내성 결핵의 활성을 광감작제 및 광선의 조사를 통한 광역학적 치료법을 이용하여 억제할 수 있음을 최초로 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 결핵 질환을 치료할 수 있도록, 세포에 광감작제를 처리하는 단계 및 상기 광감작제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 단계를 포함하는 결핵균 활성 억제방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인간을 제외한 포유동물에 광감작제를 투여하는 단계 및 인간을 제외한 포유동물의 병변부위에 상기 광감작제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 단계를 포함하는 결핵 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포에 광감작제를 처리하는 단계 및 상기 광감작제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 단계를 포함하는 결핵균 활성 억제방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감작제는 라다클로린(Radachlorin) 또는 DH-I-180-3 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광선은 90~110mw/cm²의 플루언스율로 조사될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광선은 400~800초 동안 조사될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광선의 에너지 밀도는 20~30J/cm²일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감작제는 5~15㎍/ml의 농도로 처리될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 결핵균은 다약제 내성을 갖는 결핵균 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 결핵균은 다제내성 결핵균 또는 광범위 내성 결핵균일 수 있다.

나아가, 본 발명은 인간을 제외한 포유동물에 광감작제를 투여하는 단계 및 인간을 제외한 포유동물의 병변부위에 상기 광감작제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 단계를 포함하는 결핵 치료방법을 제공한다.

본 발명에 따른 결핵균 활성 억제방법은 광감작제와 광선을 이용한 광역학적 테라피를 이용한 방법으로서, 특히 기존의 결핵약으로 활성을 억제하기 어려운 것으로 알려진 다제내성 결핵균 또는 광범위 내성 결핵균(마이코박테리움 투베르쿨로시스, Mycobacterium tuberculosis)에 효과적인 활성 억제 방법을 제공한다. 따라서 기존의 결핵 질환을 비롯하여, 슈퍼 결핵균으로 인한 결핵 질환의 치료를 가능하게 한다는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 광역학적 치료시 내성을 보이지 않는 결핵균(M. tuberculosis)의 광역학적 불활성 양상을 나타낸 그래프이다.
도 2는 여러 조건 하에서의 광역학적 치료시 내성을 보이지 않는 결핵균(M. tuberculosis)의 불활성 모습을 나타낸 그래프이다.
도 3은 광감작제(RD)를 이용한 광역학적 치료시 다제내성 및 광범위 내성 결핵균(MDR-/XDR-M. tb strains)의 광역학적 불활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 여러 조건 하에서의 광역학적 치료시 다제내성 및 광범위 내성 결핵균(MDR-/XDR-M. tb strains)의 불활성 모습을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 광감작제를 이용한 광역학적 치료법이 결핵균, 즉 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 균주의 활성을 억제하는 효과가 있음을 최초로 규명하였는바, 세포에 광감작제를 처리하여 광감작제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 결핵균 활성 억제방법을 제공함에 그 특징이 있다.

결핵 질환은 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)라는 결핵 병원체의 감염으로 인해 발생되며, 주로 폐로 들어가 염증을 일으켜 폐결핵의 형태로 발병되는 경우가 많으나 골결핵이나 피부결핵 등 다른 장기에 감염되어 염증을 일으키기도 한다.

마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 균주는 현재 인형균(人型菌), 우형균(牛型菌), 서형균(鼠型菌), 조형균(鳥型菌) 및 냉혈동물의 결핵균으로 분류되며, 보통 길이 1.2~4.0μm, 폭 0.3~0.5μm 정도의 간균(桿菌)으로, 가늘고 길죽하며 약간 만곡해 있는데, 작은 덩어리를 이루거나 울타리 모양으로 늘어서 있는 경우가 많다. 한국에서의 결핵 질환은 대부분 인형균에 의한 것으로 개에게 감염되는 경우도 많은 것으로 알려져 있다. 한국에서는 우형균에 의한 사람의 결핵은 극히 드물지만, 구미에서는 우형균에 의한 것도 있다고 한다.

