PL206900B1 - Srodek fotouczulający zawierający pochodną porfiryny, sposób jego wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna takiego środka, jego zastosowanie oraz produkt zawierający taki środek - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy środka fotouczulającego zawierającego pochodną porfiryny i sposobu jego wytwarzania. Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja takiego środka fotouczulającego jego oraz zastosowania w internalizacji fotochemicznej cząsteczek i w terapii fotodynamicznej.

W dziedzinie tej znanych jest szeroki zakres środków fotouczulających. Po ekspozycji na światło mogą one stać się toksyczne lub mogą uwalniać substancje toksyczne, takie jak tlen singletowy lub inne rodniki utleniające, które uszkadzają materiał komórkowy lub biocząsteczki, w tym błony i struktury komórkowe, a takie uszkodzenie komórki lub błony może w końcu doprowadzić do zabicia komórek. Te działania cytotoksyczne są stosowane w leczeniu różnych nieprawidłowości lub zaburzeń, w tym chorób nowotworowych. Takie postępowanie jest znane pod nazwą terapia fotodynamiczna (PDT) i obejmuje podawanie środków fotouczulających (fotochemoterapeutycznych) do zaatakowanego obszaru ciała, po czym ekspozycji na światło aktywujące w celu aktywacji środków fotouczulających i przekształcenia ich w formę cytotoksyczną, co powoduje zabicie chorych komórek lub zmniejszenie ich potencjału proliferacyjnego.

Ostatnio zaproponowano efekt fotodynamiczny jako narzędzie do wprowadzania do cytosolu komórki cząsteczek nie przepuszczanych przez błony komórkowe w taki sposób, że nie musi to prowadzić do zniszczenia lub śmierci komórki. W metodzie tej, znanej jako „internalizacja fotochemiczna” lub PCI, internalizowana lub przenoszona cząsteczka jest doprowadzana do komórki w połączeniu ze środkiem fotouczulającym. Ekspozycja komórek na światło odpowiedniej długości fali aktywuje związek fotouczulający, co z kolei prowadzi do rozerwania błon kompartmentu komórkowego i następnie uwolnienia cząsteczki do cytosolu.

Środki fotouczulające mogą wywierać swoje działanie poprzez różne mechanizmy, bezpośrednio lub pośrednio. Tak więc, przykładowo, pewne fotouczulacze mogą po aktywacji przez światło stać się bezpośrednio toksyczne, natomiast inne działać generując toksyczne cząsteczki, np. środki utleniające takie jak tlen singletowy lub tlenowe wolne rodniki, które są wyjątkowo destrukcyjne dla materiału cząsteczkowego i biocząsteczek, takich jak lipidy, białka i kwasy nukleinowe.

Znanymi środkami fotouczulającymi są na przykład psoraleny, porfiryny, chloryny i ftalocyjaniny. Fotouczulacze porfirynowe działają bezpośrednio przez generowanie toksycznych cząstek tlenowych i są uważane za szczególnie korzystnych kandydatów dla PDT. Porfiryny są występującymi w naturze prekursorami w syntezie hemu. W szczególności, hem jest wytwarzany kiedy żelazo (Fe²⁺) ulega inkorporowaniu do protoporfiryny IX {PpIX) pod działaniem enzymu ferrochelatazy. PpIX jest wyjątkowo silnym fotouczulaczem, natomiast hem nie ma działania fotouczulającego.

W dziedzinie tej znane i opisane w literaturze są róż ne fotouczulacze na bazie porfiryny lub pokrewne porfirynie. Przykładami takich środków są Photofrin®, który ostatnio został zarejestrowany jako fotouczulacz w leczeniu niektórych rodzajów raka. Jednak ponieważ Photofrin® musi być podawany pozajelitowo (np. dożylnie). Jego wadą jest powodowanie długotrwałego fotouczulenia skóry, które może utrzymywać się przez kilka tygodni. Ponieważ Photofrin® składa się z dużych oligomerów porfiryny, również nie penetruje on łatwo skóry przy podawaniu miejscowym. Podobne problemy występują w przypadku innych fotouczulaczy porfirynowych, takich jak tak zwana „pochodna hematoporfiryny” (HpD), którą opisano także w zastosowaniu do fotochemioterapii raka.

Ostatnio, badano sulfonowane mezo-tetrafenyloporfiryny (TPPSn), takie jak disulfonowane mezo-tetrafenyloporfiryny TPPS2a i TPPS2a, i tetrasulfonowaną mezo-tetrafenyloporfirynę TPPS4, do stosowania jako środki fotouczulające i stwierdzono, że posiadają one pewne ważne zalety w stosunku do HpD i Photofrin®. W szczególności, mają one wysoki współczynnik guz:normalna tkanka i są przez to interesujące przy stosowaniu w fotochemioterapii (Peng et al., Cancer Lett. 35: 1-10, 1987; Evensen et al., Photodynamic therapy of tumors and other diseases (Ed. G. Jori and C. Perria), p. 215-219, Libreria Prongetto Publ., Padova; i Winkelman, Cancer Res. 22: 589-596, 1962). Ostatnio stwierdzono, że również TPPS_2a jest odpowiedni do stosowania jako fotouczulacz do fotochemicznej internalizacji makrocząsteczek (Berg et al., Cancer Res. 59: 1180-1183, 1999; Hogset et al., Hum. Gene Ther. 11: 869-880, 2000; i Selbo et al., Int. J. Cancer 87: 853-859, 2000).

Jednakże głównym problemem przy stosowaniu TPPS2a do celów klinicznych jest jej niska absorbancja światła czerwonego. Rzeczywiście, głównym ograniczeniem przy stosowaniu klinicznym znanych pochodnych porfiryny jest to, że najdłuższa długość fali światła, na którą reagują, leżąca przy około 620-630 nm, ma relatywnie niską absorbancję. Światło o takiej długości fali jest zdolne do penetrowania żywych tkanek tylko na bardzo krótkich odległościach i w konsekwencji nie jest zdolne do osiągPL 206 900 B1 nięcia głęboko położonych komórek lub tkanek, np. komórek rakowych. Zatem pożądane jest znalezienie alternatywnych związków tetrapirolowych, które nadal posiadają korzystne właściwości fotouczulaczy na bazie porfiryny, ale wykazują również wyższą absorpcję światła o dłuższych długościach fali, kiedy penetracja tkanek jest większa.

Niniejszy wynalazek stara się zaspokoić tę potrzebę, a w szczególności jego celem jest dostarczenie środków, które mają zwiększony efekt fotouczulający w stosunku do związków na bazie porfiryny opisanych w stanie techniki.

Obecnie stwierdzono, że w wyniku redukcji jednego wiązania podwójnego w makrocyklu porfirynowym sulfonowanej mezo-tetrafenyloporfiryny (np. disulfonowanej mezo-tetrafenyloporfiryny) uzyskuje się związki, mające zaskakująco wzmocnione właściwości fotouczulające. W szczególności, stwierdzono że takie związki mają ulepszone właściwości spektralne w porównaniu z odpowiadającymi porfirynami i wykazują nieoczekiwany wzrost współczynnika ekstynkcji po ekspozycji na czerwone światło, np. światło o długości fali w regionie od 630 do 680 nm. Takie związki są zatem uważane za szczególnie odpowiednie do stosowania nie tylko w konwencjonalnych metodach terapii fotodynamicznej, ale również w metodach fotochemicznej internalizacji makrocząsteczek.

Z jednego punktu widzenia wynalazek dostarcza ś rodka fotouczulają cego, który stanowi disulfonowana mezo-tetrafenylochloryna, lub jej dopuszczalna farmaceutycznie sól. W takim związku dwa pierścienie fenylowe są podstawione, każdy jedną grupą sulfonianową.

Z innego punktu widzenia wynalazek dostarcza środka fotouczulającego, który może być otrzymany przez redukcję jednego wiązania podwójnego w makrocyklu porfirynowym disulfonowanej mezo-tetrafenyloporfiryny, takiej jak TPPS2ą. Następny aspekt wynalazku stanowią dopuszczalne farmaceutycznie sole takich związków.

Środek fotouczulający według wynalazku jako pochodną porfiryny zawiera sulfonowaną mezo-tetrafenylochlorynę o worze (I), jej izomer lub farmaceutycznie dopuszczalną sól,

gdzie:

X oznacza -SO3H;

n, p, q i r każdy niezależnie oznaczają 0 lub 1; i suma n, p, q i r wynosi 2.

Formy izomeryczne związków o wzorze I, na przykład związki w których zredukowane wiązanie podwójne jest umiejscowione w którymkolwiek z trzech pozostałych pierścieni pirolowych, są również uważane za część wynalazku. Każda mieszanina izomeryczna zawierająca co najmniej jeden związek o wzorze I lub jego izomer jest uważana za część wynalazku. Przykłady izomerów związków o wzorze I, które są szczególnie odpowiednie do stosowania w wynalazku, obejmują następujące związki o wzorach la - Ic:

PL 206 900 B1

w których

X, n, p, q i r są takie jak określono powyżej.

