DE60211918T2

DE60211918T2 - Sulfonierte chlorine als photosensitizer

Info

Publication number: DE60211918T2
Application number: DE60211918T
Authority: DE
Inventors: Kristian Berg; Diem Tran; Kristian P l SELBO; Claude Di Rimington
Original assignee: PCI Biotech AS
Current assignee: PCI Biotech AS
Priority date: 2001-08-30
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2022-08-31
Also published as: NZ531598A; CA2457856A1; ATE327768T1; BRPI0212172B1; BR0212172A; KR100883927B1; PL369289A1; WO2003020309A2; JP2005507383A; AU2002313562B2; US8096419B2; HU229623B1; US20060052433A1; BRPI0212172B8; NO20040822L; PL206900B1; HUP0401434A2; WO2003020309A3; CN100438909C; DE60211918D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Photosensitizer und ihre Verwendung zur photochemischen Internalisierung von Molekülen und zur photodynamischen Therapie.
Aus dem Stand der Technik ist eine große Vielfalt von Photosensitizern bekannt. Bei Belichtung können sie toxisch werden oder toxische Substanzen freisetzen, wie z. B. Singulettsauerstoff oder andere oxidierende Radikale, die für zelluläres Material oder Biomoleküle einschließlich der Membranen von Zellen und Zellstrukturen schädlich sind, und solcher Zell- oder Membranschaden kann die Zellen schließlich töten. Diese zytotoxischen Wirkungen wurden zur Behandlung verschiedener Abnormalitäten oder Erkrankungen einschließlich neoplastischer Erkrankungen verwendet. Eine solche Behandlung ist als photodynamische Therapie (PDT) bekannt und umfasst die Verabreichung photosensitivierender (photochemotherapeutischer) Mittel an den betroffenen Bereich des Körpers, gefolgt von Belichtung mit aktivierendem Licht zur Aktivierung der photosensitivierenden Mittel und ihrer Umwandlung in die zytotoxische Form, wodurch die betroffenen Zellen abgetötet werden oder ihr proliferatives Potenzial verringert wird.
In neuerer Zeit wurde der photodynamische Effekt als Werkzeug zur Einführung ansonsten nicht membrangängiger Moleküle ins Cytosol einer Zelle auf eine Weise, die nicht notwendigerweise zu Zerstörung oder Tod der Zelle führt, vorgeschlagen. Bei diesem als „photochemische Internalisierung" oder PCI bekannten Verfahren wird das zu internalisierende oder transferierende Molekül in Verbindung mit einem photosensitivierenden Mittel auf die Zellen aufgetragen. Belichtung mit geeigneter Wellenlänge aktiviert die photosensitivierende Substanz, die ihrerseits zu einer Störung der intrazellulären Kompartimentmembranen und der nachfolgenden Freisetzung des Moleküls ins Cytosol führt.
Photosensitizer können ihre Wirkungen durch eine Vielzahl von Mechanismen, direkt oder indirekt, ausüben. So werden z. B. bestimmte Photosensitizer direkt toxisch, wenn sie durch Licht aktiviert werden, während andere dadurch wirken, dass sie toxische Spezies erzeugen, z. B. oxidierende Mittel wie Singulettsauerstoff oder vom Sauerstoff abgeleitete freie Radikale, die auf Zellmaterial oder Biomoleküle wie z. B. Lipide, Proteine und Nukleinsäuren in höchstem Maße zerstörerisch wirken.
Zu den bekannten photosensitivierenden Mitteln gehören z. B. die Psoralene, die Porphyrine, die Chlorine und die Phthalocyanine. Porphyrin-Photosensitizer wirken indirekt durch Erzeugung toxischer Sauerstoffspezies, und sie gelten als besonders günstige Kandidaten für die PDT. Porphyrine sind natürlich vorkommende Vorstufen in der Häm-Synthese. Insbesondere wird Häm gebildet, wenn Eisen (Fe²⁺) durch die Wirkung des Enzyms Ferrochelatase in Protoporphyrin IX (PpIX) eingebaut wird. PpIX ist ein extrem wirksamer Photosensitizer, wohingegen Häm keine photosensitivierende Wirkung hat.
Eine Vielzahl von Porphyrin-basierten oder mit Porphyrin verwandten Photosensitizern ist aus dem Stand der Technik bekannt und in der Literatur beschrieben. Zu Beispielen für solche Mittel gehört Photofrin^®, das vor kurzem zur Verwendung als Photosensitizer bei der Be handlung bestimmter Krebsarten zugelassen wurde. Jedoch hat dies, da Photofrin^® parenteral (z. B. intravenös) verabreicht werden muss, den Nachteil, dass dies eine verlängerte Photosensitivierung der Haut verursacht, die über mehrere Wochen hinweg andauern kann. Da Photofrin^® aus großen Porphyrinoligomeren besteht, durchdringt es außerdem bei lokaler Applikation die Haut nicht ohne weiteres. Ähnliche Probleme existieren mit anderen Porphyrin-basierten Photosensitizern wie dem sogenannten „Hämatoporphyrinderivat" (HpD), das auch zur Verwendung bei der Krebs-Photochemotherapie beschrieben wurde.
In neuerer Zeit wurden sulfonierte meso-Tetraphenylporphyrine (TPPS_ns), wie die disulfonierten meta-Tetraphenylporphine TPPS_2a und TPPS_2o, und das tetrasulfonierte meso-Tetraphenylporphin TPPS₄ zur Verwendung als photosensitivierende Mittel untersucht, und es wurde gefunden, dass sie gegenüber HpD und Photofrin^® mehrere wichtige Vorteile besitzen. Insbesondere haben sie ein hohes Tumor : Normalgewebe-Verhältnis und sind daher zur Verwendung bei der Photochemotherapie von Interesse (Peng et al., Cancer Lett. 36: 1–10, 1987; Evensen et al., Photodynamic therapy of tumors and other diseases (Hrsg. G. Jori und C. Perria), S. 215–219, Libreria Prongetto Publ., Padua; und Winkelman, Cancer Res. 22: 589–596, 1962). TPPS_2a wurde vor kurzem auch zur Verwendung als Photosensitizer zur photochemischen Internalisierung von Makromolekülen geeignet gefunden (Berg et al., Cancer Res. 59: 1180–1183, 1999; Høgset et al., Hum. Gene Ther. 11: 869–880, 2000; und Selbo et al., Int. J. Cancer, 87: 853–859, 2000).
Jedoch ist der Hauptnachteil bei der Verwendung von TPPS_2a zu klinischen Zwecken seine geringe Absorption roten Lichts. Tatsächlich ist es eine wesentliche Begrenzung bei der klinischen Verwendung aller bekannten Porphyrinderivate, dass die längste Wellenlänge des Lichts, auf die sie reagieren, eine relativ geringe Absorption hat und bei ungefähr 620 bis 630 nm liegt. Bei solchen Wellenlängen kann das Licht nur eine kurze Strecke weit in lebende Gewebe eindringen und ist infolge dessen außerstande, tiefliegende Zellen oder Gewebe, z. B. Tumorzellen, zu erreichen. Es ist daher wünschenswert, alternative Tetrapyrrolverbindungen zu finden, die die vorteilhaften Eigenschaften bekannter porphyrinbasierter Photosensitizer noch besitzen, aber die zugleich eine höhere Lichtabsorption bei längeren Wellenlängen besitzen, bei denen die Gewebedurchdringung größer ist.
Die vorliegende Erfindung versucht dieses Bedürfnis zu erfüllen und zielt insbesondere darauf ab, Mittel bereitzustellen, die gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen porphyrinbasierten Substanzen einen erhöhten photosensitivierenden Effekt haben.
Es wurde jetzt gefunden, dass die Reduktion einer Doppelbindung im Porphyrin-Makrozyklus eines sulfonierten meso-Tetraphenylporphyrins (z. B. eines disulfonierten meso-Tetraphenylporphyrins) zu Substanzen mit überraschend verbesserten photosensitivierenden Eigenschaften führt. Solche Substanzen haben insbesondere verbesserte spektrale Eigenschaften im Vergleich zu den entsprechenden Porphyrinen, und es wurde gefunden, dass sie bei Belichtung mit rotem Licht, z. B. Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 630 bis 680 nm, eine unerwartete Zunahme des Extinktionskoeffizienten zeigen. Solche Substanzen gelten da her als besonders geeignet zur Verwendung nicht nur bei herkömmlichen Verfahren der photodynamischen Therapie, sondern auch bei Verfahren der photochemischen Internalisierung von Makromolekülen.
Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung somit ein photosensitivierendes Mittel bereit, das ein sulfoniertes meso-Tetraphenylchlorin umfasst, z. B. ein disulfoniertes meso-Tetraphenylchlorin, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon. In solchen Substanzen trägt typischerweise mindestens einer der vier Phenylringe eine, zwei oder drei Sulfonatgruppen, vorzugsweise eine Sulfonatgruppe. Erfindungsgemäß gehören zu den bevorzugten Substanzen solche, in denen zwei Phenylringe jeweils mit einer einzelnen Sulfonatgruppe substituiert sind.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein durch Reduzierung einer Doppelbindung im Porphyrin-Makrozyklus eines sulfonierten meso-Tetraphenylporphyrins erhältliches photosensitivierendes Mittel bereit, insbesondere ein durch Reduktion einer Doppelbindung im Porphyrin-Makrozyklus eines disulfonierten meso-Tetraphenylporphyrins wie z. B. TPPS_2a erhältliches Mittel. Pharmazeutische verträgliche Salze solcher Verbindungen stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Zu den Beispielen für erfindungsgemäße photosensitivierende Mittel gehören die Verbindungen der Formel I:
(worin
X für -SO₃H steht;
n, p, q und r jeweils unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen; und
die Summe von n, p, q und r eine ganze Zahl von 1 bis 4, vorzugsweise mindestens 2, z. B. 2 oder 4, ist)
und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
Isomere Formen der Verbindungen der Formel I, z. B. solche, in denen die reduzierte Doppelbindung in irgendeinem der drei übrigen Pyrrolringe liegt, werden ebenfalls als Teil der Erfindung betrachtet. Jedes Isomerengemisch, das mindestens eine Verbindung der Formel I oder eines Isomers davon enthält, wird als Teil der Erfindung betrachtet. Zu den Beispielen für Isomeren von Verbindungen der Formel I, die zur erfindungsgemäßen Verwendung besonders geeignet sind, gehören die folgenden Verbindungen der Formeln Ia bis Ic:
(worin X, n, p, q und r die zuvor genannten Bedeutungen haben).