일반적으로 "광역학적 치료(PDT)"또는 "광역학적 처리"는 지금까지 일반적으로 항암 요법으로 널리 사용되어온 치료법으로, 광감작제(photosensitizer)를 종양조직에 투여한 후 특정 파장의 광원(보통 비열 레이저(non-thermal laser)에 의해 생산됨)에 노출시킴으로서(Gomer et al, 1989), 고형종양의 세포고사(apoptosis) 및 괴사(necrosis)를 유도하는 처리 또는 치료법을 말한다(Gomer et al, 1989). 광감작제 및 광원에 의해 유도된 광화학 반응이 단일항 산소(singlet oxygen)와 같은 활성 산소종(reactive oxygen radical, ROS)을 생산하고, 이는 교대로 세포내 표적(세포막, 기관, 효소 또는 DNA)에 산화적 손상을 유도한다(Korbelik et al, 2004). 광역학적 처리는 다양한 고형 종양(식도, 기관지, 방광, 뇌, 눈, 머리/목, 피부, 경부) 또는 황반 변성 및 건선 등의 비악성 질환을 치료하는데 사용되었다.

이에 본 발명자들은 최근 꾸준하게 환자 수가 증가하고 있는 결핵질환의 새로운 치료법 개발을 위하여 연구하던 중, 상기 광역학적 치료법이 결핵질환을 유발하는 것으로 알려진 결핵균, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 특히 다약제 내성을 갖는 결핵균의 활성을 효과적으로 억제하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 세포에 광감작제를 처리하는 단계 및 상기 광감작제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 단계를 포함하는 결핵균 활성 억제방법을 제공함에 특징이 있다.

본 발명의 광감작제를 처리하는 세포는 결핵균이 감염될 수 있는 모든 세포를 포함한다. 또한 본 발명의 광역학적 처리에 사용되는 상기 광감작제는 당해 분야에서 당업자에게 공지된 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들면, 헤마토포르피린 유도체(hematophorphyrin; HpD), 포토젬(Photogem), 틴 에티오퍼퓨린(tin etiopurpurin; SnET2), 모노-1-아스파틸 클로린 e6(mono-1-aspartyl chlorin e6; NPe6), DH-I-180-3, 벤조포피린 유도체(benzoporphyrin derivative; BPD), 메조-테트라-(하이드록시페닐) 클로린(meso-tetra-(hydroxyphenyl) chlorin; mTHPC), 5-아미노 레불린산(5-amino levulinic acid; ALA), 5-ALA-유도성 프로토포르피린 IX(5-ALAinduced protoporphyrin IX), 라다클로린(radachlorin), ALPcS4(aluminum tetrasulfophthalocyanine), TPPS(meso-tetra(sulphonatophenyl) porphine) 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되지는 않으나 보다 바람직하게는 라다클로린(radachlorin) 또는 DH-I-180-3을 본 발명에 따른 광감작제로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 결핵균을 파괴시키기 위한 효과적인 광역학적 처리를 위하여, 광감작제는 5 내지 15㎍/㎖의 농도로 대상이 되는 세포에 처리할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 10㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 광감작제를 처리한 후에는 세포에 처리된 광감작제를 활성화시키기 위한 광선을 조사해야 하는데, 바람직하게는 90~110mw/cm²의 플루언스율의 광선을 조사할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 플루언스율로 400~800초 동안 광선을 조사할 수 있다. 또한, 조사되는 광선의 에너지 밀도는 바람직하게는 20~30J/cm²일 수 있다. 그리고 조사되는 광선은 비간섭성(non-coherent) 램프 또는 간섭성 레이저에 의해 공급될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 100mw/cm²의 플루언스율의 레이저 광선을 500초 동안 조사하였다.

또한, 본 발명에 따른 결핵균 활성 억제방법은 기존의 결핵 치료제(Tuberculosis drug)에 내성을 가지지 않은 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis, 결핵균) 균주 뿐만 아니라, 기존의 한 가지 이상의 치료제에 내성을 가지는 다약제 내성 결핵균의 활성을 억제할 수 있다는 특징이 있다. 이는 구체적으로, 최근 문제시 되는 슈퍼 결핵의 원인 병원균으로 알려진, 다약제 내성 결핵균에 해당하는 다제내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Multidrug resistant(MDR) M. tb)을 비롯하여 광범위 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Extremely drug resistant(XDR) M. tb)의 활성 또한 억제할 수 있음을 의미한다.