Kiedy w związkach o wzorach I, la, Ib i Ic każdy z n, p, q i r oznacza 1, oznacza to obecność jednej grupy sulfonianowej przyłączonej do pierścienia fenylowego w dowolnej pozycji tego pierścienia (to jest orto, meta lub para). Kiedy każda z liczb n, p, q i r oznacza zero, oznacza to nieobecność jakichkolwiek podstawników pierścienia, to jest niepodstawiony fenyl.

Związkami o wzorach I, la, Ib i Ic są te, w których suma n, p, q i r wynosi 2 co oznacza obecność dwóch grup sulfonianowych. Te dwie grupy sulfonianowe mogą być obecne w tych samych lub różnych pozycjach pierścienia każdego z pierścieni fenylowych. Korzystnie, będą one obecne w tych samych pozycjach pierścienia, bardziej korzystnie w pozycji meta- lub para. Najbardziej korzystnymi są te związki, w których podstawione pierścienie fenylowe są umiejscowione sąsiednio względem siebie, np. sąsiednio względem zredukowanego pierścienia pirolowego, to jest związki o wzorze I, w których n=0, p=0, q=1 i r=1. Alternatywnymi korzystnymi związkami o wzorach I, la, Ib i Ic są te, w których suma n, p, q i r wynosi 2, a podstawione pierścienie fenylowe są umiejscowione naprzeciwko siebie, na przykład związki o wzorze I, w którym n=0, p=1, q=0 i r=1.

W każ dym pierścieniu fenylowym niezależ nie grupa sulfonianowa X może być obecna w pozycji orto-, meta- lub para. Korzystnie, będzie ona obecna w pozycji meta- lub para, najbardziej korzystnie w pozycji para. Korzystny środek fotouczulający jako chlorynę zawiera związek o wzorze II:

PL 206 900 B1

lub jego izomer lub farmaceutycznie dopuszczalną sól.

Formy izomeryczne związków o wzorze II, na przykład te, w których zredukowane wiązanie podwójne jest umiejscowione w którymkolwiek z trzech pozostałych pierścieni pirolowych również stanowią część wynalazku. Każda mieszanina izomeryczna zawierająca co najmniej jeden związek o wzorze II, i ich izomery, jest uważana za stanowiącą część wynalazku.

Szczególnie korzystnym związkiem o wzorze II jest ten, w którym dwa podstawione pierścienie fenylowe sąsiadują ze zredukowanym wiązaniem podwójnym.

Środek fotouczulający według wynalazku zawierający pochodną porfiryny, lub jej dopuszczalną farmaceutycznie sól, którą to pochodną porfiryny można wytworzyć przez redukcję jednego wiązania podwójnego w makrocyklu porfirynowym sulfonowanej mezo-tetrafenyloporfiryny o wzorze III:

(gdzie X, n, p, q i r są takie jak określono poprzednio).

Korzystnie porfirynę o wzorze III stanowi TPPS2a (disulfonowana tetrafenyloporfiryna).

Sposób wytwarzania środka fotouczulającego według niniejszego wynalazku korzystnie obejmuje co najmniej jeden z następujących etapów:

(a} redukcję sulfonowanej mezo-tetrafenyloporfiryny lub jej kompleksu chelatowego z żelazem; (b) w razie potrzeby, separację mieszaniny związków wytworzonych w etapie (a) za pomocą konwencjonalnych technik separacji; i

PL 206 900 B1 (c) przekształcenie związku utworzonego w etapie (a) lub w etapie (b), na przykład związku o wzorze I, w jego dopuszczalną farmaceutycznie sól.

Związek porfirynowy stosowany jako substrat w etapie (a) jest dostępny w handlu lub może być otrzymany przy zastosowaniu sposobów znanych w sztuce. Sulfonowane porfiryny, w tym TPPS2a (disulfonowana tetrafenyloporfiryna), są dostępne na przykład z firmy Porphyrin Products, Logan, UT, USA.

Chemiczne przekształcenie związku porfirynowego o wzorze III w odpowiadającą chlorynę w etapie (a) można uzyskać chemicznie kilkoma różnymi sposobami, na przykład stosując p-toluenosulfonylohydrazynę jako prekursor diimidu w redukcji wolnej zasady porfirynowej (patrz na przykład., Whitlock et al., J. Am. Chem. Soc. 91: 7485-7489, 1969). Alternatywnie, wytwarzanie żądanej chloryny można przeprowadzić przez redukcję odpowiadającej żelazo-porfiryny, na przykład sodem we wrzącym alkoholu izoamylowym (patrz Eisner, J. Chem. Soc. 3461-3469, 1957; and Eisner et al., J. Chem. Soc. 733-739, 1957).

Szczególnie korzystna do stosowania w wytwarzaniu związków według wynalazku jest fotochemiczna redukcja porfiryn, ewentualnie w obecności trzeciorzędowej zasady aminowej. Na przykład, wolną zasadę porfirynową można poddać fotoredukcji do chloryny w obecności aminy, zwłaszcza aminy trzeciorzędowej (patrz na przykład, Harel et al. Photochem. Photobiol. 23: 337-341, 1976).

Redukcja cząsteczki porfiryny w obecności diimidu może indukować tworzenie bakteriochloryn przez redukcję dwóch wiązań podwójnych w makrocyklu porfiryny. Proces fotoredukcji z zastosowaniem aminy, szczególnie korzystnie aminy trzeciorzędowej, jest zatem korzystny do stosowania w wytwarzaniu żądanych związków chlorynowych według wynalazku. Przykłady odpowiednich do stosowania w takim sposobie amin trzeciorzędowych obejmują trietyloaminę (TEA), N-metylopirolidon, tri-n-butyloaminę, trioktyloaminę, itp., a redukcja generalnie przeprowadzana będzie w obecności światła widzialnego (to jest fotoredukcja).

Redukcję fotochemiczną porfiryny można dogodnie prowadzić w rozpuszczalniku lub mieszaninie rozpuszczalników takich jak benzen, pirydyna, dimetylosulfotlenek, itp., w temperaturach w zakresie od 10 do 30°C, korzystnie w temperaturze pokojowej (np. 20 do 25°C, zwłaszcza 22°C).

Fotoredukcję można prowadzić stosując światło w zakresie widzialnym, np. o długości fali w zakresie od 400 do 640 nm, korzystnie 500 do 640 nm, np. około 545 ±15 nm. Promieniowanie będzie generalnie przykładane w dawce 1 do 50 W/m², np. około 15 W/m² przez okres czasu w zakresie od 1 do 90 minut, np. 5 do 40 minut. Tworzenie wszelkich niepożądanych bakteriochloryn można zmniejszyć przez ograniczenie okresu ekspozycji makrocykla porfiryny na światło. Metody napromieniowywania porfiryn, np. za pomocą lamp lub laserów, są dobrze znane w sztuce. Szczególnie odpowiednie pod tym względem są wysokociśnieniowe lampy ksenonowe lub lampa wolframowo-jodowa, taka jak lampy dostępne z firmy Philips. Typowo reakcję prowadzi się w warunkach beztlenowych, na przykład mieszanina substratów i rozpuszczalnika może być nasycona azotem przed ekspozycją na światło i ewentualnie również podczas ekspozycji na światło.

Związki według wynalazku mogą być obecne w formie mieszaniny izomerów i mogą być w tej formie stosowane. W razie potrzeby związki według wynalazku, np. te o wzorze I, można rozdzielić na ich izomery na podstawie ich różnic fizycznych/chemicznych metodami znanymi w sztuce, np. przez chromatografię i/lub krystalizację frakcjonowaną.

Jak wspomniano powyżej, związki według wynalazku mogą mieć formę dopuszczalnych farmaceutycznie soli. Korzystnymi takimi solami są sole addycyjne kwasów z dopuszczalnymi fizjologicznie kwasami organicznymi lub nieorganicznymi. Odpowiednie kwasy obejmują, na przykład, kwasy chlorowodorowy, bromowodorowy, siarkowy, fosforowy, octowy, mlekowy, cytrynowy, winowy, bursztynowy, maleinowy, fumarowy i askorbinowy. Sole hydrofobowe można dogodnie wytwarzać na przykład przez strącanie. Odpowiednie sole obejmują na przykład octan, bromek, chlorek, cytrynian, chlorowodorek, maleinian, azotan, fosforan, siarczan, winian, oleinian, stearynian, tosylan, sole wapnia, megluminy, potasowe i sodowe. Procedury wytwarzania soli są znane w sztuce.

Jak wspomniano powyżej, związki według wynalazku i ich sole mają cenne właściwości farmakologiczne, mianowicie właściwości fotouczulające, co czyni je użytecznymi w fotochemicznej internalizacji makrocząsteczek i jako środki fotochemoterapeutyczne.

Zatem w następnym aspekcie wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną, zawierającą opisany tu środek fotouczulający zawierający pochodną porfiryny, razem z co najmniej jednym dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub zaróbką, przy czym środek fotouczulający jako pochodną porfiryny zawiera sulfonowaną mezo-tetrafenylochlorynę o wzorze (I), jej izomer lub dopuszczalną farmaceutycznie sól,

PL 206 900 B1 (Χ)η (X)r

(X)q⁷ (l) gdzie:

X oznacza SO3H;

n, p, q i r każdy niezależnie oznaczają 0 lub 1; i suma n, p, q i r jest liczbą całkowitą od 1 do 4, korzystnie co najmniej 2, np. 2 lub 4.