Bei den Verbindungen der Formeln I, Ia, Ib und Ic bedeutet, wenn irgendeiner der Werte n, p, q und r 1 ist, das die Gegenwart einer einzelnen an irgendeiner Position an den Phenylringen angefügten Gruppe (das heißt ortho, meta oder para). In denjenigen Fällen, in denen mehr als eine Sulfonatgruppe vorliegt, kann diese in jedem Phenylring an der gleichen Position oder an verschiedenen Positionen vorliegen. Vorzugsweise werden diese an den gleichen Ringpositionen vorliegen, insbesondere bevorzugt in der meta- oder para-Position. Wenn einer der Werte n, p, q und r 0 ist, bedeutet dies das Fehlen aller Ringsubstituenten, d.h. unsubstituiertes Phenyl.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel I, Ia, Ib und Ic sind solche, in denen die Summe von n, p, q und r 2 beträgt. Am bevorzugtesten sind solche Verbindungen, bei denen die substituierten Phenylringe aneinander angrenzend liegen, z. B. an die reduzierten Pyrrolringe angrenzend, d.h. bei denen bei den Verbindungen der Formel I n = 0, p = 0, q = 1 und r = 1 ist. Zu alternativen bevorzugten Verbindungen der Formeln I, Ia, Ib und Ic gehören solche, bei denen die Summe von n, p, q und r 2 beträgt und die substituierten Phenylringe einander gegenüber liegen, z. B. Verbindungen der Formel I, in welchen n = 0, p = 1, q = 0 und r = 1 ist.
Unabhängig kann in jedem Phenylring die sulfonierte Gruppe X in der ortho-, meta- oder para-Position vorliegen. Vorzugsweise liegt sie in der meta- oder para-Position vor, besonders bevorzugt in der para-Position. Zu den bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen gehören die Verbindungen der Formel II:
Auch isomere Formen der Verbindungen der Formel II, z. B. solche, in denen die reduzierte Doppelbindung in einem der drei übrigen Pyrrolringe liegt, gelten ebenfalls als Teil der Erfindung. Jedes Isomerengemisch, das mindestens eine Verbindung der Formel II und Isomere davon umfasst, gilt als Teil der Erfindung.
Eine besonders bevorzugte Verbindung der Formel II ist diejenige, in der die beiden substituierten Phenylringe an die reduzierte Doppelbindung angrenzen.
Die erfindungsgemäßen Substanzen können unter Verwendung von Standardverfahren und aus dem Stand der Technik wohlvertrauten Prozeduren hergestellt werden. Am bequemsten können sie durch Reduktion des entsprechenden Porphyrins hergestellt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Substanzen bereit, wobei dieses Verfahren mindestens einen der beiden folgenden Schritte umfasst:

(a) die Reduktion eines sulfonierten Tetraphenylporphyrins oder eines Eisenchelatkomplexes davon, z. B. Reduktion eines Tetraphenylporphyrins der Formel III:
oder eines Eisenchelatkomplexes davon (wobei X, n, p, q und r die oben definierten Bedeutungen haben);
(b) gewünschtenfalls die Auftrennung des in Schritt (a) gebildeten Gemischs von Substanzen durch herkömmliche Trennverfahren; und
(c) die Umwandlung einer in Schritt (a) oder Schritt (b) gebildeten Verbindung, z. B. einer Verbindung der Formel I in ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

In Schritt (a) ist das als Ausgangsmaterial verwendete Porphyrin kommerziell erhältlich oder kann durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren erhalten werden. Sulfonierte Porphyrine einschließlich von TPPS_2a (disulfoniertem Tetraphenylporphyrin) sind z. B. von Porphyrin Products, Logan, UT, USA, erhältlich.
Die chemische Umwandlung der Porphyrinverbindung der Formel III in das entsprechende Chlorin in Schritt (a) kann chemisch auf mehrere verschiedene Weisen erreicht werden, z. B. unter Verwendung von p-Toluolsulfonylhydrazin als Diimid-Vorläufer bei der Reduktion der freien Porphyrinbase (siehe z. B. Whitlock et al., J. Am. Chem. Soc. 91: 7485–7489, 1969). Alternativ kann die Herstellung des gewünschten Chlorins durch Reduktion des entsprechenden Eisenporphyrins bewerkstelligt werden, z. B. mit Natrium in kochendem Isoamylalkohol (siehe Eisner, J. Chem. Soc. 3461–3469, 1957; und Eisner et al., J. Chem. Soc. 733–739, 1957).
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen besonders bevorzugt ist die photochemische Reduktion von Porphyrinen, optional in Gegenwart einer tertiären Aminbase. Z. B. kann eine freie Porphyrinbase in Gegenwart eines Amins, insbesondere eines tertiären Amins, zum Chlorin photoreduziert werden (siehe z. B. Harel et al., Photochem. Photobiol. 23: 337–341, 1976).
Die Reduktion des Porphyrinmoleküls in Gegenwart von Diimid kann die Bildung von Bakteriochlorinen durch Reduktion zweier Doppelbindungen in dem Porphyrinmakrozyklus auslösen. Daher wird ein Photoreduktionsverfahren unter Verwendung eines Amins, insbesondere vorzugsweise eines tertiären Amins, zur Verwendung bei der Herstellung der erwünschten erfindungsgemäßen Chlorinverbindungen bevorzugt. Zu den Beispielen für zur Verwendung in einem solchen Verfahren geeignete tertiäre Amine gehören Triethylamin (TEA), n-Methylpyrrolidon, Tri-n-butylamin, Trioctylamin usw., und die Reduktion wird im Allgemeinen in Gegenwart sichtbaren Lichts bewerkstelligt (d.h. Photoreduktion).
Die photochemische Reduktion eines Porphyrins kann bequemerweise in einem Lösungsmittel oder Gemisch von Lösungsmitteln, wie z. B. Benzol, Pyridin, Dimethylsulfoxid usw., bei Temperaturen im Bereich von 10 bis 30 °C, vorzugsweise bei Umgebungstemperatur (z. B. 20 bis 25 °C, insbesondere 22 °C), erfolgen.
Die Photoreduktion kann unter Verwendung von Licht im sichtbaren Bereich bewerkstelligt werden, z. B. Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 400 bis 640 nm, vorzugsweise 500 bis 640 nm, z. B. ungefähr 545 ± 15 nm. Die Bestrahlung erfolgt im Allgemeinen mit einer Flächenleistung von 1 bis 50 W/m², z. B. ungefähr 15 W/m² über einen Zeitraum in der Dimension von 1 bis 90 Minuten, z. B. 5 bis 40 Minuten. Die Bildung unerwünschter Bakteriochlorine kann durch Begrenzung der Zeit, während der der Porphyrinmakrozyklus dem Licht ausgesetzt ist, verringert werden. Verfahren zur Bestrahlung des Porphyrins, z. B. unter Verwendung von Lampen oder Lasern, sind aus dem Stand der Technik wohlvertraut. Hierzu besonders geeignet ist eine Hochdruck-Xenon-Lampe oder eine Wolfram-Iodid-Lampe wie die von Philips erhältlichen. Typischerweise wird die Reaktion unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. kann das Gemisch aus Ausgangsmaterialien und Lösungsmitteln vor der Belichtung und optional auch während der Belichtung mit Stickstoff gesättigt sein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in der Form eines Isomerengemischs vorliegen und in dieser Form verwendet werden. Gewünschtenfalls können die erfindungsgemäßen Verbindungen, z. B. die Verbindungen der Formel I, anhand ihrer physikalischen/chemischen Unterschiede durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren, z. B. durch Chromatographie und/oder fraktionierte Kristallisation, in ihre Isomeren aufgetrennt werden.
Wie oben erwähnt, können die erfindungsgemäßen Verbindungen die Form pharmazeutisch verträglicher Salze annehmen. Solche Salze sind vorzugsweise Säureadditionssalze mit physiologisch verträglichen organischen oder anorganischen Säuren. Zu den geeigneten Säuren gehören z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure und Ascorbinsäure. Auch hydrophobe Salze können beispielsweise durch Fällung bequem hergestellt werden. Zu den geeigneten Salzen gehören z. B. Acetat, Bromid, Chlorid, Citrat, Hydrochlorid, Maleat, Mesylat, Nitrat, Phosphat, Sulfat, Tartrat, Oleat, Stearat, Tosylat, Calcium-, Meglumin-, Kalium- und Natriumsalze. Die Verfahren zur Salzbildung sind die herkömmlichen aus dem Stand der Technik.