일반적으로 결핵은 조기 발견과 치료를 통해 완치가 가능한 질병이다. 환자가 복용하는 초 치료 약제(first-line drug, 1차 치료제)인 아이소나이아지드(isoniazid, INH), 리팜핀(Rifampin, RIF), 스트렙토마이신(Streptomycin, SM), 피라진아마이드(pyrazinamide, PZA), 에탐부톨(Ethambutol, EMB)은 효력이 크지만 환자가 치료를 조기에 포기하거나 복약을 제때하지 않으면 치료가 어려운 내성을 일으킬 수 있다. 초 치료 약제에 부작용을 보이거나 내성이 생기면 아미카신(amikacin), 카프레오마이신(capreomycin), 시프로플록사신(ciprofloxacin) 등 약효가 적고 독성이 강한 재 치료 약제(second-line drug, 2차 치료제)를 처방한다.

대부분의 결핵환자는 초 치료 약제로 치료될 수 있으나, 약제를 불규칙하게 복용하거나 조기에 중단하는 등의 여건에 따라 사용 약제 내성이 유발될 수 있다. 또한, 상기의 결핵약제 뿐 만 아니라 그 밖의 결핵 치료제로 사용되고 있는 약제 중 하나 이상의 약제에 내성을 보이는 다약제 내성 결핵균이 발생하여 급격히 전파되고 있는 실정이다. 이러한 다약제 내성 결핵균은 기존의 치료제의 투여만으로는 치료될 수 없어 인류 생존을 크게 위협하고 있는 셈이다.

특히, 가장 강력한 결핵약제인 INH와 RIF에 동시 내성을 가진 결핵균을 일발적으로 다제내성 결핵균(Multidrug resistant(MDR)-Mycobacterium tuberculosis)이라고 명명하고, 이를 배균하는 환자를 다제내성 결핵환자라고 한다. 다제내성 결핵 질환의 세계적인 전파는 결핵을 퇴치하는데 매우 큰 위험 요인이 되고 있다(WHO, 2008). 다제내성 결핵환자의 경우 초 치료에서 제외된 약제로 재 치료를 실시할 수는 있으나 치료 효과가 낮고 부작용의 빈도가 높아 치료에 더욱 많은 시간을 요하므로 치료에 실패할 가능성이 높은 실정이다.

또한, 이러한 다제내성 결핵은 INH 및 RIF 이외의 추가 약제에 내성을 가진 극단적 혹은 광범위한 광역 내성(Extreme drug resistant(XDR))(Wright 등, 2006; Shah 등, 2007)을 초래하게 된다. 광범위 내성 결핵균(XDR-Mycobacterium tuberculosis)은 1차 치료제 뿐 만 아니라 퀴놀론 계열의 의약품인 2차 치료제에 까지도 내성을 가진 결핵균으로, 구체적으로는 플로로퀴놀론(fluoroquinolone) 중 적어도 1가지 약제와 항결핵 주사제(amikacin, kanamycin, capreomycin)중 적어도 한 가지 약제에 동시에 추가적인 내성을 보인 경우를 의미하여, 기존의 거의 모든 치료제가 효과를 나타내지 않아 더더욱 치명적이다.

현재 한국에서 처음 발생하는 폐결핵의 2.7%, 재발의 14%는 다제내성 결핵이다. 2008년에 2262명이 다제내성 결핵으로 치료 받았고, 지난해에는 6월까지만 쳐도 전년 동기 대비 58%가 증가한 1663명이 치료받았을 만큼 계속 그 수가 늘고 있다. 이중 사회 활동이 많아 남에게 전염시키기 쉬운 30대가 24%를 차지해 심각성이 더하다.