W jeszcze innym aspekcie wynalazek dostarcza środek fotouczulający taki jak tu opisano, zawierający pochodną porfiryny o wzorze I, lub jej izomer lub dopuszczalną farmaceutycznie sól, do stosowania jako lek, np. jako środek fotouczulający do stosowania w metodzie fotochemicznej internalizacji, w fotochemioterapii lub diagnostyce.

W jeszcze innym aspekcie wynalazek dostarcza zastosowania opisanego tu ś rodka fotouczulającego zawierającego pochodną porfiryny o wzorze I, lub jej izomer lub dopuszczalną farmaceutycznie sól, do wytwarzania środka terapeutycznego do stosowania w metodzie fotochemicznej internalizacji, w fotochemioterapii lub diagnostyce, w szczególnoś ci w metodzie leczenia zaburzeń lub nieprawidł owości zewnętrznych lub wewnętrznych powierzchni ciała, które reagują na fotochemioterapię.

Stosowane tu określenie „internalizacja” odnosi się do dostarczania cząsteczek do cytosolu i obejmuje etap uwalniania cząsteczek z kompartmentów wewnątrzkomórkowych/związanych z błoną do cytosolu komórek. Termin „komórka” obejmuje wszystkie komórki eukariotyczne (w tym komórki owadów i komórki grzybów). Reprezentatywne „komórki” obejmują zatem wszelkie typy komórek zwierząt ssaków i nie ssaków, komórki roślin, komórki owadów, komórki grzybów i pierwotniaki.

Metody wprowadzania cząsteczek do cytosolu żywych komórek są użytecznymi narzędziami do manipulowania procesami biologicznymi i ich badania. Bardzo interesujące są takie metody, w których komórki po internalizacji pozostają żywotne i/lub funkcjonalne. Stosowanie środka fotouczulającego do wprowadzania cząsteczek nieprzechodzących w inny sposób przez błony do cytosolu komórki w sposób niepociągający za sobą rozległego zniszczenia komórki lub śmierci komórki proponowano na przykład w WO 96/07432 i WO 00/54802. W tej metodzie cząsteczkę, która ma być internalizowana, i zwią zek fotouczulają cy doprowadza się jednocześ nie lub kolejno do komórek, po czym zwią zek fotouczulający i cząsteczka ulegają endocytozie lub są w inny sposób przenoszone do endosomów, lizosomów lub innych kompartmentów ograniczonych błoną komórkową. Cząsteczkę, która ma być przemieszczana do wewnątrzkomórkowych kompartmentów komórek, i związek fotouczulający doprowadza się do komórek razem lub kolejno, i są one pobierane przez komórkę do kompartmentów komórkowych. Cząsteczkę, która ma być internalizowana w komórce, uwalnia się przez ekspozycję komórek na światło o odpowiedniej długości fali w celu aktywacji związku fotouczulającego, co z kolei prowadzi do rozerwania błon kompartmentów komórkowych i następnie uwolnienia cząsteczki do cytosolu. Metoda ta, w której komórki poddaje się ekspozycji na światło w celu uwolnienia cząsteczki z kompartmentu komórkowego, w którym jest zawarta, działaniem środka fotouczulającego, jest określana jako „internalizacja fotochemiczna” lub PCI.

W jeszcze innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza zatem sposobu wprowadzania czą steczki (to jest cząsteczki przenoszonej) do cytosolu komórki in vitro, który to sposób obejmuje:

(a) kontaktowanie wspomnianej komórki ze środkiem fotouczulającym takim jak tu opisano, zawierającym pochodną porfiryny, lub jej izomer lub farmaceutycznie dopuszczalną sól;

PL 206 900 B1 (b) kontaktowanie wspomnianej komórki ze wspomnianą cząsteczką przenoszoną; i (c) napromieniowywanie wspomnianej komórki światłem o długości fali skutecznej dla aktywacji środka fotouczulającego, na przykład światłem o długości fali w zakresie 300-800 nm.

Dokładny schemat czasowy dodawania cząsteczki, która ma być przenoszona (to jest cząsteczki przenoszonej) i środka fotouczulającego oraz czas napromieniowywania dla uzyskania wyżej opisanych efektów musi uwzględniać różne czynniki, w tym rodzaj komórek poddawanych takiemu postępowaniu, rodzaj cząsteczek przenoszonych, otoczenie komórek, to czy metoda ma być prowadzona in vitro, i to czy podawanie odbywa się bezpośrednio do docelowej tkanki czy do miejsca odległego. Uwzględniając to fachowiec może łatwo ustalić odpowiednie czasy. Typowo, cząsteczkę przenoszoną i środek fotouczulający będzie się dodawać do komórek przed napromieniowaniem. Na przykład, mogą być one wprowadzane od 1 do 72 godzin przed napromieniowaniem, korzystnie 4 do 48, np. 4 do 24 godzin przed napromieniowaniem.

W niektórych przypadkach, cząsteczka przenoszona będzie podawana jednocześnie ze środkiem fotouczulającym. Następny aspekt wynalazku stanowi zatem kompozycja farmaceutyczna, zawierająca środek fotouczulający taki jak tu opisano, razem z cząsteczką przenoszoną. Dodatkowo może być obecny dopuszczalny farmaceutycznie nośnik lub zaróbka.

Jeszcze inny aspekt wynalazku stanowi kompozycja farmaceutyczna, zawierająca środek fotouczulający taki jak tu opisano, w której wspomniana cząsteczka przenoszona jest wybrana z grupy składającej się ze związków organicznych, białek, fragmentów białek i kwasów nukleinowych.

Jeszcze inny aspekt wynalazku stanowi kompozycja farmaceutyczna, zawierająca środek fotouczulający taki jak tu opisano, razem z cząsteczką przenoszoną, do stosowania w terapii, np. w terapii raka lub terapii genowej.

Jeszcze inny aspekt wynalazku stanowi zastosowanie środka fotouczulającego zawierającego pochodną porfiryny, lub jej izomer lub farmaceutycznie dopuszczalną sól, takiego jak tu opisano, i cząsteczki przenoszonej, jak opisano poniżej, do wytwarzania leku do stosowania w terapii, np. w terapii raka lub terapii genowej, w której wspomniany środek fotouczulający i wspomnianą cząsteczkę przenoszoną kontaktuje się (oddzielnie, jednocześnie lub kolejno) z komórkami lub tkankami pacjenta i wspomniane komórki lub tkanki napromieniowuje ś wiatłem do długości fali skutecznej do aktywacji wspomnianego środka fotouczulającego.

Środki fotouczulające według wynalazku mogą być zatem stosowane do transportowania lub transfekowania dowolnej cząsteczki do cytosolu żywych komórek in intro (to jest w hodowli). Mogą one być stosowane nie tylko do przenoszenia cząsteczek (albo ich części lub fragmentów) do wnętrza komórki, ale również, w pewnych okolicznościach, do ich prezentacji lub ekspresji na powierzchni komórki. Tak więc, po przetransportowaniu i uwolnieniu cząsteczki przenoszonej do cytosolu komórki, jeśli dane komórki są komórkami wyspecjalizowanymi, takimi jak na przykład komórki prezentujące antygen, cząsteczka lub jej fragment może być przetransportowana do powierzchni komórki, gdzie może być prezentowana na zewnątrz komórki, to jest na powierzchni komórki. Metody takie znajdują zastosowanie szczególnie w dziedzinie szczepienia, gdzie składniki szczepionki, to jest antygeny lub immunogeny, mogą być wprowadzane do komórki do prezentacji na powierzchni tej komórki w celu indukowania, ułatwienia lub wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Dalsze szczegóły co do użyteczności umiejętności ekspresji cząsteczek na powierzchni komórki opisano w WO 00/54802.

Do cząsteczek przenoszonych, które mogą być wprowadzane do cytosolu komórek przy zastosowaniu środków fotouczulających według niniejszego wynalazku, należą cząsteczki, które nie mają zdolności łatwego przenikania przez błony komórkowe. Dodatkowo, opisane tu środki mogą zwiększać dostarczanie do cytosolu i czynność cząsteczek, które są tylko częściowo zdolne do przenikania przez błony komórkowe lub błony pęcherzyków wewnątrzkomórkowych. Cząsteczkami przenoszonymi mogą być związki organiczne, biała lub fragmenty białek, jak na przykład peptydy, przeciwciała lub antygeny lub ich fragmenty. Inną klasą cząsteczek przenoszonych, które mogą być wprowadzane przy zastosowaniu środków według wynalazku, są leki cytotoksyczne, takie jak toksyny białkowe lub cytotoksyczne związki organiczne. Przy zastosowaniu opisanych tu metod mogą być wprowadzane do cytosolu i kierowane do szczególnych komórek cząsteczki, które mogą być interesujące klinicznie w leczeniu raka, ale ogranicza to ich niskie wychwytywanie do cytosolu lub jego brak. Przykładem takiej cząsteczki jest gelonina.