Wie oben beschrieben, haben die erfindungsgemäßen Substanzen und ihre Salze wertvolle pharmakologische Eigenschaften, nämlich photosensitivierende Eigenschaften, die sie zur photochemischen Internalisierung von Makromolekülen und als photochemotherapeutische Mittel verwendbar machen.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung somit eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein photosensitivierendes Mittel umfasst, wie hier beschrieben, z. B. eine Verbindung der Formel I, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, zusammen mit mindestens einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein photosensitivierendes Mittel wie hier beschrieben, z. B. eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, zur Verwendung als Medikament bereit, z. B. als photosensitivierendes Mittel zur Verwendung in einem Verfahren der photochemischen Internalisierung, bei der Photochemotherapie oder Diagnose.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt wird die Verwendung eines photosensitivierenden Mittels wie hier beschrieben, z. B. einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Verwendung in einem Verfahren der photochemischen Internalisierung, bei der Photochemotherapie oder Diagnose, insbesondere in einem Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen oder Abnormalitäten interner oder externer Oberflächen des Körpers, die auf Photochemotherapie ansprechen, bereitgestellt.
Der Begriff „Internalisierung" bezeichnet hier die Abgabe von Molekülen ins Cytosol und umfasst den Schritt der Freisetzung der Moleküle aus intrazellulären/membrangebundenen Kompartimenten ins Cytosol der Zellen. Der Begriff „Zelle" schließt hier alle eukaryontischen Zellen (einschließlich von Insektenzellen und Pilzzellen) ein. Zu repräsentativen Zellen gehören somit alle Arten von Säuger- und Nicht-Säuger-Tierzellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen und Protozoen.
Verfahren zur Einführung von Molekülen ins Cytosol lebender Zellen sind nützliche Werkzeuge zur Manipulation und zum Studium von biologischen Prozessen. Von großem Interesse sind solche Verfahren, bei denen die Zellen nach der Internalisierung lebensfähig und/oder funktional bleiben. Die Verwendung eines photosensitivierenden Mittels zur Einführung ansonsten nicht membrangängiger Moleküle ins Cytosol einer Zelle auf eine Weise, die nicht notwendigerweise zu ausgedehnter Zellzerstörung oder Zelltod führt, wurde z. B. in WO 96/07432 und WO 00/54802 vorgeschlagen. Bei diesem Verfahren werden das zu internalisierende Molekül und eine photosensitivierende Substanz gleichzeitig oder nacheinander auf die Zellen aufgetragen, woraufhin die photosensitivierende Substanz und das Molekül endozytiert oder auf andere Weise in Endosomen, Lysosomen oder andere membranumgrenzte intrazelluläre Kompartimente übertragen werden. Die in die intrazellulären Kompartimente der Zellen zu überfragenden Moleküle und die photosensitivierende Substanz werden zusammen oder nacheinander auf die Zellen aufgetragen, und sie werden von den Zellen in intrazelluläre Kompartimente aufgenommen. Das in der Zelle zu internalisierende Molekül wird freigesetzt, indem man die Zellen einem Licht von geeigneten Wellenlängen zur Aktivierung der photosensitivierenden Substanz aussetzt, die wiederum zur Störung der Membranen der intrazellulären Kompartimente und der nachfolgenden Freisetzung des Moleküls ins Cytosol führt. Dieses Verfahren, in dem die Zellen dem Licht ausgesetzt werden, um das fragliche Molekül aus dem intrazellulären Kompartiment, in dem es enthalten ist, durch die Wirkung eines photosensitivierenden Mittels freizusetzen, wird als „photochemische Internalisierung" oder PCI bezeichnet.
Ein Verfahren zur Einführung eines Moleküls (d.h. eines Transfermoleküls) ins Cytosol einer Zelle entweder in vitro oder in vivo umfasst es, diese Zelle mit einem photosensitivierenden Mittel wie hier beschrieben, z. B. einer Verbindung der Formel I oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon, in Kontakt zu bringen, die Zelle mit dem einzuführenden Molekül in Kontakt zu bringen und die Zelle mit Licht zu bestrahlen, dessen Wellenlänge das photosensitivierende Mittel wirksam aktiviert, z. B. mit Licht einer Wellenlänge im Bereich von 300 bis 800 nm.
Die genaue zeitliche Abstimmung der Zugabe des zu transferierenden Moleküls (d.h. des Transfermoleküls) und des photosensitivierenden Mittels und die zeitliche Abstimmung der Bestrahlung zum Erreichen der oben beschriebenen Wirkungen müssen verschiedene Faktoren berücksichtigen, darunter die zu behandelnden Zellen, die Natur des Transfermoleküls, die Umgebung der Zellen, ob das Verfahren in vitro oder in vivo durchgeführt wird, und ob die Verabreichung direkt auf das Zielgewebe oder auf einen davon entfernt gelegenen Ort erfolgt. Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen kann der Fachmann ohne weiteres eine geeignete zeitliche Abstimmung festlegen. Typischerweise werden die Transfermoleküle und das photosensitivierende Mittel den Zellen vor der Bestrahlung zugesetzt. Z. B. können diese entweder gleichzeitig oder getrennt 1 bis 72 Stunden vor der Bestrahlung zugegeben werden, vorzugsweise 4 bis 48, z. B. 4 bis 24 Stunden vor der Bestrahlung.
In bestimmten Fällen wird das Transfermolekül gleichzeitig mit dem photosensitivierenden Mittel verabreicht. Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung somit eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein photosensitivierendes Mittel wie hier beschrieben zusammen mit einem Transfermolekül umfasst. Ein pharmazeutisch verträglicher Trägerstoff oder Exzipient kann überdies vorliegen.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein photosensitivierendes Mittel wie hier beschrieben zusammen mit einem Transfermolekül zur therapeutischen Verwendung, z. B. zur Verwendung bei der Krebs- oder Gentherapie, enthält.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines photosensitivierenden Mittels wie hier beschrieben und/oder eines Transfermoleküls zur Herstellung eines Medikaments zur therapeutischen Verwendung bei der Therapie, z. B. der Krebs- oder Gentherapie, bereit, wobei das photosensitivierende Mittel und das Transfermolekül (entweder getrennt, gleichzeitig oder nacheinander) mit Zellen oder Geweben eines Patienten in Kontakt gebracht werden und diese Zellen oder Gewebe mit Licht einer Wellenlänge bestrahlt werden, die wirksam das photosensitivierende Mittel aktiviert.
Die erfindungsgemäßen photosensitivierenden Mittel können somit verwendet werden, um entweder in vitro (d.h. in Kultur) oder in vivo ein beliebiges Molekül ins Cytosol lebender Zellen zu transportieren oder transfizieren. Sie können nicht nur verwendet werden, um Moleküle (oder Teile oder Fragmente davon) ins Zellinnere zu transferieren, sondern auch, unter bestimmten Umständen, um sie auf der Zelloberfläche zu präsentieren oder exprimieren. Somit kann nach Transport und Freisetzung eines Transfermoleküls ins Cytosol der Zelle das Molekül oder Fragment, wenn die fraglichen Zellen spezialisierte Zellen sind, wie z. B. antigenpräsentierende Zellen, an die Zelloberfläche transportiert werden, wo es auf der Außenseite der Zelle, d.h. auf der Zelloberfläche, präsentiert werden kann. Solche Verfahren sind besonders nützlich auf dem Gebiet der Impfung, wo Impfstoffkomponenten, d.h. Antigene oder Immunogene, in eine Zelle zur Präsentation auf der Oberfläche dieser Zelle eingeführt werden können, um eine Immunantwort auszulösen, zu erleichtern oder zu verstärken. Weitere Details betreffend die Anwendung der Möglichkeit, Moleküle auf der Zelloberfläche zu exprimieren, sind in WO 00/54802 beschrieben.
Zu den Transfermolekülen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen photosensitivierenden Mittel ins Cytosol von Zellen eingeführt werden können, gehören Moleküle, die Zellmembranen nicht ohne weiteres durchdringen. Weiterhin können die hier beschriebenen Mittel die Abgabe ins Cytosol und die Aktivität von Molekülen erhöhen, die nur teilweise imstande sind, die Zellmembran oder die Membranen intrazellulärer Vesikel zu durchdringen. Die Transfermoleküle können organische Verbindungen, Proteine oder Proteinfragmente, wie z. B. Peptide, Antikörper oder Antigene oder Fragmente davon sein. Eine andere Klasse von Transfermolekülen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mittel eingeführt werden können, sind cytotoxische Pharmaka, wie z. B. Proteintoxine oder cytotoxische organische Verbindungen. Moleküle, die zur Krebsbehandlung von klinischem Interesse sein können, aber durch geringe oder keine Aufnahme ins Cytosol begrenzt werden, können ins Cytosol eingeführt und zu bestimmten Zellen geleitet werden, indem man die hier beschriebenen Verfahren verwendet. Gelonin ist ein Beispiel für ein solches Molekül.
In Abhängigkeit von der Natur des Transfermoleküls können die hier beschriebenen Verfahren zur Behandlung verschiedener Erkrankungen verwendet werden, z. B. von rheumatoider Arthritis, Atherosklerose und anderen cardiovaskulären Erkrankungen, viralen und anderen Infektionen, Psoriasis, Sonnenkeratose, Wundheilung, Bruchheilung, Warzen und erblichen genetischen Störungen, wie Cystische Fibrose, Gorlin-Syndrom und Ataxia telangiectasia.