더욱이 다제내성 결핵은 대부분 다른 환자에게서 옮는다. 1명의 다제내성 결핵 환자가 평균 15명에게 병을 전염시킬 수 있다. 다제내성 결핵에 걸리면 주사제를 포함한 부작용이 심한 약을 2년 이상 처방 받고 심한 경우 폐를 잘라내는 수술을 해야 한다. 그래도 완치율이 60% 밖에 되지 않는다. 특히, 2차 항결핵 주사제와 퀴놀론계 약제에도 내성이 생긴 결핵인 광범위 내성 결핵균에 감염되면, 환자 절반이 3~7년 내 사망할 만큼 치명적이다.

급증하고 있는 결핵 질환의 치료를 위한 해결책으로서, 현재 다제내성 결핵균과 광범위 내성 결핵균에 대한 치료제는 현재 거의 전무한 상태이다. 이에 본 발명은 기존 결핵 치료제에 내성이 있는 결핵균을 파괴시키고, 효과적으로 그 활성을 억제할 수 있는 방법을 제공함으로서 궁극적으로 다약제 내성 결핵 질환(다제내성 결핵, 광범위 내성 결핵 질환)의 획기적인 치료법을 제공했다는 점에서 큰 의의가 있다.

즉, 본 발명에서는 광감작제를 결핵균이 존재할 것으로 예상되는 세포 부위에 도입하고, 충분한 시간이 경과한 후에, 적절한 세기의 광선을 조사하여, 광감작제를 활성화시키고 광역학 반응을 통해 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 파괴시킬 수 있다.

앞서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 광역학 처리방법이 결핵균의 활성을 억제할 수 있는지 조사하고자 하였으며, 기존 결핵약제에 내성을 가진 결핵균의 활성 또한 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다.

이에 본 발명의 일실시예에서는 국립마산 병원에서 폐결핵 환자에게서 분리한 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M.tb) 균주(결핵약제에 내성을 가지지 않은 결핵균, 다제내성 결핵균, 광범위 내성 결핵균)을 배양하고, 본 발명의 효과를 검증하기 위한 실험을 진행하였다(실시예 2 참조).

우선, 결핵약제에 내성을 가지지 않은 결핵균을 대상으로 이에 광감작제(라다클로린 또는 DH-I-180-3)을 처리한 후, 레이저를 조사한 결과 라다클로린 또는 DH-I-180-3를 처리하였을 때 모두 유의적이며 효과적인 결핵균 파괴 효과가 나타났다(도 1 참조). 또한, 방사선 조사 시간에 비례하여 결핵균의 활성이 억제됨을 확인하였으며(도 2 참조), 결핵균 파괴 정도에 따른 레이저 조사 시간의 최적 조건을 규명할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 기존 결핵약제에 내성을 가지는, 특히 다약제 내성 결핵균에 대한 본 발명의 효과를 분석하기 위하여, 본 발명에 따른 광역학적 처리에 의한 다제내성 결핵균과 광범위 내성 결핵균의 활성 억제 효과를 조사하였다. 그 결과, 광감작제를 처리한 후, 500초 동안의 레이저를 조사한 경우, 유의적으로 낮은 결핵균의 CFU 값을 통해 효과적으로 내성 결핵균의 활성이 억제됨을 확인하였다(도 3 참조). 또한, 내성 결핵균 파괴 정도에 따른 레이저 조사 시간의 최적 조건을 규명할 수 있었다(도 4 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 결핵을 일으키는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주가 결핵약에 대한 내성 여부를 불문하고, 다제내성 혹은 광범위 내성 결핵균임에 관계없이 본 발명에 따른 광역학적 처리 방법에 따라 그 활성이 탁월하게 억제된다는 사실을 확인할 수 있었다.

그러므로 본 발명에 따른 결핵균 활성 억제방법은 광역학적 처리를 통해 모든 결핵균의 활성을 탁월하게 억제시킬 수 있으며, 이를 통해 다양한 결핵 질환의 치료할 수 있다.