Zależnie od rodzaju przenoszonej cząsteczki, opisany tu środek fotouczulający może być stosowany w terapii dotyczącej leczenia zaburzeń, takich jak artretyzm reumatoidalny, miażdżyca, infekPL 206 900 B1 cje wirusowe, łuszczyca, rogowacenie popromienne, rany, złamań, brodawek i dziedzicznych zaburzeń genetycznych, takich jak mukowiscydoza, zespół Gorlina lub zespołu ataksja-teleangiektazja.

Jeszcze inną klasę odpowiednich cząsteczek przenoszonych stanowią kwasy nukleinowe. Kwasy nukleinowe mogą być stosowane w formie genów kodujących na przykład białka terapeutyczne, anty sensowne cząsteczki RNA, rybozymy, aptamery RNA lub oligonukleotydy tworzące tripleksy. Alternatywnie, kwasy nukleinowe mogą być stosowane w formie cząsteczek niekodujących, takich jak na przykład syntetyczne antysensowne cząsteczki DNA lub RNA, rybozymy, aptamery, oligonukleotydy tworzące tripleksy, peptydowe kwasy nukleinowe (PNA), czynniki transkrypcyjne „decoy” DNA lub oligonukleotydy chimeryczne do naprawy specyficznych mutacji u pacjenta. Tam gdzie to odpowiednie, cząsteczki kwasów nukleinowych mogą być w formie całych genów lub fragmentów kwasów nukleinowych, ewentualnie włączonych do cząsteczki wektora, np. wektora plazmidowego. Ta ostatnia forma ma szczególną przydatność kiedy cząsteczka przenoszona ma być stosowana w metodach terapii genowej, w których geny są terapeutycznie przenoszone do komórek pacjenta. Może być ona stosowana w leczeniu wielu chorób, takich jak rak, choroby sercowo-naczyniowe, infekcje wirusowe i choroby jednego genu, takie jak mukowiscydoza.

Opcjonalnie, jedno albo drugie albo oba ze środka fotouczulającego i cząsteczki przenoszonej, która ma być wprowadzona do komórek, mogą być przyłączone, połączone lub sprzężone z cząsteczkami nośnika, cząsteczkami kierującymi lub nośnikami, które mogą działać ułatwiając lub zwiększając wychwyt środka fotouczulającego lub cząsteczki przenoszonej albo mogą działać kierując lub dostarczając te jednostki do szczególnego typu komórek, tkanek lub kompartmentów wewnątrzkomórkowych. Przykładami systemów nośnych są polilizyna lub inne polikationy, siarczan dekstranu, różne lipidy kationowe, liposomy, rekonstytuowane cząsteczki LDL lub stabilizowane sterycznie liposomy. Te układy nośne mogą generalnie poprawiać farmakokinetykę i zwiększać wychwyt komórkowy cząsteczek przenoszonych i/lub środka fotouczulającego i mogą również kierować cząsteczkę przenoszoną i/lub środek fotouczulający do kompartmentów komórkowych, które są szczególnie korzystne dla uzyskania internalizacji fotochemicznej, ale generalnie nie mają zdolności do kierowania cząsteczki przenoszonej i/lub środka fotouczulającego do specyficznych komórek (np. komórek rakowych) lub tkanek. Jednakże, dla uzyskania takiego specyficznego lub selektywnego kierowania cząsteczka nośnika, cząsteczka przenoszona i/lub środek fotouczulający mogą być połączone, związane lub sprzężone do specyficznych cząsteczek kierujących, które będą promować specyficzny wychwyt komórkowy cząsteczki przenoszonej do żądanych komórek lub tkanek. Takie cząsteczki kierujące mogą również kierować cząsteczkę przenoszoną do kompartmentów komórkowych, które są szczególnie korzystne dla uzyskania internalizacji fotochemicznej.

Można zastosować wiele różnych cząsteczek kierujących, np. takie jak opisano w Curiel, D.T. (1999), Ann. New York Acad. Sci. 886, 158-171; Bilbao, G. et al. (1998), w Gene Therapy of Cancer (Walden et al., eds.. Plenum Press, New York), Peng K.W. i Russell S.J. (1999), Curr. Opin. Biotechnol. 10, 454-457, Wickham T.J. (2000), Gene Ther. 7, 110-114.

Cząsteczka nośnika i/lub cząsteczka kierująca mogą być połączone, związane lub sprzężone z cząsteczką przenoszoną, ze środkiem fotouczulającym lub oboma z nich, i można stosować te same lub różne cząsteczki nośnika lub cząsteczek kierujących. Takie cząsteczki kierujące lub nośniki mogą być również stosowane do kierowania cząsteczki przenoszonej do szczególnych kompartmentów komórkowych, szczególnie korzystnych dla stosowania PCI, na przykład lizosomów lub endosomów.

Jak wspomniano powyżej, środki fotouczulające według wynalazku mogą być również stosowane w terapii fotodynamicznej, w szczególności fotochemioterapii lub diagnostyce. Takie metody są dobrze udokumentowane w literaturze patentowej i naukowej, na przykład w WO 96/28412 i 98/30242.

Środek fotouczulający według wynalazku, zawierający pochodną porfiryny, lub jej izomer lub farmaceutycznie dopuszczalną sól, gdzie ten środek terapeutyczny można stosować do leczenia nieprawidłowości i zaburzeń, które można leczyć stosując fotouczulacze w PDT, i obejmują wszelkie złośliwe, przedzłośliwe i niezłośliwe nieprawidłowości i zaburzenia odpowiadające na fotochemioterapię, na przykład guzy i inne narośla, choroby skórne, takie jak łuszczyca lub zrogowacenia popromienne i trądzik, otarcia skóry i inne choroby lub infekcje, np. bakteryjne, wirusowe lub grzybicze, na przykład infekcje wirusem opryszczki.

Wewnętrzne i zewnętrzne powierzchnie ciała, które można leczyć stosując związki według wynalazku, obejmują skórę oraz wszelkie inne powierzchnie naskórka i błon surowiczych, w tym na przykład śluzówkę, wyściółki narządów, np. układów oddechowego, żołądkowo-jelitowego i moczowo-płciowego, oraz gruczołów mających kanaliki opróżniające na takie powierzchnie (np. wątroby, miesz10

PL 206 900 B1 ków włosowych z gruczołami łojowymi, gruczołów mlecznych, gruczołów ślinowych, i pęcherzyków nasiennych). Poza skórą, powierzchnie takie obejmują wyściółkę pochwy, endometrium i urotelium. Powierzchnie takie mogą również obejmować jamy utworzone w ciele w wyniku wycięcia tkanek chorych lub rakowych, np. jamy w mózgu po wycięciu guzów takich jak glejaki.

Przykłady powierzchni obejmują zatem (i) skórę i spojówkę; (ii) wyściółkę jamy ustnej, gardła, przełyku, żołądka, jelit i kosmków jelitowych, odbytu i kanału analnego; (iii) wyściółkę kanałów nosowych, zatok przynosowych, nosogardzieli, tchawicy, oskrzeli i oskrzelików; (iv) wyściółkę moczowodu, pęcherza moczowego i cewki moczowej; (v) wyściółkę pochwy, szyjki macicy i macicy; (vi) opłucną ścienną i opłucną trzewną; (vii) wyściółkę jamy otrzewnowej i jamy miednicy, i powierzchnię narządów zawartych w tych jamach; (viii) oponę twardą i opony; (ix) wszelkie guzy tkanek litych, które mogą być udostępnione dla światła fotoaktywującego, np. bezpośrednio podczas operacji lub za pomocą włókna optycznego wprowadzonego poprzez igłę.

Kompozycje według wynalazku mogą być formułowane w typowy sposób z jednym lub więcej niż jednym z dopuszczalnych fizjologicznie nośników lub zaróbek według technik dobrze znanych w sztuce. Rodzaj kompozycji i substancji noś ników, dawek, itp., moż na wybrać w rutynowy sposób zależnie od wybranej i pożądanej drogi podawania, celu leczenia, itp. Podobnie w rutynowy sposób można określić dawki i mogą one zależeć od rodzaju cząsteczki przenoszonej (kiedy jest obecna), celu zabiegu, wieku pacjenta, sposobu podawania, itp.

Kompozycje mogą być podawane miejscowo, doustnie lub systemicznie. Dla stosowania w PDT preferowane są kompozycje miejscowe, które obejmują żele, kremy, maści, spreje, lotiony, balsamy, pałeczki, mydełka, pudry, pesaria, aerozole, krople, roztwory i wszelkie inne typowe w sztuce formy farmaceutyczne. Podawanie miejscowe do miejsc niedostępnych można uzyskać za pomocą technik znanych w sztuce, np. stosując katetery lub inne odpowiednie systemy dostarczania leków.

Alternatywnie, kompozycje można dostarczać w formie przystosowanej do podawania doustnego lub pozajelitowego, na przykład przez wstrzyknięcia doskórne, podskórne, pozajelitowe lub dożylne. Alternatywne formy farmaceutyczne obejmują zatem tabletki zwykłe lub powlekane, kapsułki, zawiesiny i roztwory zawierające składnik czynny, ewentualnie razem z jednym lub większą liczbą obojętnych nośników i/lub rozcieńczalników.