Eine noch weitere Klasse geeigneter Transfermoleküle stellen Nukleinsäuren dar. Nukleinsäuren können in Form von Genen verwendet werden, die z. B. therapeutische Proteine, Antisense-RNA-Moleküle, Ribozyme, RNA-Aptamere oder Triplex-bildende Oligonukleotide, kodieren. Alternativ können die Nukleinsäuren in Form von nichtkodierenden Molekülen verwendet werden, wie z. B. als synthetische DNA- oder RNA-Gegensinn-Moleküle, Ribozyme, Aptamere, Triplex-bildende Oligonukleotide, Peptidnukleinsäuren (PNAs), Transkriptionsfaktor-„Decoy"-DNA oder chimäre Oligonukleotide zur Reparatur spezifischer Mutationen beim Patien ten. Passendenfalls können die Nukleinsäuremoleküle die Form ganzer Gene oder Nukleinsäurefragmente haben, die optional in ein Vektormolekül, z. B. einen Plasmidvektor, inkorporiert sind. Die letztere Form hat besondere Anwendbarkeit, wenn das Transfermolekül in Verfahren der Gentherapie verwendet werden soll, in denen Gene zu therapeutischen Zwecken in Patientenzellen übertragen werden. Dies kann zur Behandlung vieler Erkrankungen verwendet werden, wie z. B. von Krebs, cardiovaskulären Erkrankungen, viralen Infektionen und monogenen Erkrankungen wie Cystischer Fibrose.
Optional kann das eine oder andere oder können beide des photosensitivierenden Mittels und des Transfermoleküls, die in die Zelle eingeführt werden sollen, an Carrier-Moleküle, Targeting-Moleküle oder Vektoren gebunden oder konjugiert oder mit ihnen assoziiert sein, die dahingehend wirken können, dass sie die Aufnahme des photosensitivierenden Mittels oder des Transfermoleküls erleichtern oder erhöhen oder es bewirken, dass diese Entitäten zu einem bestimmten Zelltyp, Gewebe oder intrazellulären Kompartiment gelenkt oder geleitet werden. Zu Beispielen für Carrier-Systeme gehören Polylysin oder andere Polykationen, Dextransulfat, verschiedene kationische Lipide, Liposomen, rekonstituierte LDL-Partikel oder sterisch stabilisierte Liposomen. Diese Carrier-Systeme können allgemein die Pharmakokinetik verbessern und die zelluläre Aufnahme des Transfermoleküls und/oder des photosensitivierenden Mittels steigern, und sie können auch das Transfermolekül und/oder das photosensitivierende Mittel in intrazelluläre Kompartimente lenken, die zur Erreichung der photochemischen Internalisierung besonders günstig sind, die aber im Allgemeinen nicht die Fähigkeit haben, das Transfermolekül und/oder das photosensitivierende Mittel zu bestimmten Zellen (z. B. Krebszellen) oder Geweben zu leiten. Jedoch können zur Erreichung solch spezifischer oder selektiver Zielsteuerung die Trägermoleküle, das Transfermolekül und/oder der Photosensitizer mit spezifischen zielsuchenden Molekülen assoziiert oder konjugiert oder daran gebunden sein, die die spezifische zelluläre Aufnahme des Transfermoleküls in die gewünschten Zellen oder Gewebe fördern. Solche Targeting-Moleküle können das Transfermolekül auch in intrazelluläre Kompartimente lenken, die zur Erreichung der photochemischen Internalisierung besonders günstig sind.
Es können viele verschiedene zielsuchende Moleküle verwendet werden, z. B. wie beschrieben bei Curiel, D.T. (1999), Ann. New York Acad. Sci. 886, 158–171; Bilbao, G. et al. (1998), in Gene Therapy of Cancer (Walden et al., Hrsg., Plenum Press, New York), Peng K.W. und Russell S.J. (1999), Curr. Opin. Biotechnol. 10, 454–457, Wickham T.J. (2000), Gene Ther. 7, 110–114.
Das Carrier-Molekül und/oder das Targeting-Molekül können mit dem Transfermolekül, dem photosensitivierenden Mittel oder beiden assoziiert oder daran gebunden oder konjugiert sein, und es können gleiche oder verschiedene Carrier- oder Targeting-Moleküle verwendet werden. Solche Carrier- oder Targeting-Moleküle können auch verwendet werden, um das Transfermolekül in bestimmte intrazelluläre Kompartimente zu lenken, die zum Einsatz der PCI besonders günstig sind, z. B. Lysosomen oder Endosomen.
Wie oben erwähnt, können die erfindungsgemäßen photosensitivierenden Mittel auch in der photodynamischen Therapie verwendet werden, insbesondere in der Photochemotherapie oder Diagnose. Solche Verfahren sind in der Patent- und Wissenschaftsliteratur gut dokumentiert, z. B. in WO 96/28412 und 98/30242.
Bei der Verwendung der Photosensitizer bei der PDT gehören zu den Abnormalitäten und Erkrankungen, die behandelt werden können, alle malignen, prämalignen und nichtmalignen Erkrankungen oder Abnormalitäten, die auf Photochemotherapie ansprechen, z. B. Tumoren oder andere Gewächse, Hautkrankheiten wie Psoriasis oder aktinische Keratosen und Akne, Hautabschürfungen und andere Krankheiten oder Infektionen, z. B. Bakterien-, Virus- oder Pilzinfektionen, z. B. Herpesvirusinfektion.
Zu den internen oder externen Oberflächen des Körpers, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen behandelt werden können, gehören die Haut und alle anderen epithelialen und serosalen Oberflächen, darunter z. B. Schleimhaut, die Auskleidungen von Organen, z. B. des respiratorischen, gastrointestinalen und genito-urinalen Trakts und von Drüsen mit Gängen, die sich auf solche Oberflächen öffnen (z. B. Leber, Haarfollikel mit Talgdrüsen, Milchdrüsen, Speicheldrüsen und Samenleiter). Außer der Haut gehören zu solchen Oberflächen z. B. die Auskleidung der Vagina, das Endometrium und das Urothel. Zu solchen Oberflächen können auch im Körper nach Exzision erkrankter oder krebsartiger Gewebe gebildete Hohlräume gehören, z. B. Gehirnhohlräume nach Exzision von Tumoren, wie z. B. Gliomen.
Zu beispielhaften Oberflächen gehören somit: (i) Haut und Bindehaut; (ii) die Auskleidung des Mundes, Pharyx, Oesophagus, Magens, der Därme und Darmanhänge, des Rektums und Analkanals; (iii) die Auskleidung der Nasenwege, Nasenhöhlen, des Nasopharynx, der Trachea, der Bronchien und Bronchiolen; (iv) die Auskleidung der Harnleiter, Harnblase, und Harnröhre; (v) die Auskleidung der Vagina, des Uteruscervix und Uterus; (vi) Parietal- und Visceralpleura; (vii) die Auskleidung der Brust- und Bauchhöhle und die Oberfläche der in diesen Höhlen enthaltenen Organe; (viii) die Dura mater und Gehirnhäute; (ix) alle Tumoren in festen Geweben, die im photoaktivierenden Licht zugänglich gemacht werden können, z. B. entweder direkt, zum Zeitpunkt der chirurgischen Behandlung, oder mittels einer durch eine Nadel eingeführten optischen Faser.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auf herkömmliche Weise gemäß aus dem Stand der Technik wohlbekannten Techniken mit einem oder mehreren physiologisch verträglichen Trägern oder Hilfsstoffen formuliert werden. Die Natur der Zusammensetzung und der Träger oder Hilfsstoffe, Dosierungen usw. können routinemäßig gemäß Auswahl und gewünschten Verabreichungswegen, Behandlungsziel usw. ausgewählt werden. Die Dosierungen können ebenfalls routinemäßig bestimmt werden und können von der Natur des Transfermoleküls (sofern vorliegend), dem Behandlungsziel, Alter des Patienten, der Verabreichungsform usw. abhängen.
Die Zusammensetzungen können topisch, oral oder systemisch verabreicht werden. Zur Verwendung bei der PDT sind topische Zusammensetzungen bevorzugt, und zu ihnen gehören Gele, Cremes, Salben, Sprays, Lotionen, Wundsalben, Pflaster, Seifen, Pulver, Pessare, Aerosole, Tropfen, Lösungen und alle anderen herkömmlichen pharmazeutischen Formen aus dem Stand der Technik. Eine topische Verabreichung an unzugängliche Orte kann durch aus dem Stand der Technik bekannte Techniken erreicht werden, z. B. durch die Verwendung von Kathetern oder anderen geeigneten Arzneimitteltransportsystemen.
Alternativ können die Zusammensetzungen in einer zur oralen oder parenteralen Verabreichung angepassten Form bereitgestellt werden, z. B. durch intradermale, subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Injektion. Zu alternativen pharmazeutischen Formen gehören somit einfache oder beschichtete Tabletten, Kapseln, Suspensionen und Lösungen, die den aktiven Inhaltsstoff optional zusammen mit einem oder mehreren inerten herkömmlichen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln enthalten.