즉, 본 발명은 인간을 제외한 포유동물에 광감작제를 투여하는 단계 및 인간을 제외한 포유동물의 병변부위에 상기 광감작제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 단계를 포함하는 결핵 치료방법을 제공할 수 있다.

상기 “인간을 제외한 포유동물”은 결핵균에 감염되어 결핵 질환의 치료가 필요한 인간을 제외한 모든 포유동물을 의미하며, 개, 토끼, 소, 돼지 및 인간을 제외한 영장류 등을 모두 포함한다. 또한 결핵균이 감염된 부위를 “병변부위”라고 하며, 결핵균이 감염된 세포나 장기부위에 따라 광선을 조사하는 병변부위는 달라질 수 있다.

또한, 상기 결핵 치료방법에 있어서, 광감작제를 대상에게 투여하는 방법은 광감작제가 포함된 조성물이 정맥주사 등을 통해 전신에 적용되는 혈류 속으로 주입되거나, 감염이 특정 부위로 한정된다면 국소적으로 주입될 것이다. 피부 위 또는 주위 감염의 경우는 광감작제를 포함한 조성물이 국소적 투여를 위한 용액, 크림, 젤 또는 로션의 형태가 될 수 있다. 더불어, 광감작제의 투여 후 광선을 조사하는 바람직한 조사 시간은 광감작제가 충분히 활성화되기 위해 치료되는 신체 부위, 광감작제 투여 방법과 같은 개개의 요소에 따라 다양하게 변할 수 있다. 일반적으로 국소 적용을 위해, 이 시간은 최소한 5분 이상이 될 수 있다.

상기 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 결핵 질환 또는 결핵 질환의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 “치료”란 용어는 “치료하는”이 하기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 결핵 질환의 “치료”또는 “치료방법”은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 결핵질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 결핵질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 결핵질환을 경감시킴.

(4) 결핵질환의 재발을 예방함, 및

(5) 결핵질환의 증상을 완화함(palliating).

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주에의 다양한 광역학적 처리

본 발명자들은 광감작제를 이용한 광역학적 치료가 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis, M. tb) 균주의 활성을 억제하는 효과가 있는지 확인하기 위해, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis, M. tb) 균주를 배양한 후 광역학적 치료 방법으로 처리하였다.

국립마산 병원에서 폐결핵 환자에게서 분리한 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis, M.tb) 균주들은 37℃에서 3주 동안 Middlebrook 7H9 브로스 배지에 주입하여 10⁶ CFU/ml 정도로 배양하였다. 분리한 균주는 단순 폐결핵 환자를 비롯하여 다제내성 결핵 환자, 광범위 내성 결핵 환자로부터 각각 분리하여 실험을 진행하였다(M.tb, MDR-M.tb, XDR-M.tb) 배양된 배양액 중 1ml을 샘플로 선택하여, -80℃에서 M. tb 스톡(stock)으로 저장하였다. M. tb 균주 스톡은 PBS 버퍼로 50ml 코니컬 튜브(Conical tubes)에서 희석되었고, working concentration로서 10⁶ CFU/ml에 이르게 하였다. 4 그룹의 코니컬 튜브를 준비하여, 한 그룹은 대조군(광감작제, 레이저 모두 없음), 한 그룹은 광감작제만 처리, 한 그룹은 레이저만 처리, 나머지 한 그룹은 광감작제 및 레이저를 모두 처리하였다. 사용한 광감작제는 라다클로린(radachlorine), DH-I-180-3이었으며, 각 10㎍/ml의 용량으로 처리하였다.

광감작제는 코니컬 튜브에 주입하여 최종 농도(final concentration)가 10/ml이 되게 하였고, 동일한 양의 PBS는 대조군과 레이저만 주입한 그룹에 혼합한 후, 튜브들을 2시간 동안 암실에서 인큐베이트하였다. 그 후, 각 그룹으로부터 1ml을 12-웰 플레이트(well-plate)에 분사하고, 정확히 100, 200, 300, 400, 500초 동안 레이저에 노출시켰으며, 레이저는100mw/cm²의 플루언스율(fluence rate)로 조사되었다.