Stężenie opisanych powyżej związków w kompozycji zależy od zamierzonego zastosowania związku, rodzaju kompozycji, sposobu podawania, leczonego stanu i pacjenta i może być zmieniane lub korygowane zależnie od doboru. Jednak generalnie, do stosowania w PDT, stężenie może być zawarte w zakresie od 0,01 do 50%, np. 0,05 do 20%, np. 1-10% wagowych. Do stosowania w PCI, jest ważne aby stężenie środka fotouczulającego było takie, aby po wychwyceniu do komórki, na przykład do jednego lub więcej niż jednego z jej kompartmentów komórkowych lub połączeniu z nim, i zaktywowaniu przez napromieniowanie, uległa rozerwaniu jedna lub więcej struktur komórkowych, np.

uległ lizie lub rozerwaniu jeden lub więcej niż jeden z kompartmentów komórkowych. Na przykład, środki fotouczulające mogą być stosowane w stężeniu na przykład 10 do 50 μg/ml. Do stosowania in vitro zakres może być szerszy, np. 0,05-500 μg/ml. Przy stosowaniu opisanych tu związków w PCI, czas inkubacji komórek ze środkiem fotouczulającym (to jest czas kontaktu) może zmieniać się od kilku minut do kilku godzin, np. nawet do 48 godzin lub dłużej. Czas inkubowania powinien być taki, że środek fotouczulający jest pobierany przez odpowiednie komórki. Po inkubowaniu komórek ze środkiem fotouczulającym, przed ekspozycją na światło i/lub dodaniem cząsteczki przenoszonej, może ewentualnie następować okres inkubacji z medium wolnym od fotouczulacza.

Określanie odpowiednich dawek cząsteczek kierujących do stosowania zgodnie z wynalazkiem jest dla specjalisty rutynową praktyką. Kiedy cząstką przenoszoną jest białko lub peptyd, dla zastosowań in vitro cząsteczki przenoszone będą generalnie stosowane w dawkach poniżej 5 mg/ml (np. 0,1-5 mg/ml). Kiedy cząstką przenoszoną kwas nukleinowy, dla zastosowań in vitro przykładową dawką cząsteczek przenoszonych będzie około 0,1-50 μg kwasu nukleinowego na 10⁴ komórek.

Po podaniu opisanych tu związku lub kompozycji (np. do powierzchni ciała) dla uzyskania żądanego efektu, np. internalizacji fotochemicznej lub efektu fotochemioterapeutycznego, leczony obszar poddaje się ekspozycji na światło. Etap napromieniowania światłem w celu aktywacji środka fotouczulającego można przeprowadzić za pomocą technik i procedur dobrze znanych w sztuce. Odpowiednie źródła światła, zdolne do dostarczania żądanej długości fali i intensywności światła są znane. Czas ekspozycji powierzchni ciała lub komórek na światło w metodzie według wynalazku może być różny. Na przykład, w PCI efektywność internalizacji cząsteczki przenoszonej do cytosolu wydaje się wzrastać wraz ze wzrostem ekspozycji na światło. Generalnie, czas trwania etapu napromieniowania

PL 206 900 B1 jest rzędu minut do kilku godzin, np. korzystnie do 60 minut, np. od 1 do 30 minut, np. od 0,5 do 3 minut lub od 1 do 5 minut lub od 1 do 10 minut, np. od 3 do 7 minut, a korzystnie około 3 minut, np. 2,5 do 3,5 minut. Fachowiec może wybrać odpowiednie dawki światła i będą one zależeć od ilości fotouczulacza zakumulowanego w komórkach lub tkankach docelowych. Napromieniowanie będzie generalnie stosowane w dawce 40 do 200 dżuli/cm², na przykład 100 dżuli/cm² w zakresie fluencji poniżej 200 mW/cm².

Metody napromieniowywania różnych obszarów ciała, np. za pomocą lamp lub laserów, są dobrze znane w sztuce (zobacz na przykład Van den Bergh, Chemistry in Britain, Maj 1986 str. 430-439). W przypadku niedostępnych regionów można to dogodnie osiągnąć stosując włókna optyczne.

Związki według wynalazku można formułować i/lub podawać z innymi środkami fotouczulającymi, na przykład ALA lub Photofrin®, lub z innymi składnikami czynnymi, które mogą zwiększać efekt fotochemioterapeutyczny. Na przykład, można włączyć środki chelatujące, takie jak kwasy aminopolikarboksylowe (np. EDTA) w celu zwiększenia akumulacji Pp i przez to zwiększenia efektu fotouczulającego. Środek fotouczulający można dogodnie stosować w stężeniu 0,05 do 20% wagowych, np. 0,1 do 10%.

W celu zwiększenia efektu fotouczulającego można również stosować środki wspomagające przenikanie przez powierzchnie, takie jak dimetylosulfotlenek (DMSO). Środek zwiększający przenikanie można dogodnie stosować w zakresie stężeń 0,2 do 50% wagowych, np. około 10%.

Zależnie od leczonego stanu i rodzaju kompozycji, związki do stosowania w wynalazku mogą być podawane łącznie z takimi innymi ewentualnymi środkami, na przykład w pojedynczej kompozycji, lub mogą być podawane kolejno lub oddzielnie. Rzeczywiście, w wielu przypadkach szczególnie korzystny efekt fotochemioterapeutyczny można uzyskać stosując wcześniej środki wspomagające przenikanie przez powierzchnie w oddzielnym etapie, przed podaniem związków do stosowania w wynalazku.

W nastę pnym aspekcie, wynalazek dostarcza zatem produkt zawierający opisany tu środek fotouczulający zawierający związek o wzorze I, lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól, razem z co najmniej jednym środkiem wspomagającym przenikanie przez powierzchnie, i ewentualnie jednym lub więcej niż jednym środkiem chelatującym, jako preparat łączony do stosowania jednoczesnego, oddzielnego lub kolejnego w leczeniu zaburzeń lub nieprawidłowości zewnętrznych lub wewnętrznych powierzchni ciała, które odpowiadają na fotochemioterapię.

Z alternatywnego punktu widzenia, ten aspekt wynalazku dostarcza również zestaw do stosowania w fotochemioterapii zaburzeń lub nieprawidłowości zewnętrznych lub wewnętrznych powierzchni ciała, obejmujący:

a) pierwszy pojemnik zawierający opisany tu środek fotouczulający związek o wzorze I, lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól,

b) drugi pojemnik, zawierający co najmniej jeden środek wspomagający przenikanie przez powierzchnie; i ewentualnie

c) jeden lub więcej niż jeden środek chelatujący we wspomnianym pierwszym pojemniku albo we wspomnianym drugim pojemniku.

Będzie oczywiste, że metoda terapii przy zastosowaniu opisanych tu poprzednio związków jest nieodłącznie związana z fluorescencją leczonego zaburzenia lub nieprawidłowości. Intensywność tej fluorescencji może być wykorzystana do eliminacji nienormalnych komórek, natomiast lokalizacja tej fluorescencji może być wykorzystana do wizualizacji wielkości, zasięgu i sytuacji zaburzenia lub nieprawidłowości.

W ten sposób zidentyfikowane lub potwierdzone nieprawidłowość lub zaburzenia w miejscu badania można następnie leczyć za pomocą alternatywnych technik terapeutycznych, np. leczenia chirurgicznego lub chemicznego, lub metodą terapii według wynalazku poprzez ciągłe nagromadzanie fluorescencji albo przez dalsze stosowanie związków według wynalazku w odpowiednim miejscu. Zauważone będzie, że techniki diagnostyczne mogą wymagać niższych poziomów do wizualizacji niż stosowane w leczeniach terapeutycznych. Zatem generalnie, odpowiednie są zakresy 0,2 do 30%, np. 1-5% (w/w). Miejsca, metody i sposoby podawania rozważano poprzednio w odniesieniu do zastosowań terapeutycznych i mają zastosowania również do opisanych tu metod diagnostycznych.

Związki według wynalazku mogą być również stosowane in vitro w technikach diagnostycznych, na przykład do badania komórek zawartych w płynach ustrojowych. Dogodnie, na nieprawidłowość lub zaburzenie może wskazywać wyższa fluorescencja związana z nienormalną tkanką. Metoda ta ma wysoką czułość i może być stosowana do wczesnego wykrywania nieprawidłowości lub zaburzeń, na

PL 206 900 B1 przykład raka pęcherza lub płuc, przez badanie komórek nabłonka w próbkach odpowiednio moczu lub plwociny. Innymi użytecznymi płynami ustrojowymi, które poza moczem i plwociną mogą być stosowane do diagnostyki, są krew, łzy, płyn mózgowo-rdzeniowy, itp. Mogą być również badane próbki lub preparaty tkanek, na przykład tkanka z biopsji lub próbki szpiku kostnego. Zatem niniejszy wynalazek rozciąga się na stosowanie związków według wynalazku lub ich soli, do diagnostyki za pomocą wyżej wymienionych metod fotochemioterapii, oraz produkty i zestawy do przeprowadzania takich diagnozy.

Następny aspekt wynalazku dotyczy metody diagnostyki zaburzenia lub nieprawidłowości in vitro, przez testowanie próbki płynu ustrojowego lub tkanki pacjenta, która to metoda obejmuje co najmniej następujące etapy:

i) zmieszanie wspomnianego płynu ustrojowego lub tkanki z opisanym tu środkiem fotouczulającym zawierającym związek o wzorze I, lub jego dopuszczalną farmaceutycznie solą, ii) ekspozycję wspomnianej mieszanki na światło, na przykład światło o długości fali w zakresie 300-800 nm, iii) ustalenie poziomu fluorescencji, i iv) porównanie poziomu fluorescencji do poziomu kontroli.