Die Konzentration der hier beschriebenen Substanzen in den Zusammensetzungen hängt von der beabsichtigten Verwendung der Substanz, der Natur der Zusammensetzung, dem Verabreichungsweg, der zu behandelnden Erkrankung und dem Patienten ab und kann nach Auswahl variiert oder angepasst werden. Im Allgemeinen können die Konzentrationsbereiche des Photosensitizers zur Verwendung in der PDT jedoch im Bereich von 0,01 bis 50 Gew.-%, z. B. 0,05 bis 20 Gew.-%, z. B. 1 bis 10 Gew.-% liegen. Zur Verwendung bei der PCI ist es wichtig, dass die Konzentration des photosensitivierenden Mittels so ist, dass, wenn es einmal von der Zelle aufgenommen worden ist, z. B. in eines oder mehrere ihrer intrazellulären Kompartimente, oder damit assoziiert ist, und durch Bestrahlung aktiviert worden ist, eine oder mehrere Zellstrukturen gestört werden, z. B. eines oder mehrere intrazelluläre Kompartimente lysiert oder zerstört werden. Z. B. können photosensitivierende Mittel in einer Konzentration von z. B. 10 bis 50 μg/ml verwendet werden. Für die Verwendung in vitro kann dieser Bereich erheblich breiter sein, z. B. 0,05 bis 500 μg/ml. Zur in vivo-Behandlung von Menschen kann das photosensitivierende Mittel im Bereich von 0,05 bis 20 mg/kg Körpergewicht verwendet werden, wenn es systemisch verabreicht wird, oder mit 0,1 bis 20 % in einem Lösungsmittel zur lokalen Anwendung. Bei der Verwendung der hier beschriebenen Substanzen bei der PCI kann die Zeit der Inkubation der Zellen mit dem photosensitivierenden Mittel (d.h. die „Kontaktzeit") von einigen Minuten bis zu mehreren Stunden variieren, z. B. bis zu 48 Stunden oder noch länger. Die Inkubationszeit sollte so sein, dass das photosensitivierende Mittel von den richtigen Zellen aufgenommen wird. Auf die Inkubation der Zellen mit dem photosensitivierenden Mittel kann optional eine Inkubationsperiode mit einem von Photosensitizern freien Medium erfolgen, bevor die Zellen dem Licht ausgesetzt werden und/oder das Transfermolekül zugesetzt wird.
Die Festlegung der geeigneten Zielmolekül-Dosierungen zur erfindungsgemäßen Verwendung ist für den Fachmann Routinearbeit. Ist das Transfermolekül ein Protein oder Peptid, wird es zu in vitro-Anwendungen im Allgemeinen in Dosierungen von weniger als 5 mg/ml (z. B. 0,1 bis 5 mg/ml) und zu in vivo-Anwendungen im Allgemeinen in Dosierungen von weniger als 5 mg/kg (z. B. 0,1 bis 5 mg/kg) verwendet. Ist das Transfermolekül eine Nukleinsäure, beträgt für in vitro-Anwendungen eine beispielhafte Dosierung der Transfermoleküle ungefähr 0,1 bis 50 μg Nukleinsäure pro 10⁴ Zellen und für in vivo-Anwendungen ungefähr 10^–6 bis 1 g Nukleinsäure zur Injektion in Menschen.
Nach der Verabreichung einer hier beschriebenen Substanz oder Zusammensetzung (z. B. auf eine Körperoberfläche) wird die behandelte Fläche zur Erreichung des gewünschten Effekts, z. B. photochemischer Internalisierung oder photochemotherapeutischer Wirkung, dem Licht exponiert. Der Lichtbestrahlungsschritt zur Aktivierung des photosensitivierenden Mittels kann gemäß den aus dem Stand der Technik wohlbekannten Techniken und Verfahren durchgeführt werden. Geeignete Lichtquellen, die imstande sind, Licht von der gewünschten Wellenlänge und Intensität bereitzustellen, sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Die Zeit, während der bei den erfindungsgemäßen Verfahren die Körperoberfläche oder die Zellen dem Licht ausgesetzt sind, kann variieren. Bei der PCI scheint z. B. die Effizienz der Internalisierung des Transfermoleküls ins Cytosol mit zunehmender Belichtung zuzunehmen. Im Allgemeinen liegt die Länge der Zeit für den Bestrahlungsschritt im Bereich von Minuten bis mehreren Stunden, z. B. vorzugsweise bis zu 60 Minuten, z. B. von 1 bis 30 Minuten, z. B. von 0,5 bis 3 Minuten oder von 1 bis 5 Minuten oder von 1 bis 10 Minuten, z. B. von 3 bis 7 Minuten, und vorzugsweise ungefähr 3 Minuten, z. B. 2,5 bis 3,5 Minuten. Geeignete Lichtdosen können von einem Fachmann ausgewählt werden und hängen von der in den Zielzellen oder Geweben akkumulierten Menge des Photosensitizers ab. Die Bestrahlung wird im Allgemeinen mit einer Energiedosis von 40 bis 200 Joules/cm² verwendet, z. B. mit 100 Joules/cm² mit einer Fluenzrate von weniger als 200 mW/cm². Eine Bestrahlung mit Licht im Wellenlängenbereich von 500 bis 750 nm, z. B. 550 bis 700 nm, ist zur in vivo-Verwendung mit den hier beschriebenen Verfahren besonders geeignet.
Ein Verfahren zur photochemotherapeutischen Behandlung von Krankheiten oder Abnormalitäten interner oder externer Oberflächen des Körpers umfasst die Verabreichung eines photosensitivierenden Mittels wie hier beschrieben, z. B. einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, an die betroffenen Oberflächen und Belichtung dieser Oberflächen, bevorzugt mit Licht im Wellenlängenbereich von 300 bis 800 nm, z. B. 500 bis 700 nm.
Verfahren zur Bestrahlung verschiedener Oberflächen des Körpers, z. B. mit Lampen oder Lasern, sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt (siehe z. B. Van den Bergh, Chemistry in Britain, Mai 1986, S. 430–439). Für unzugängliche Regionen kann dies bequemerweise unter Verwendung von optischen Fasern erreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Substanzen können mit anderen photosensitivierenden Mitteln, z. B. ALA oder Photofrin^® oder mit anderen aktiven Substanzen, die den photochemotherapeutischen Effekt verstärken können, formuliert und/oder verabreicht werden. Z. B. können Chelatoren wie Aminopolycarbonsäuren (z. B. EDTA) einbezogen werden, um die Pp-Akkumulation zu erhöhen und auf diese Weise die photosensitivierende Wirkung zu verstärken. Der Chelator kann bequemerweise in einer Konzentration von 0,05 bis 20 Gew.-%, z. B. 0,1 bis 10 Gew.-%, verwendet werden.
Die Oberflächenpenetration unterstützende Mittel, insbesondere Dialkylsulfoxide wie z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO), können ebenfalls verwendet werden, um die photochemotherapeutische Wirkung zu verstärken. Das Oberflächenpenetrationsmittel kann passenderweise in einem Konzentrationsbereich von 0,2 bis 50 Gew.-%, z. B. ungefähr 10 Gew.-%, bereitgestellt werden.
Gemäß dem zu behandelnden Krankheitsbild und der Natur der Zusammensetzung können die Substanzen zur erfindungsgemäßen Verwendung gemeinsam mit solchen anderen optionalen Mitteln verabreicht werden, z. B. in einer einzigen Zusammensetzung, oder sie können nacheinander oder getrennt verabreicht werden. In der Tat kann in vielen Fällen ein besonders günstiger photochemotherapeutischer Effekt durch Vorbehandlung mit dem die Oberflächenpenetration unterstützenden Mittel in einem getrennten Schritt, vor der Verabreichung der Substanzen zur erfindungsgemäßen Verwendung, erreicht werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung somit ein Produkt bereit, das ein photosensitivierendes Mittel wie hier beschrieben, z. B. eine Verbindung der Formel I, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, zusammen mit mindestens einem die Oberflächenpenetration unterstützenden Mittel und optional einem oder mehreren Chelatoren als kombinierte Zubereitung zur gleichzeitigen getrennten oder aufeinander folgenden Verwendung zur Behandlung von Krankheiten oder Störungen interner oder externer Oberflächen des Körpers, die auf Photochemotherapie ansprechen, umfasst.
Aus einem anderen Blickwinkel stellt dieser Aspekt der Erfindung auch ein Kit zur Verwendung bei der Photochemotherapie von Krankheiten oder Abnormalitäten externer oder interner Oberflächen des Körpers bereit, umfassend:

a) einen ersten Behälter, enthaltend einen Photosensitizer, wie hier beschrieben, z. B. eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon,
b) einen zweiten Behälter, enthaltend wenigstens ein die Oberflächenpenetration unterstützendes Agens; und gegebenenfalls
c) einen oder mehrere chelatbildende Agenzien, welche entweder im ersten Behälter oder in einem dritten Behälter enthalten sind.

Der Fachmann erkennt, dass das Therapieverfahren unter Verwendung der hier beschriebenen Substanzen unvermeidlich die Fluoreszenz der zu behandelnden Krankheit oder Abnormalität involviert. Während die Intensität der Fluoreszenz verwendet werden kann, um abnormale Zellen zu eliminieren, kann die Lokalisation der Fluoreszenz verwendet werden, um die Größe, das Ausmaß und die Lage der Abnormalität oder Erkrankung sichtbar zu machen.
Die so identifizierte oder an dem Ort der Untersuchung bestätigte Abnormalität oder Erkrankung kann dann durch alternative therapeutische Techniken behandelt werden, z. B. durch chirurgische oder chemische Behandlung oder durch das erfindungsgemäße Verfahren des kontinuierlichen Aufbaus der Fluoreszenz durch weitere Auftragung von erfindungsgemäßen Substanzen an der richtigen Stelle. Der Fachmann erkennt, dass die diagnostischen Techniken zur Visualisierung geringere Fluoreszenzintensitäten erfordern können, als sie bei therapeutischen Behandlungen verwendet werden. Somit sind im Allgemeinen Konzentrationsbereiche von 0,2 bis 30 Gew.-%, z. B. 1 bis 5 Gew.-% geeignet. Orte, Verfahren und Verabreichungswege wurden bereits zuvor im Hinblick auf die therapeutischen Verwendungen betrachtet und sind auch auf die hier beschriebenen diagnostischen Verwendungen anwendbar.