< 실시예 2>

광역학 치료에 따른 마이코박테리움 투베르쿨로시스 활성 억제 효과 분석

상기 실시예에서와 같이 실험을 실시한 후, 각 그룹에서 살아남은 M. tb 균주의 수를 분석하기 위하여, 살아남은 균주를 7H10 배지에서의 CFU(coloning forming unit) 및 액체배양시스템(liquid culture system, MGIT)에서의 DTP(days to positive)를 이용해 D-값(M. tb의 하나의 log CFU/ml을 감소시키기 위해 요구되는 시간)을 계산하였다. M.tb 균주의 불활성 비율의 차이는 그래프-페드 소프트웨어(Graph-Pad software)를 이용해 분석되었고, P 값이 0.05 이상일 경우 유의적으로 보았다.

<2-1> 광감작제와 광선 조사에 따른 결핵균 활성 억제 효과 분석

그 결과, 레이저를 500초 조사하였을 경우 결핵 치료제에 내성을 가지지 않은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주의 불활성 정도는 도 1에서와 같이 레이저와 광감작제는 모두 처리하지 않은 대조군의 경우 CFU 정도가 높게 측정되었으며, 광감작제인 라다클로딘(RD)를 처리하였지만 레이저를 조사하지 않은 두 번째 경우에는 균주가 대조군의 경우와 유사하게 측정되었고, 라다클로딘을 처리한 후 레이저를 500초 동안 조사한 경우는 매우 낮은 균주의 CFU 값을 확인할 수 있었다. 또한 또 다른 광감작제인 DH-I-180-3(DH)을 처리한 실험군들의 경우, 레이저를 조사하지 않은 그룹에서는 대조군과 마찬가지로 높은 균주의 CFU 값을 나타내었으나 레이저를 조사한 경우는 유의적으로 낮은 CFU 값을 확인할 수 있었으며 마지막으로 광감작제를 처리하지 않고 오로지 레이저만을 조사한 실험군의 경우는 대조군과 마찬가지로 높은 CFU 값을 나타내었다.

따라서 결핵을 일으키는 결핵균인 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주는 광감작제를 처리한 후, 광감작제를 활성화시킬 수 있는 광선을 조사하였을 때 균주를 파괴하는 효과를 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다.

<2-2> 광선 조사 시간에 따른 결핵균 활성 억제 효과 분석

결핵 치료약에 내성을 가지지 않은 M. tb 균주를 라다클로린(radachlorine) 또는 DH-I-180-3의 광감작제의 존재 하에서 레이저 조사 시간만을 달리하면서 광역학적 처리를 실시한 결과, 도 2에서와 같이 광감작제를 처리하지 않고 오로지 레이저만을 조사한 대조군의 경우는 레이저의 조사 시간에 상관없이 일정하게 높은 균주 CFU 값을 나타내는 것과 비교하여, DH-I-180-3(DH)의 광감작제를 처리한 실험군의 경우는 레이저 조사 시간이 증가함에 따라 비례하여 유의적으로 균주의 CFU 값이 감소하는 것으로 나타났다. 또한 라다클로린(RD)을 처리한 실험군의 경우, 레이저를 500초 조사하였을 때 log CFU의 값이 0인 것으로 나타나 DH를 처리한 실험군보다 더 큰 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주 억제 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 대조군의 D-값은 119.4초인 반면, 내성을 가지지 않은 본 발명에 따른 균주의 D-값은 81.1초로 유의적으로 큰 차이가 남을 알 수 있었다.

따라서 상기 실험 결과를 통해 본 발명자들은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주의 활성을 억제할 수 있는 라다클로린 및 DH-I-180-3의 광감작제로의 효과 및 레이저 조사 시간의 최적 조건을 규명할 수 있었다.

<2-3> 내성을 가진 결핵균 활성 억제 효과 분석

본 발명자들은 최근 인류 생존을 위협하는 질병 중 하나로 평가받고 있는 “슈퍼결핵”을 일으키는 병원균인 “다제내성(multidrug resistant, MDR) 결핵균”과 “광범위 내성(extremely drug resistant, XDR) 결핵균”에 대한 본 발명에 따른 광역학적 처리에 의한 활성 억제 효과를 상기 <실시예 1>의 실험을 통해 분석하였다.