Wynalazek zostanie obecnie opisany bardziej szczegółowo w poniższych, nieograniczających przykładach, w odniesieniu do załączonych figur, na których:

Figura 1 przedstawia widmo absorpcji TPPS2a w obecności trietyloaminy (TEA) w benzenie przed ekspozycją i po ekspozycji na światło monochromatyczne przez różne okresy czasu.

Figura 2 jest wykresem pokazującym efekt ekspozycji na światło na maksymalną gęstość optyczną piku TPPS_2a przy 546 »655 nm. Roztwór zawierający TPPS_2a w obecności TEA w benzenie poddano ekspozycji na światło monochromatyczne i mierzono gęstość optyczną.

Figura 3 przedstawia chromatogramy HPLC pochodnych utworzonych przez ekspozycję TPPS2a na światło. TPPS2a w obecności TEA w benzenie poddano ekspozycji na światło niemonochromatyczne i tworzenie pochodnych fluorescencyjnych badano metodą HPLC w układzie faz odwróconych. Roztwór poddano ekspozycji na światło i pobierano próbki do pomiaru.

Figura 4 przedstawia chromatogramy HPLC TPCS2a i wyciągów komórkowych z komórek V79 traktowanych TPCS_2a. Komórki V79 traktowano 1 μg/ml TPCS_2a utworzonego po 10 minutach ekspozycji na światło (a) zgodnie z figurą 3. TPCS2a ekstrahowano z komórek po 18 godzinach inkubowania i badano za pomocą HPLC (b). Na figurze wskazano czasy retencji dla pików.

Figura 5 przedstawia mikrografy fluorescencji komórek V79 traktowanych TPPS2a i TPCS2a. Komórki przed badaniem mikroskopowym inkubowano z (a) 1 μg/ml TPPS_2a lub (b) 1 μg/ml TPCS_2a przez 18 godzin, po czym inkubowano przez 1 godzinę w medium wolnym od fotouczulacza.

Figura 6 przedstawia krzywe fluencja-odpowiedź dla inaktywacji aktywności β-AGA w komórkach V79 poddanych ekspozycji na 1 μg/ml TPCS_2a przez 18 godzin, po czym inkubowaniu przez 1 godzinę w medium wolnym od fotouczulacza i następnie ekspozycji na czerwone światło.

Figura 7 przedstawia krzywe dawka-odpowiedź dla komórek V79 inkubowanych z TPPS2a i TPCS2a i poddanych ekspozycji (a) na światło czerwone lub (b) światło niebieskie. Komórki przed ekspozycją na światło inkubowano z 1 lub 2 μg/ml TPPS_2a lub 1 μg/ml TPCS_2a przez 18 godzin, po czym inkubowano przez 1 godzinę w medium wolnym od fotouczulacza.

Figura 8 przedstawia syntezę białka w komórkach V79 po łączonym działaniu fotochemicznym i geloniną. Komórki traktowano 1 μg/ml TPCS_2a pod nieobecność (kółka wypełnione) lub w obecności (otwarte kółka) 1 μg/ml geloniny i poddawano ekspozycji na światło czerwone. Słupki na tej i poprzedzających figurach pokazują standardowe odchylenia dla eksperymentów przeprowadzanych potrójnie.

P r z y k ł a d y

Materiały i metody

Materiały

Fotouczulacz TPPS2a dostarczyła firma Porphyrin Products (Logan, UT, USA). Roztwór podstawowy (2 mg/ml) TPPS2a rozpuszczono w DMSO z firmy Sigma (St. Louis, MO, USA). Geloninę nabyto z firmy Sigma. Roztwór podstawowy toksyny (2 mg/ml) sporządzono przez rozpuszczenie geloniny w proszku w PBS, pH 8,5 i trzymano do czasu stosowania w temperaturze -20°C. p-Nitrofenylo-N-acetylo-D-glukozaminid nabyto z firmy Sigma (St. Louis, MO, USA).

Wytwarzanie disulfonianu tetrafenylochloryny - TPCS2a

Disulfonian tetrafenylochloryny (TPCS2a) wytworzono z TPPS2a zgodnie z metodą opisaną przez Harel et al. (Photochem. Photobiol. 23: 337-341, 1976).

PL 206 900 B1

Wytworzono mieszaninę 950 μl benzenu/trietyloaminy (TEA) (18:7), 32 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i 18 μl TPPS_2a (z roztworu 1 mg/ml w DMSO) i nasycano przez 5 minut azotem w kuwecie 1 ml. Następnie mieszaninę poddano ekspozycji na światło z 500 W wysokociśnieniowej lampy ksenonowej wyposażonej w monochromator dyfrakcyjny Bausch and Lomb. Kuwetę poddawano ekspozycji na światło 545 ±15 nm przy 15 W/m². Gęstość strumienia cząstek monitorowano za pomocą fotodetektora UDT 11 A z filtrem radiometrycznym 223. Widmo absorpcji mierzono regularnie za pomocą spektrofotometru Perkin-Elmer Lambda 15 UV/VIS. Droga światła wynosiła 1 cm.

Do produkcji TPCS2a na dużą skalę (do badań komórkowych) mieszaninę wytworzono w kolbie pokrytej folią plastykową i podczas ekspozycji na światło przepłukiwano w sposób ciągły azotem. Drogę światła utrzymywano poniżej 1 cm. Mieszaninę poddano ekspozycji na zespół lamp TL'/03 i podczas ekspozycji na światło delikatnie wstrząsano. Po napromieniowaniu mieszaninę liofilizowano i rozpuszczono w DMSO.

Hodowla komórek

Użyto komórek ustalonej linii V79 (ATCC CCL-93) otrzymanej z fibroblastów płucnych chomików. Komórki namnażano w pożywce MEM zawierającej 10% bydlęcej surowicy osocza (FOS from Gibco, Paisley, UK), 100 j. ml^-1 penicyliny i 100 μg ml^-1 streptomycyny (Gibco) w temperaturze 37°C w inkubatorze przepłukiwanym powietrzem o zawartości 5% CO2. Komórki pasażowano dwa razy w tygodniu.

Znakowanie fotouczulaczem

Komórki zaszczepiono w kolbach 25 cm² (Nunclon, Denmark) zawierających pożywkę MEM z 10% FCS i pozostawiono w temperaturze 37°C przez 4-5 godzin dla właściwego przywarcia do podłoża. Następnie komórki przepłukano 3 razy pożywką i poddano ekspozycji przez 18 godzin na 1 μg/ml TPPS2a lub TPCS2a w pożywce zawierającej osocze. Następnie komórki przemyto 3 razy pożywką wolną od fotouczulacza i przed ekspozycją na światło inkubowano przez 1 godzinę. Następnie komórki poddano ekspozycji na światło czerwone (Phillips TL 20 W/09) przefiltrowane przez filtr Cinemoid 35 lub filtr światła błękitnego (Appl. Photophysics, Nood. 3026, London). Gęstości strumienia cząstek dochodzącego do komórek wynosiły 1,35 mW/cm² i 1,5 mW/cm² odpowiednio z lamp czerwonej i błękitnej.

Test toksyczności

Przetrwanie komórek mierzono za pomocą testu tworzenia kolonii, jak opisali Berg et al. (Photochem. Photobiol. 53: 203-210, 1991). 1500 komórek inokulowano w plastykowych kolbach do hodowli komórek o powierzchni 25 cm² i traktowano fotouczulaczem i światłem tak jak opisano powyżej. Po obróbce fotochemicznej komórki V79 pozostawiono na 5 dni w temperaturze 37°C w pożywce hodowlanej zawierającej osocze w celu umożliwienia tworzenia zliczalnych kolonii. Następnie komórki utrwalono w etanolu, wybarwiono błękitem metylenowym i zliczano kolonie. Hamowanie syntezy białek oceniano za pomocą inkorporowania do białek [³H]-leucyny, które mierzono w 24 godziny po ekspozycji na światło w sposób opisany przez Llorente et al. (FEBS Lett. 431: 200-204, 1998).

HPLC

Porfiryny ekstrahowano z komórek przez zdrapywanie komórek w zakwaszonym metanolu (5 μl stężonego HCl w 10 ml metanolu) w sposób opisany przez Berg et al. (Br. J. Cancer 74: 688-697, 1996). Pozostałość komórek peletkowano i zebrano supernatant. Porfiryny zatężano przez przepłukiwanie ekstraktów N₂ aż do zredukowania objętości do około 150 - 200 μl i dodatkowo wytrącone białka peletkowano. 100 μl supernatanta zmieszano z 235 μl 10 mM Na₂PO₄, pH ustawiono na około 10,5 za pomocą 5 M KOH, i stosowano bezpośrednio do analizy HPLC. Za pomocą tej procedury porfiryny ekstrahowano z komórek w sposób ilościowy. Roztwory podstawowe fotouczulaczy rozcieńczano bezpośrednio w buforze startowym.