Die erfindungsgemäßen Substanzen können auch für in vitro-Diagnosetechniken angewandt werden, z. B. zur Untersuchung der in Körperflüssigkeiten enthaltenen Zellen. Die mit abnormalem Gewebe assoziierte höhere Fluoreszenz kann auch bequemerweise eine Abnormalität oder Krankheit anzeigen. Dieses Verfahren ist hochempfindlich und kann z. B. zur frühzeitigen Detektion von Abnormalitäten oder Krankheiten verwendet werden, z. B. von Blasen- oder Lungenkarzinomen durch Untersuchung der Epithelzellen in Urin- bzw. Sputumproben. Zu anderen nützlichen Körperflüssigkeiten, die zusätzlich zu Urin und Sputum zur Diagnose verwendet werden können, gehören Blut, Samen, Tränen, Spinalflüssigkeit usw. Auch Gewebeproben oder Präparationen können beurteilt werden, z. B. Gewebsbiopsie- oder Knochenmarksproben. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich somit auf die Verwendung von erfindungsgemäßen Substanzen oder Salzen davon zur Diagnose gemäß den zuvor beschriebenen Verfahren zur Photochemotherapie, und auf Produkte und Kits zur Durchführung dieser Diagnose.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro-Diagnose von Abnormalitäten oder Erkrankungen, indem man eine Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes eines Patienten untersucht, wobei diese Methode mindestens die folgenden Schritte umfasst:

i) das Vermischen der Körperflüssigkeit oder des Gewebes mit einem Photosensitizer, wie hier beschrieben, z. B. einer Verbindung der Formel I oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon,
ii) die Lichtexposition dieses Gemischs, z. B. eine Belichtung mit Licht in einem Wellenlängenbereich von 300 bis 800 nm,
iii) die Bestimmung der Stärke der Fluoreszenz, und
iv) den Vergleich der Fluoreszenzstärke mit Kontrollwerten.

Die Erfindung wird jetzt in den folgenden, nicht begrenzenden Beispielen mit Bezug auf die begleitenden Figuren detaillierter beschrieben:
1 zeigt die Absorptionsspektren von TPPS_2a in Gegenwart von Triethylamin (TEA) in Benzol sowohl vor als auch nach monochromatischer Belichtung über verschiedene Zeiträume hinweg.
2 ist ein Diagramm, das die Wirkung der Belichtung auf die maximale optische Dichte des 646 → 655-nm-Peaks von TPPS_2a zeigt. Die TPPS_2a in Gegenwart von TEA in Benzol enthaltende Lösung wurde monochromatischem Licht ausgesetzt, und die optische Dichte wurde gemessen.
3 zeigt HPLC-Chromatogramme von durch Belichtung von TPPS_2a gebildeten Derivaten. TPPS_2a in Gegenwart von TEA in Benzol wurde nichtmonochromatischem Licht ausgesetzt und durch Reversed phase-HPLC auf die Bildung fluoreszierender Derivate untersucht. Die Lösung wurde belichtet, und es wurden Proben zur Messung isoliert.
4 zeigt HPLC-Chromatogramme von TPCS_2a und Zellextrakte von mit TPCS_2a behandelten V79-Zellen. Die V79-Zellen wurden mit 1 μg/ml TPCS_2a behandelt, das nach 10 Minuten Belichtung (a) gemäß 3 gebildet wurde. TPCS_2a wurde nach 18-stündiger Inkubation aus den Zellen extrahiert und durch HPLC untersucht (b). Die Peak-Retentionszeiten sind in der Figur bezeichnet.
5 zeigt Fluoreszenzmikrographien von mit TPPS_2a und TPCS_2a behandelten Zellen. Die Zellen wurden 18 Stunden lang mit (a) 1 μg/ml TPPS_2a oder (b) 1 μg/ml TPCS_2a inkubiert, gefolgt von einstündiger Inkubation in Sensitizer-freiem Medium vor der mikroskopischen Untersuchung.
6 zeigt Fluenz-Reaktionskurven für die Inaktivierung der β-AGA-Aktivität in V79-Zellen, die 18 Stunden lang 1 μg/ml TPCS_2a ausgesetzt waren, gefolgt von einstündiger Inkubation in Sensitizer-freiem Medium vor Belichtung mit rotem Licht.
7 zeigt die Dosis-Reaktions-Kurven für mit TPPS_2a und TPCS_2a inkubierte und (a) mit rotem Licht oder (b) mit blauem Licht belichtete V79-Zellen. Die Zellen wurden 18 Stunden lang mit 1 oder 2 μg/ml TPPS_2a oder 1 μg/ml TPCS_2a inkubiert, gefolgt von einstündiger Inkubation in Sensitizer-freiem Medium vor der Belichtung.
8 zeigt die Proteinsynthese nach kombinierter photochemischer und Gelonin-Behandlung bei V79-Zellen. Die Zellen wurden mit 1 μg/ml TPCS_2a in Abwesenheit (ausgefüllte Kreise) oder Gegenwart (offene Kreise) von 1 μg/ml Gelonin behandelt und mit rotem Licht belichtet. Die Balken in dieser und den vorangehenden Figuren zeigen die Standardabweichung aus in Triplikaten durchgeführten Experimenten.
BEISPIELE
Materialien und Verfahren
Materialien
Der Photosensitizer TPPS_2a wurde von Porphyrin Products (Logan, UT, USA) geliefert. Die TPPS_2a-Stammlösung (2 mg/ml) wurde in DMSO von Sigma (St. Louis, MO, USA) aufgelöst. Gelonin wurde von Sigma erworben. Die Toxin-Stammlösung (2 mg/ml) wurde durch Auflösung des Geloninpulvers in PBS, pH 8,5, hergestellt und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert. p-Nitrophenyl-N-acetyl-D-glucosaminid wurde von Sigma (St. Louis, MO, USA) erworben.
Herstellung von Tetraphenylchlorindisulfonat – TPCS_2a
Tetraphenylchlorindisulfonat (TPCS_2a) wurde im Wesentlichen in Übereinstimmung mit der von Harel et al. (Photochem. Photobiol. 23: 337–341, 1976) beschriebenen Methode aus TPPS_2a hergestellt.
Ein Gemisch aus 950 μl Benzol/Triethylamin (TEA) (18 : 7), 32 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) und 18 μl TPPS_2a (aus einer Lösung mit 1 mg/ml in DMSO) wurde hergestellt und 5 Minuten lang in einer 1-ml-Küvette mit Stickstoff gesättigt. Das Gemisch wurde dann dem Licht einer 500-Watt-Hochdruck-Xenonlampe, in einen Bausch und Lomb-Gittermonochromat eingepasst, ausgesetzt. Die Küvette wurde mit 15 W/m² von 545 ± 15 nm belichtet. Die Fluenzrate wurde mittels eines UDT 11 A-Photodetektors mit einem 223-Radiometriefilter überwacht. Das Absorptionsspektrum wurde regelmäßig mit einem Perkin-Eimer Lambda 15 UV/VIS-Spektrophotometer gemessen. Der Lichtweg war 1 cm.
Zur Herstellung von TPCS_2a in großem Maßstab (für Zellstudien) wurde das Gemisch in einer mit Plastikfolie abgedeckten Flasche hergestellt und während der Belichtung kontinuierlich mit Stickstoff durchströmt. Der Lichtweg wurde geringer als 1 cm gehalten. Das Gemisch wurde mit einer Phalanx von TL'/03-Lampen belichtet und während der Belichtung vorsichtig geschüttelt. Nach der Bestrahlung wurde das Gemisch gefriergetrocknet und in DMSO aufgelöst.
Zellkultur
Zellen der etablierten Linie V79 (ATCC CCL-93), von Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters abgeleitet, wurden verwendet. Die Zellen wuchsen in 10 % an fötalem Kälberserum (FCS von Gibco, Paisley, UK), 100 U ml^–1 Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Gibco) enthaltenden MEM-Medium bei 37 °C in einem mit 5 % CO₂ in Luft durchströmten Inkubator. Die Zellen wurden zweimal pro Woche subkultiviert.
Markierung mit Photosensitizer
Die Zellen wurden in MEM-Medium mit 10 % FCS enthaltenden 25 cm²-Flaschen (Nunclon, Dänemark) inokuliert und zur richtigen Anheftung an das Substrat 4 bis 5 Stunden lang bei 37 °C stehen gelassen. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit Medium gewaschen und 18 Stunden lang in serumhaltigem Medium 1 μg/ml TPPS_2a oder TPCS_2a exponiert. Die Zellen wurden anschließend dreimal mit Sensitizer-freiem Medium gewaschen und vor der Belichtung eine Stunde lang inkubiert. Die Zellen wurden dann mit rotem Licht (Philips TL 20 W/09), durch einen Cinemoid-35-Filter gefiltert, oder mit blauem Licht (Appl. Photophysics, Nood. 3026, London) belichtet. Die Zellen erreichenden Fluenzraten betrugen 1,35 mW/cm² bzw. 1,5 mW/cm² von den roten bzw. den blauen Lampen.