그 결과, 도 3에서와 같이, 광감작제 및 광선 모두를 처리하지 않은 MDR 대조군 및 XDR 대조군의 경우 및 광선만을 처리한 MDR 및 XDR 실험군을 비롯하여 광감작제(라다클로린)만을 처리한 MDR 및 XDR 실험군의 경우는 모두 거의 동일하게 높은 CFU 값을 유지하였다(P>0.1). 그러나 광감작제를 처리한 후, 500초 동안의 레이저를 조사한 MDR 및 XDR 실험군의 경우, 다른 경우와 비교하여 유의적으로 낮은 균주 CFU 값을 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한, MDR 균주 및 XDR 균주에 광감작제로 라다클로린을 처리한 후, 레이저의 조사 시간을 달리하며 균주의 활성 억제 양상을 살펴본 결과, 도 4에서와 같이, 레이저만을 조사한 대조군의 경우는 레이저 조사 시간에 관계없이 일정하게 높은 균주 CFU 값을 유지하나, MDR 및 XDR 균주 모두 유사하게 레이저의 조사 시간이 증가하는 경우 CFU 값이 감소함에 따라 균주의 활성 억제 효과가 증가함을 알 수 있었으나, 일정 시간 이후에는 활성 정도가 큰 폭으로 증가하지 않고 대체로 비슷한 정도에서 유지됨을 확인할 수 있었다. 한편, MDR 및 XDR 균주의 상기 실험에 따른 D-값은 각각 83.5, 82.9초로 나타나 내성을 지니지 않은 균주의 D-값인 81.1초 보다 조금 높기는 하였으나, 본 발명에 따른 광역학적 처리 방법이 결핵균의 활성을 효과적으로 억제할 수 있음을 뒷받침하여 주었다.

그리하여 상기 결과를 통해 본 발명자들은 다제내성(MDR) 결핵균 및 광범위 내성(XDR) 결핵균 또한 본 발명에 따른 광역학적 치료방법에 대해 반응하여, 그 활성이 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명자들은 결핵을 일으키는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주가 결핵약에 대한 내성 여부를 불문하고, 다제내성 혹은 광범위 내성 결핵균임에 관계없이 본 발명에 따른 광역학적 처리 방법에 따라 그 활성이 탁월하게 억제됨을 알 수 있었다(P>0.05).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

세포에 라다클로린(Radachlorin) 또는 하기 화학식 1로 표기되는 포르피린 화합물(DH-I-180-3)을 포함하는 광감작제 중 어느 하나의 광감작제를 처리하는 단계; 및
상기 광감작제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 단계를 포함하는 결핵균의 in vitro 활성 억제방법.

화학식 1
삭제
제1항에 있어서,
상기 광선은 90~110mw/cm²의 플루언스율로 조사되는 것을 특징으로 하는 결핵균의 in vitro 활성 억제방법.
제3항에 있어서,
상기 광선은 400~800초 동안 조사되는 것을 특징으로 하는 결핵균의 in vitro 활성 억제방법.
제1항에 있어서,
상기 광선의 에너지 밀도는 20~30J/cm²인 것을 특징으로 하는 결핵균의 in vitro 활성 억제방법.
제1항에 있어서,
상기 광감작제는 5~15㎍/ml의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 결핵균의 in vitro 활성 억제방법.
제1항에 있어서,
상기 결핵균은 다약제 내성 결핵균인 것을 특징으로 하는 결핵균의 in vitro 활성 억제방법.
인간을 제외한 포유동물에 라다클로린(Radachlorin) 또는 하기 화학식 1로 표기되는 포르피린 화합물(DH-I-180-3)을 포함하는 광감작제 중 어느 하나의 광감작제를 투여하는 단계; 및
인간을 제외한 포유동물의 병변부위에 상기 광감작제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 단계를 포함하는 결핵 치료방법.

화학식 1