Układ HPLC składał się z pompy (Spectra Physics 8800), kolumny do faz odwróconych (Supelcosil LC-18-T (4,6 x 250 mm), Supelco, S.A., Gland, Switzerland), detektora fluorescencji (fluoromonitor LDC III) i integratora (Spectra Physics Data-jet) podłączonego do komputera. Rozpuszczalnik A stanowiła mieszanina metanolu i wody (30:70 objętościowo) zawierająca 1,5 mM fosforanu, pH ustawione na 7,0. Rozpuszczalnik B stanowiła mieszanina metanolu i wody (95:5 objętościowo) zawierająca 1,5 mM fosforanu, pH ustawione na 7,5. Stosowano 30 minutowy liniowy gradient między 40 a 20% rozpuszczalnika A, następnie 5 minutowy liniowy gradient do 100% rozpuszczalnika B. Detekcję fluorescencji przeprowadzano przez wzbudzanie w regionie długości fali 330-400 nm. Światło rozproszone eliminowano z fluorescencji za pomocą filtra odcinającego przesyłającego tylko światło o długości fali dłuższej niż 410 nm.

PL 206 900 B1

Fluorescencją mikroskopowa

W badaniach mikroskopowych stosowano pł ytki o powierzchni 28 cm² (Falcon 3002, Becton Dickinson, Plymouth, UK). Komórki przemywano raz PBS i na wierzchu warstwy PBS delikatnie umieszczano przykrywkę szklaną. Następnie komórki badano za pomocą mikroskopu Zeiss Axioplan (Zeiss, Obercochen, Germany) wyposażonego w epifluorescencję. Do wzbudzania używano lampy rtęciowej HBO/100 W. Komórki i fluorescencje komórkową badano za pomocą kamery z chłodzonym przyrządem ze sprzężeniem ładunkowym (COD) (TE2, Astromed, Cambridge, UK). Działanie kamery kontrolowano za pomocą komputera, który stosowano również do cyfrowego przetwarzania danych i ich przechowywania. Mikroskop był wyposaż ony we wzbudzeniowy filtr pasmowoprzepustowy 390-440 nm, rozdzielacz wiązki dwubarwnej 470 nm i filtr długopasmowoprzepustowy 610 nm.

Test enzymatyczny

Inaktywację fotochemiczną enzymu lizosomowego β-AGA mierzono w sposób opisany przez Beaufay et al. (J. Cell Biol. 61: 188-200, 1974). Metoda oparta jest na tworzeniu p-nitrofenolu (z substratu p-nitrofenylo-N-acetylo-D-glukozaminidu), które można mierzyć spektrofotometrycznie przy 420 nm. Komórki wyizolowywano natychmiast po ekspozycji na światło i preparowano do analizy enzymatycznej.

P r z y k ł a d 1

Fotochemiczna redukcja TPPS₂._a

Zgodnie z metodą opisaną przez Harel et al. (Photochem. Photobiol. 23: 337-341, 1976), TPPS_2a poddano ekspozycji na światło w roztworze trietyloaminy (TEA) w benzenie nasyconym azotem. Roztwór poddano ekspozycji na światło 545 nm w kuwecie, tak jak opisano w rozdziale „Materiały i metody”.

Figura 1 pokazuje zmianę widma absorpcji po ekspozycji na światło i widmo dla produktu końcowego, które jest charakterystyczne dla chloryn. Pik pasma I z pasm Q przesunął się od 646 nm do 655 nm i jego intensywność w maksimum wzrosła 5,8-krotnie (fig. 2). Zaobserwowano punkt izobestyczny przy 593 nm oraz przy 505 nm, 518 nm i 577 nm. Pasma absorpcji po napromieniowaniu są charakterystyczne dla chloryn.

W celu zwiększenia skali produkcji chloryn do badań komórkowych poddano ekspozycji na światło i przeróbce tak jak opisano w rozdziale „Materiały i metody” większe objętości roztworów TPPS2a. Skala czasowa dla zwiększenia piku absorpcji przy 655 nm była podobna do opisanej powyżej, jak pokazano na fig. 2. Tworzenie chloryny obserwowano za pomocą HPLC, jak pokazano na fig. 3, która pokazuje że utworzyło się kilka izomerów chloryny. Do dalszego traktowania hodowli komórkowych stosowano roztwory po 10 minutowej ekspozycji na światło. Około 23% produktu po 10 minutach napromieniowania miało podobny czas retencji do TPPS2a, ale pik miał typowe dla chloryn widmo absorpcji.

P r z y k ł a d 2

Badanie fotobiologiczne TPCS₂._a

Do badań biologicznych fotochemicznych efektów chloryny TPCS_2a zastosowano linię komórkową V79 fibroblastów płucnych chomików. Komórki inkubowano przez noc z chloryną, ekstrahowano fotouczulacz z komórek i komórki badano za pomocą HPLC. Jak pokazano na fig. 4, obraz pików fluorescencji w ekstraktach komórkowych był podobny do obrazu dla roztworu podstawowego. Do chromatografii zastosowano kolumnę C-18 do faz odwróconych, i generalnie czas retencji wzrastał wraz z hydrofobowością związków. Stwierdzono, że wychwyt komórkowy chloryny wzrasta wraz z hydrofobowością izomerów.

Poprzednio stwierdzono, że fotouczulacz TPPS2a lokalizuje się w pęcherzykach endocytowych komórek inkubowanych z tym związkiem (Berg et al. Photochem. Photobiol. 52: 481-487, 1990). Stwierdzono, że wewnątrzkomórkowa lokalizacja TPCS2a była podobna do lokalizacji TPPS2a, co wskazuje że TPCS2a również lokalizuje się w pęcherzykach endocytowych (patrz fig. 5). Wykazano to również przez inaktywację fotochemiczną enzymu lizosomowego β-N-acetylo-glukozaminidazy (zobacz fig. 6). Zatem przez porównanie obrazu fluorescencji wewnątrzkomórkowej lokalizującego się w lizosomach fotouczulacza TPPS2a, wykazano że TPCS2a lokalizuje się w pęcherzykach endocytowych komórek V79 pośrednio za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i bezpośrednio za pomocą pomiarów inaktywacji fotochemicznej enzymu lizosomalnego 13-AGA.

Zaletą stosowania chloryny zamiast porfiryn w terapii fotodynamicznej jest wyższy współczynnik ekstynkcji chloryny w czerwonym obszarze długości fali. Wykazano to wyraźnie przez porównanie ekspozycji komórek traktowanych TPPS2a i TPCS2a na światło niebieskie i czerwone (zobacz fig. 7). Na figurze 7b widoczne jest, że komórki traktowane TPPS2a lub TPCS2a były równie wrażliwe na świaPL 206 900 B1 tło niebieskie, natomiast komórki traktowane TPCS2a były około 6 razy bardziej wrażliwe na światło czerwone niż komórki traktowane porfiryną, TPPS2a (fig. 7a).

Wewnątrzkomórkową lokalizację TPCS2a w pęcherzykach endocytowych i zatem możliwość jej stosowania w fotochemicznej internalizacji (PCI) makrocząsteczek badano przez internalizację geloniny, toksyny białkowej inaktywującej rybosomy typu 1. Stwierdzono, że gelonina wywiera niską toksyczność sama lub w połączeniu ze światłem (Berg et al. Cancer Res. 59: 1180-1183, 1999). W komórkach traktowanych 1 μg/ml geloniny przez 18 godzin synteza białkowa zmniejszyła się o około 10%. Jednakże, jak pokazano na fig. 8, TPCS2a i światło silnie wzmagają cytotoksyczność geloniny, mierzona syntezą białek w 24 godziny po ekspozycji na światło. Nastąpiło niewielkie (20%) zmniejszenie syntezy białek pod wpływem samej TPCS2a, którego nie obserwowano w testach klonogenności. Te wyniki wykazują, że gelonina jest internalizowana w komórkach po traktowaniu fotochemicznym TPCS2a.

Omówienie

Badania niniejsze wykazały, że disulfonowana tetrafenyloporfiryna może być zredukowana do formy chloryny przez redukcję fotochemiczną w obecności TEA w warunkach beztlenowych. Redukcja fotochemiczna prowadzi do 5,8-krotnego wzrostu współczynnika ekstynkcji pasma I z pasm Q, spowodowanego przez tworzenie kilku izomerów chloryny. W porównaniu z macierzystą porfiryną TPPS2a, stwierdzono że zdolność fotouczulająca chloryny TPCS2a w komórkach V79 jest jednakowo skuteczna pod względem fotouczulania komórek na fotoinaktywację światłem niebieskim i 6-krotnie bardziej skuteczna ze światłem czerwonym.

Wykazano pośrednio za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, że TPCS2a lokalizuje się w pęcherzykach endocytowych komórek V79. Potwierdzono to bezpośrednio za pomocą pomiarów inaktywacji fotochemicznej enzymu lizosomalnego β-AGA. Szybkość inaktywacji β-AGA w stosunku do przeżywania komórek okazała się podobna do tej wcześniej stwierdzonej dla TPPS2a (Berg et al., Int. J. Cancer 59: 814-822, 1994), co wskazuje na podobny rozkład tych związków między błonami pęcherzyków endocytowych i ich światłem.