Toxizitätsmessung
Das Überleben der Zellen wurde durch den Koloniebildungstest gemessen, wie von Berg et al. beschrieben (Photochem. Photobiol. 53: 203–210, 1991). 1500 Zellen wurden in 25 cm²-Zellkultur-Plastikflaschen inokuliert und mit Photosensitizer und Licht wie oben beschrieben behandelt. Nach der photochemischen Behandlung ließ man die V79-Zellen 5 Tage lang bei 37 °C in serumhaltigem Kulturmedium stehen, um ihnen die Bildung zählbarer Kolonien zu erlauben. Die Zellen wurden dann in Ethanol fixiert und mit Methylenblau gefärbt, und die Kolonien wurden gezählt. Die Inhibition der Proteinsynthese wurde anhand des [³H]-Leucin-Einbaus in Proteine bestimmt, 24 Stunden nach der Belichtung gemessen wie von Llorente et al. beschrieben (FEBS Lett. 431: 200–204, 1998).
HPLC
Die Porphyrine wurden aus den Zellen extrahiert, indem man die Zellen in angesäuertem Methanol (5 μl konzentrierte Salzsäure in 10 ml Methanol) abschabte, wie von Berg et al. beschrieben (Br. J. Cancer 74: 688–697, 1996). Der Zellschutt wurde pelletiert, und der Überstand wurde aufgefangen. Die Porphyrine wurden durch Spülen der Extrakte mit N₂ eingeengt, bis das Volumen auf ungefähr 150 bis 200 μl verringert war, und zusätzlich präzipitierte Proteine wurden pelletiert. 100 μl des Überstandes wurden mit 235 μl an 10 mM Na₂PO₄, pH mit 5 M KOH auf ungefähr 10,5 eingestellt, gemischt und direkt für die HPLC-Analyse verwendet. Durch dieses Verfahren wurden die Porphyrine quantitativ aus den Zellen extrahiert. Photosensitizer-Stammlösungen wurden direkt in den Anfangspuffer verdünnt.
Das HPLC-System bestand aus einer Pumpe (Spectra Physics 8800), einer Reversephase-Säule (Supelcosil LC-18-T (4,6 × 250 mm), Supelco, S.A., Gland, Schweiz), einem Fluoreszenzdetektor (LDC Fluoromonitor III) und einem Integrator (Spectra Physics Data-jet), mit einem Computer verbunden. Lösungsmittel A war ein Gemisch aus Methanol und Wasser (30 70 nach Volumen), 1,5 mM Phosphat enthaltend und auf pH 7,0 eingestellt. Lösungsmittel B war ein Methanol-Wasser-Gemisch (95 : 5 nach Volumen), 1,5 mM Phosphat enthaltend und auf pH 7,5 eingestellt. Ein 30-minütiger linearer Gradient zwischen 40 % und 20 % des Lösungsmittels A wurde verwendet, gefolgt von einem fünfminütigen linearen Gradienten auf 100 % Lösungsmittel B. Die Fluoreszenz wurde durch Anregung im Wellenlängenbereich von 330 bis 400 nm detektiert. Das Streulicht wurde aus der Fluoreszenz durch einen Cut-off-Filter eliminiert, der nur Licht mit einer Wellenlänge von mehr als 410 nm durchließ.
Fluoreszenzmikroskopie
28 cm²-Schalen (Falcon 3002, Becton Dickinson, Plymouth, UK) wurden in den mikroskopischen Untersuchungen verwendet. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, und ein Deckglas wurde vorsichtig auf die PBS-Schicht gelegt. Die Zellen wurden anschließend mit einem Zeiss-Axioplan-Mikroskop (Zeiss, Oberkochen, Deutschland), mit Epifluoreszenz ausgestattet, untersucht. Eine HBO/100-W-Quecksilberlampe wurde zur Anregung verwendet. Die Zellen und die zelluläre Fluoreszenz wurden durch eine gekühlte Charge-coupled Device (CCD)-Kamera (TE2, Astromed, Cambridge, UK) untersucht. Ein Computer steuerte die Arbeit der Kamera und wurde zur digitalen Bildauswertung und -speicherung verwendet. Das Mikroskop war mit einem 390–440 nm-Bandpass-Anregungsfilter, einem dichroischen 470-nm-Strahlungsteiler und einem 610 nm-Langpassfilter ausgestattet.
Enzymatisches Assay
Die photochemische Inaktivierung des lysosomalen Enzyms β-AGA wurde wie von Beaufay et al., (J. Cell Biol. 61: 188–200, 1974) beschrieben gemessen. Das Verfahren basiert auf der Bildung von p-Nitrophenol (aus dem Substrat p-Nitrophenyl-N-acetyl-D-glucosaminid), das spektrophotometrisch bei 420 nm gemessen werden kann. Die Zellen wurden sofort nach der Belichtung isoliert und für die enzymatische Analyse präpariert.
Beispiel 1
Photochemische Reduktion von TPPS_2a
In Übereinstimmung mit dem von Harel et al. (Photochem. Photobiol. 23: 337–341, 1976) beschriebenen Verfahren wurde TPPS_2a in einer Lösung von Triethylamin (TEA) in mit Stickstoff gesättigtem Benzol belichtet. Die Lösung wurde, wie oben unter „Material und Verfahren" beschrieben, in einer Küvette mit Licht von 545 nm belichtet.
1 zeigt die Veränderung des Absorptionsspektrums bei Belichtung und ein Spektrum des Endprodukts, das charakteristisch für Chlorine ist. Die Spitze der Bande I der Q-Banden verschob sich von 646 nm auf 655 nm und stieg am Maximum auf das 5,8-fache der Intensität (2) an. Isobestische Punkte wurden bei 593 nm und ebenso bei 505 nm, 518 nm und 577 nm beobachtet. Die Absorptionsbanden nach der Bestrahlung sind charakteristisch für Chlorine.
Zur Skalierung der Produktion des Chlorins für Zellstudien wurden größere Volumina der TPPS_2a Lösung belichtet und präpariert, wie unter „Materialien und Verfahren" beschrieben. Die Zeitdimension für die Zunahme des 655-nm-Absoptionspeaks war ähnlich wie die oben beschriebene und ist in 2 gezeigt. Auf die Bildung des Chlorins folgte HPLC, wie in 3 gezeigt, die zeigt, dass mehrere Isomere des Chlorins gebildet wurden. 10 Minuten lang belichtete Lösungen wurden zur Behandlung von Zellen in Kultur weiter verwendet. Ungefähr 23 % des Produkts nach 10-minütiger Bestrahlung hatten eine der von TPPS_2a ähnliche Retentionszeit, aber der Peak zeigte ein typisches Chlorin-Absorptionsspektrum.
Beispiel 2
Photobiologische Bewertung von TPCS_2a
Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters der Zelllinie V79, wurden zur biologischen Bewertung der photochemischen Wirkung des Chlorins TPCS_2a verwendet. Die Zellen wurden über Nacht mit dem Chlorin inkubiert, der Photosensitizer wurde aus den Zellen extrahiert, und die Extrakte wurden durch HPLC untersucht. Wie in 4 zu sehen, war das Muster der Fluoreszenz-Peaks in den Zellextrakten dem aus der Stammlösung ähnlich. Eine Rever se phase-C18-Säule wurde zur Chromatographie verwendet, wobei im Allgemeinen die Retentionszeiten mit der Hydrophobizität der Substanzen ansteigen. Es wurde gefunden, dass die Aufnahme des Chlorins in die Zellen mit der Hydrophobizität der Isomere ansteigt.
Es wurde zuvor gefunden, dass der Photosensitizer TPPS_2a in endozytischen Vesikeln von mit dieser Substanz inkubierten Zellen lokalisiert wird (Berg et al., Photochem. Photobiol. 52: 481–487, 1990). Es wurde gefunden, dass die intrazelluläre Lokalisation von TPCS_2a der von TPPS_2a ähnlich war, was darauf hindeutet, dass TPCS_2a ebenfalls in endozytischen Vesikeln lokalisiert wird (siehe 5). Dies wurde weiterhin durch die photochemische Inaktivierung des lysosomalen Enzyms β-N-Acetyl-glucosaminidase (siehe 6) demonstriert. Somit wurde durch Vergleich mit dem intrazellulären Fluoreszenzmuster des sich in Lysosomen lokalisierenden Photosensitizers TPPS_2a durch Fluoreszenzmikroskopie indirekt und durch Messung der photochemischen Inaktivierung des lysosomalen Enzyms 13-AGA direkt gezeigt, dass TPCS_2a in den endozytischen Vesikeln der V79-Zellen lokalisiert wird.
Der Vorteil der Verwendung eines Chlorins anstelle eines Porphyrins bei der photodynamischen Therapie besteht in dem höheren Extinktionskoeffizienten des Chlorins im roten Wellenlängenbereich. Dies wurde klar gezeigt, indem man die Belichtung von mit TPPS_2a und TPCS_2a behandelten Zellen mit blauem und rotem Licht verglich (siehe 7). In 7b ist zu sehen, dass mit TPPS_2a oder TPCS_2a behandelte Zellen gegenüber blauem Licht gleich empfindlich waren, während die mit TPCS_2a behandelten Zellen gegenüber rotem Licht ungefähr sechsmal empfindlicher waren als die mit dem Porphyrin TPPS_2a behandelten Zellen (7a).