Wykazano również, że TPCS2a może być wykorzystana jako fotouczulacz do internalizacji fotochemicznej (PCI) makrocząsteczek, co wykazała PCI geloniny.

Claims (23)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Środek fotouczulający zawierający pochodną porfiryny, znamienny tym, że jako pochodną porfiryny zawiera sulfonowaną mezo-tetrafenylo chlorynę o wzorze (I), jej izomer lub dopuszczalną farmaceutycznie sól,

   PL 206 900 B1 gdzie:

   X oznacza SO3H;

   n, p, q i r każdy niezależnie oznaczają 0 lub 1; i suma n, p, q i r wynosi 2.
2. 2. Środek fotouczulający według zastrz. 1, w którym suma n, p, q i r wynosi 2, a każda grupa X jest obecna w tej samej pozycji pierścienia w każdym z pierścieni fenylowych.
3. 3. Środek fotouczulający według zastrz. 2, w którym wspomnianą pozycją pierścienia jest pozycja meta lub para.
4. 4. Środek fotouczulający według zastrz. 1 albo 2, albo 3, w którym suma n, p, q i r wynosi 2, a podstawione pierścienie fenylowe są usytuowane sąsiednio do zredukowanego pierścienia pirolowego.
5. 5. Środek fotouczulający według zastrz. 1, w którym wspomnianą chlorynę stanowi związek o wzorze (II):

   jego izomer lub dopuszczalna farmaceutycznie sól.
6. 6. Środek fotouczulający zawierający pochodną porfiryny, lub jej dopuszczalną farmaceutycznie sól, znamienny tym, że tę pochodną porfiryny otrzymuje się przez redukcję jednego wiązania podwójnego w makrocyklu porfirynowym sulfonowanej mezo-tetrafenyloporfiryny o wzorze (III):

   w którym X, n, p, q i r są okre ś lone jak w zastrz. 1.

   PL 206 900 B1
7. 7. Środek fotouczulający według zastrz. 6, w którym wspomnianą porfirynę o wzorze (III) stanowi TPPS2a (disulfonian tetrafenyloporfiryny).
8. 8. Sposób wytwarzania środka fotouczulającego określonego jak w zastrz. 1 do 7, który to sposób obejmuje co najmniej jeden z następujących etapów:

   (a) redukcję sulfonowanej mezo-tetrafenyloporfiryny lub jej kompleksu chelatowego z żelazem;

   (b) w razie potrzeby, separację mieszaniny zwią zków utworzonej w etapie (a); i (c) konwersję związku utworzonego w etapie (a) lub etapie (b) w jego dopuszczalną farmaceutycznie sól.
9. 9. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca środek fotouczulający zawierający pochodną porfiryny, razem z co najmniej jednym dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub zaróbką, znamienna tym, że środek fotouczulający jako pochodną porfiryny zawiera sulfonowaną mezo-tetrafenylochlorynę o wzorze (I), jej izomer lub dopuszczalną farmaceutycznie sól, gdzie:

   X oznacza SO3H;

   n, p, q i r każ dy niezależ nie oznaczają 0 lub 1; i suma n, p, q i r jest liczbą całkowitą od 1 do 4, korzystnie co najmniej 2, np. 2 lub 4.
10. 10. Środek fotouczulający zawierający pochodną porfiryny, jej izomer lub farmaceutycznie dopuszczalną sól, określony jak w zastrz. 9, do stosowania jako lek.
11. 11. Zastosowanie środka fotouczulającego zawierającego pochodną porfiryny, jej izomer lub farmaceutycznie dopuszczalną sól, określonego jak w zastrz. 9, do wytwarzania środka terapeutycznego do stosowania w metodzie fotochemicznej internalizacji, w fotochemioterapii lub diagnostyce.
12. 12. Sposób wprowadzania cząsteczki przenoszonej do cytosolu komórki in vitro, który to sposób obejmuje:

    (a) kontaktowanie wspomnianej komórki ze środkiem fotouczulającym zawierającym pochodną porfiryny, jej izomer lub farmaceutycznie dopuszczalną sól, określonym jak w zastrz. 9;

    (b) kontaktowanie wspomnianej komórki ze wspomnianą cząsteczką przenoszoną; i (c) napromieniowywanie wspomnianej komórki światłem o długości fali skutecznej dla aktywacji środka fotouczulającego.
13. 13. Kompozycja farmaceutyczna określona jak w zastrz. 9, która dalej zawiera cząsteczkę przenoszoną.
14. 14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 13, w której wspomniana cząsteczka przenoszona jest wybrana z grupy składającej się ze związków organicznych, białek, fragmentów białek i kwasów nukleinowych.
15. 15. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 13 albo 14 do stosowania w terapii.
16. 16. Zastosowanie według zastrz. 11 środka fotouczulającego zawierającego pochodną porfiryny, jej izomer lub farmaceutycznie dopuszczalną sól, określonego jak w zastrz. 9, i cząsteczki przenoszonej, np. określonej jak w zastrz. 14, do wytwarzania leku do stosowania w terapii, np. w terapii raka lub terapii genowej, w której wspomniany środek fotouczulający i wspomnianą cząsteczkę przenoszoną kontaktuje się (oddzielnie, jednocześnie lub kolejno po sobie) z komórkami lub tkankami pacjenta

    PL 206 900 B1 i wspomniane komórki lub tkanki napromieniowuje się światłem o długości fali światła skutecznej do aktywacji wspomnianego środka fotouczulającego.
17. 17. Zastosowanie według zastrz. 16, w którym terapia dotyczy leczenia artretyzmu reumatoidalnego, miażdżycy, infekcji wirusowych, łuszczycy, zrogowacenia popromiennego, ran, złamań, brodawek, mukowiscydozy, zespołu Gorlina lub zespołu ataksja-telangiektazja.
18. 18. Zastosowanie według zastrz. 16, w którym ta cząsteczka przenoszona jest wybrana z grupy składającej się z genu kodującego białko terapeutyczne, cząsteczki antysensownego DNA lub RNA, rybozymu, aptameru, oligonukleotydu tworzącego triplex, peptydowego kwasu nukleinowego (PNA), czynnika transkrypcyjnego DNA „decoy” i oligonukleotydu chimerycznego, i w którym lek ten jest do stosowania w metodzie terapii genowej, np. metodzie leczenia raka, w chorobach sercowo-naczyniowych, infekcjach wirusowych lub chorobach jednogenowych, takich jak mukowiscydoza.
19. 19. Kompozycja farmaceutyczna jak zastrzegana w zastrz. 13 do 15 albo zastosowanie jak zastrzegane w zastrz. 16 do 18, w których wspomniany środek fotouczulający i/lub wspomniana cząsteczka przenoszona są przyłączone, związane lub sprzężone z cząsteczką nośnika, cząsteczką kierującą lub wektorem.
20. 20. Zastosowanie według zastrz. 11, w którym ten środek terapeutyczny jest do stosowania w leczeniu wszelkich niezłośliwych, przedzłośliwych lub złośliwych nieprawidłowości lub zaburzeń odpowiadających na fotochemioterapię, np. guzów i innych wzrostów, zaburzeń skóry takich jak łuszczyca lub zrogowacenia popromienne i trądzik, abrazji skórnych, i innych chorób lub infekcji, np. bakteryjnych, wirusowych lub grzybiczych, na przykład infekcji wirusa opryszczki.
21. 21. Produkt zawierający środek fotouczulający zawierający pochodną porfiryny, jej izomer lub dopuszczalną farmaceutycznie sól, znamienny tym, że ta pochodna porfiryny jest określona jak w zastrz. 9, razem z co najmniej jednym środkiem wspomagającym przenikanie przez powierzchnie i/lub co najmniej jednym środkiem chelatującym, jako preparat łączony do jednoczesnego, oddzielnego lub kolejnego stosowania w leczeniu zaburzeń lub nieprawidłowości zewnętrznych lub wewnętrznych powierzchni ciała, które odpowiadają na fotochemioterapię.
22. 22. Zestaw do stosowania w fotochemioterapii zaburzeń lub nieprawidłowości zewnętrznych lub wewnętrznych powierzchni ciała, zawierający:

    (a) pierwszy pojemnik zawierający środek fotouczulający zawierający pochodną porfiryny, jej izomer lub dopuszczalną farmaceutycznie sól, znamienny tym, że ta pochodna porfiryny jest określona jak w zastrz. 9;

    (b) drugi pojemnik, zawierający co najmniej jeden środek wspomagający przenikanie przez skórę; i ewentualnie (c) jeden lub więcej środków chelatujących zawartych we wspomnianym pierwszym pojemniku lub w trzecim pojemniku.
23. 23. Sposób diagnostyki in vitro zaburzeń lub nieprawidłowości przez testowanie próbki płynu ustrojowego lub tkanki pacjenta, obejmujący:

    i) zmieszanie wspomnianego płynu ustrojowego lub tkanki ze środkiem fotouczulającym zawierającym pochodną porfiryny, jej izomer lub farmaceutycznie dopuszczalną sól, określonym jak w zastrz. 9;

    ii) ekspozycję wspomnianej mieszanki na światło;

    iii) ustalenie poziomu fluorescencji; i iv) porównanie poziomu fluorescencji z poziomami kontroli.