Die intrazelluläre Lokalisation von TPCS_2a in endocytischen Vesikeln und damit seine mögliche Verwendung zur photochemischen Internalisation (PCI) von Makromolekülen wurde anhand der Internalisierung des Typ 1-Ribosomen-inaktivierenden Proteintoxins Gelonin geprüft. Es wurde gefunden, dass Gelonin alleine oder in Kombination mit Licht eine geringe Toxizität ausübt (Berg et al., Cancer Research 59: 1180–1183, 1999). Die Proteinsynthese wurde in 18 Stunden lang mit 1 μg/ml Gelonin behandelten Zellen um etwa 10 % verringert. Jedoch potenzieren TPCS_2a und Licht, wie in 8 gezeigt, die Cytotoxizität des Gelonins in hohem Maße, wie anhand der Proteinsynthese 24 Stunden nach der Belichtung gemessen. Es gab eine geringe (20 %) Reduktion der Proteinsynthese, die alleine durch TPCS_2a ausgelöst wurde, die in den Klonogenizitätsassays nicht beobachtet wurde. Die Ergebnisse zeigen, das Gelonin nach photochemischer Behandlung mit TPCS_2a in die Zellen internalisiert wird.
Diskussion
Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass ein disulfoniertes Tetraphenylporphin durch photochemische Reduktion in Gegenwart von TEA unter anaeroben Bedingungen zu seiner Chlorinform reduziert werden kann. Die photochemische Reduktion führt zu einer 5,8-fachen Steigerung des Extinktionskoeffizienten der Bande I der Q-Banden, die durch Bildung mehrerer Chlorinisomere hervorgerufen werden. Im Vergleich zu dem Ausgangsporphyrin TPPS_2a erwies sich die photosensitivierende Wirkung des Chlorins TPCS_2a in V79-Zellen gleich effizient bei der Sensitivierung von Zellen gegenüber Photoinaktivierung mit blauem Licht und sechsmal effizienter mit rotem Licht.
Durch Fluoreszenzmikroskopie wurde indirekt gezeigt, dass TPCS_2a in endocytischen Vesikeln von V79-Zellen lokalisiert wird. Dies wurde direkt durch Messung der photochemischen Inaktivierung des lysosomalen Enzyms β-AGA bestätigt. Die Rate der β-AGA-Inaktivierung relativ zum Überleben der Zelle erwies sich als der zuvor für TPPS_2a gefundenen ähnlich (Berg et al., Int. J. Cancer 59: 814–822, 1994), was auf eine ähnliche Verteilung dieser Substanzen zwischen den Membranen der endocytischen Vesikel und ihrem Lumen hinweist.
Es wurde auch gezeigt, dass TPPS_2a als Photosensitizer für die photochemische Internalisierung (PCI) von Makromolekülen verwendet werden kann, wie durch die PCI von Gelonin gezeigt.

Claims

Photosensitivierendes Mittel, das ein sulfoniertes meso-Tetraphenylchlorin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon umfasst.
Photosensitivierendes Mittel nach Anspruch 1, wobei wenigstens einer der vier Phenylringe des Chlorins mit einer Sulfonatgruppe substituiert ist.
Photosensitivierendes Mittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei zwei Phenylringe des Chlorins jeweils mit einer einzelnen Sulfonatgruppe substituiert sind.
Photosensitivierendes Mittel nach Anspruch 1, wobei das Chlorin eine Verbindung der allgemeinen Formel (I):
(worin X für SO₃H steht: n, p, q und r jeweils unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen; und die Summe von n, p, q und i ein ganzzahliger Wert von 1 bis 4 ist); ein Isomer oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz einer der vorgenannten Verbindungen ist.
Photosensitivierendes Mittel nach Anspruch 4, wobei die Summe von n, p, q und r wenigstens 2 ist.
Photosensitivierendes Mittel nach Anspruch 5, wobei die Summe von n, p, q und r 2 oder 4 ist.
Photosensitivierendes Mittel nach Anspruch 4, wobei die Summe von n, p, q und r 2 ist und jede Gruppe X in der gleichen Ringposition innerhalb jedes Phenylringes vorliegt.
Photosensitivierendes Mittel nach Anspruch 7, wobei die Ringposition die meta- oder para-Position ist.
Photosensitivierendes Mittel nach einem der Ansprüche 4 bis 8, worin die Summe von n, p, q und r 2 ist und die substituierten Phenylringe zu dem reduzierten Pyrrolring benachbart sind.
Photosensitivierendes Mittel nach Anspruch 4, wobei das Chlorin eine Verbindung der allgemeinen Formel (II):
ein Isomer oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz einer der vorgenannten Verbindungen ist.
Photosensitivierendes Mittel erhältlich durch Reduktion einer Doppelbindung im Porphyrinmakrozyklus eines sulfonierten meso-Tetraphenylporphyrins oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Photosensitivierendes Mittel nach Anspruch 11, wobei der Porphyrinmakrozyklus ein disulfoniertes meso-Tetraphenylporphyrin ist.
Photosensitivierendes Mittel nach Anspruch 12, wobei das Porphyrin TPPS_2a (Tetraphenylporphindisulfonat) ist.
Verfahren zur Herstellung eines photosensitivierenden Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei dieses Verfahren wenigstens einen der folgenden Schritte umfasst: (a) die Reduktion eines sulfonierten meso-Tetraphenylporphyrins oder eines Eisenchelat-Komplexes davon; (b) gewünschtenfalls die Auftrennung des in Schritt (a) gebildeten Verbindungsgemisches; und (c) Umwandlung einer in Schritt (a) oder (b) gebildeten Verbindung in ein pharmazeutisch verträgliches Salz.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein photosensitivierendes Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zusammen mit wenigstens einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten.
Photosensitivierendes Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines photosensitivierenden Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines therapeutischen Agens zur Verwendung in einem Verfahren zur photochemischen Internalisation, in der Photochemotherapie oder Diagnose.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein photosensitivierendes Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, ein Transfermolekül und wenigstens einen pharmazeutischen Träger oder Exzipienten.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei das Transfermolekül ausgewählt ist unter organischen Verbindungen, Proteinen, Proteinfragmenten und Nukleinsäuren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder Anspruch 19 zur Verwendung in der Therapie.
Verwendung eines photosensitivierenden Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon und eines Transfermoleküls für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Therapie, wobei das photosensitivierende Mittel und das Transfermolekül (entweder getrennt oder gleichzeitig oder nacheinander) mit Zellen oder Geweben eines Patienten in Kontakt gebracht werden und diese Zellen oder Gewebe mit Licht einer Wellenlänge bestrahlt werden, das zur Aktivierung des photosensitivierenden Mittels befähigt ist.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Transfermolekül ausgewählt ist unter organischen Verbindungen, Proteinen, Fragmenten von Proteinen und Nukleinsäuren.
Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Therapie eine Krebs- oder Gentherapie ist.
Verwendung nach Anspruch 21 oder 22 zur Behandlung von rheumatoider Arthritis, Arteriosklerose, viralen Infektionen, Psoriasis, Sonnenkeratose, Wunden, Frakturen, Warzen, cystischer Fibrose, Gorlin-Syndrom oder Ataxia teleangiectasia.
Verwendung eines photosensitivierenden Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon und eines Transfermoleküls, das ausgewählt ist unter einem Gen, kodierend für ein therapeutisches Protein, einem Antisense-DNA oder RNA-Molekül, einem Ribozym, einem Aptamer, einem Triplexbildenden Oligonukleotid, einer Peptidnukleinsäure (PNA), einer Transkriptionsfaktor „Decoy" DNA und einem chimeren Oligonukleotid, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Gentherapie.
Verwendung nach Anspruch 25 zur Behandlung von Krebs, cardiovaskulären Erkrankungen, viralen Infektionen oder monogenen Erkrankungen, wie cystischer Fibrose.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 18 bis 20 oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei der Photosensitizer und/oder das Transfermolekül an ein Carrier-Molekül, ein Targeting-Molekül oder einen Vektor gebunden, damit assoziiert oder konjugiert ist.
Verwendung eines photosensitivierenden Mittels gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 13 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines therapeutischen Agens zur Verwendung bei der Behandlung jeglicher maligner, prä-maligner oder nicht-maligner Abnormalität oder Erkrankung, die auf Photochemotherapie anspricht.
Verwendung nach Anspruch 28 zur Behandlung von Tumoren oder anderen Wucherungen, Hauterkrankungen, Hautabrasionen und anderen Erkrankungen oder Infektionen.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Hauterkrankung Psoriasis, aktinische Keratose oder Akne ist.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Infektion eine bakterielle, virale oder Pilzinfektion ist.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei die Infektion eine Herpesvirusinfektion ist.
Produkt, umfassend ein photosensitivierendes Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zusammen mit wenigstens einem die Oberflächen-Penetration unterstützenden Agens und/oder oder einem oder mehreren chelatbildenden Agenzien, als Kombinationspräparat zur simultanen, getrennten oder sequenziellen Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen oder Abnormalitäten externer oder interner Oberflächen des Körpers, welche auf Photochemotherapie ansprechen.
Kit zur Verwendung in der Photochemotherapie von Erkrankungen oder Abnormalitäten externer oder interner Oberflächen des Körpers, umfassend: (a) einen ersten Behälter, enthaltend ein photosensitivierendes Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon; (b) einen zweiten Behälter, enthaltend wenigstens ein die Oberflächen-Penetration unterstützendes Agens; und gegebenenfalls (c) ein oder mehrere chelatbildende Agenzien, welche entweder im ersten Behälter oder in einem dritten Behälter enthalten sind.
Verfahren zur in vitro-Diagnose von Abnormalitäten oder Erkrankungen, bei dem man eine Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes eines Patienten untersucht, wobei diese Methode umfasst: (i) das Vermischen der Körperflüssigkeit oder des Gewebes mit einem photosensitivierenden Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon; (ii) die Lichtexposition dieses Gemisches; (iii) die Bestimmung der Stärke der Fluoreszenz und (iv) den Vergleich der Fluoreszenzstärke mit Kontrollwerten.