ES2265047T3 - Clorinas sulfonadas como fotosensibilizadores. - Google Patents

Abstract

Un agente fotosensibilizante que comprende una meso-tetrafenilclorina sulfonada, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Clorinas sulfonadas como fotosensibilizadores.

Compuesto

La presente invención se refiere a nuevos agentes fotosensibilizantes y a su uso en internalización fotoquímica de moléculas y en terapia fotodinámica.

Se conoce en la técnica un amplio conjunto de agentes fotosensibilizantes. Tras exposición a luz estos pueden llegar a ser tóxicos o pueden liberar sustancias tóxicas tales como oxígeno en estado atómico u otros radicales oxidantes que son dañinos para el material celular o las biomoléculas, incluyendo las membranas de células y estructuras de células, y tal daño celular o a la membrana puede asesinar de forma eventual las células. Estos efectos citotóxicos se han usado en el tratamiento de varias anormalidades o trastornos, incluyendo enfermedades neoplásticas. Este tratamiento se conoce como terapia fotodinámica (PDT) e involucra la administración de agentes fotosensibilizantes (fotoquimioterapéuticos) a la zona afectada del cuerpo, seguido de exposición a luz activante con el fin de activar los agentes fotosensibilizantes y transformarlos en la forma citotóxica, con lo que las células afectadas son asesinadas o se reduce su potencial proliferativo.

Más recientemente, el efecto fotodinámico se ha propuesto como una herramienta para la introducción de moléculas impermeables de la membrana de otro modo en el citosol de una célula, de modo que esto no da como resultado necesariamente la destrucción celular o muerte. En este procedimiento, conocido como "internalización fotoquímica" o PCI, la molécula que se va a internalizar o transferir se aplica a las células en combinación con un agente fotosensibilizante. La exposición de las células a luz de una longitud de onda adecuada activa el compuesto fotosensibilizante que, por el contrario, lleva a la ruptura de las membranas del compartimento intracelular y a la subsiguiente liberación de la molécula en el citosol.

Los agentes fotosensibilizantes pueden ejercer sus efectos mediante una variedad de mecanismos, directa o indirectamente. Así, por ejemplo, ciertos fotosensibilizadores llegan a ser directamente tóxicos cuando son activados por luz, mientras que otros actúan para generar especies tóxicas, por ejemplo, agentes oxidantes tales como oxígeno en estado atómico o radicales libres derivados de oxígeno, que son extremadamente destructivos para el material celular y biomoléculas tales como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos.

Los agentes fotosensibilizantes conocidos incluyen, por ejemplo, los psoralenos, las porfirinas, las clorinas y las ftalocianinas. Los fotosensibilizadores de porfirina actúan indirectamente mediante generación de especies de oxígeno tóxicas, y se designan como candidatos particularmente favorables para PDT. Las porfirinas son precursores de origen natural en la síntesis de hemo. En particular, el hemo se produce cuando el hierro (Fe^{2+}) se incorpora en protoporfirina IX (PpIX) mediante la acción del enzima ferroquelatasa. PpIX es un fotosensibilizador extremadamente potente, mientras que el hemo no tiene efecto fotosensibilizante.

Se conoce una variedad de fotosensibilizadores basados en porfirina o relacionados con porfirina en la técnica y se describen en la bibliografía. Ejemplos de tales agentes incluyen Photofrin® que se ha aprobado recientemente para uso como un fotosensibilizador en el tratamiento de ciertos cánceres. Sin embargo, debido a que Phototrin® se debe administrar por vía parenteral (por ejemplo, intravenosa), este tiene la desventaja de provocar fotosensibilización prolongada de la piel que puede durar varias semanas. Debido a que la Photofrin® comprende oligómeros de porfirina de gran tamaño, no penetra fácilmente la piel cuando se aplica por vía tópica. Existen problemas similares con otros fotosensibilizadores basados en porfirina tales como el denominado "derivado de hematoporfirina" (HpD) que se ha descrito también para uso en fotoquimioterapia de cáncer.

Más recientemente se han investigado meso-tetrafenilporfirinas sulfonadas (TPPS_{n}), tales como las meso-tetrafenilporfinas disulfonadas TPPS_{2a} y TPPS_{2o}, y las meso-tetrafenilporfina tetrasulfonada TPPS_{4}, para uso como agentes fotosensibilizantes y se ha encontrado que poseen algunas ventajas importantes respecto a HpD y Photofrin®. En particular tienen una relación tumor:tejido normal alta y por tanto son de interés para uso en fotoquimioterapia (Peng y col., Cancer Left, 36: 1 a 10, 1987; Evensen y col., Phtodynamic therapy of tumors and other diseases (Ed. G. Jori y C. Peria), páginas 215 a 219, Libreria Prongetto Publ., Padova; y Wilkelman, Cancer Res. 22: 289 a 596, 1962). Se ha encontrado también recientemente que la TPPS_{2a} es adecuada para uso como un fotosensibilizador para internalización fotoquímica de macromoléculas (Berg y col., Cancer Res. 59: 1180 a 1183, 1999; Høgset y col., Hum. Gene Ther. 11: 869 a 880, 2000; y Selbo y col., Int. J. Cancer 87: 853 a 859, 2000).

Sin embargo, la desventaja principal en el uso de TPPS_{2a} para fines clínicos es su baja absorbancia de luz roja. Incluso una limitación principal del uso clínico de todos los derivados de porfirina conocidos es que la mayor longitud de onda de luz a la que estos responden tiene una absorbancia relativamente baja que se encuentra a aproximadamente en 620 a 630 nm. A estas longitudes de onda la luz es sólo capaz de penetrar una corta distancia dentro de los tejidos vivos y en consecuencia es incapaz de alcanzar las células o tejidos asentados en profundidad, por ejemplo, las células tumorales. Por tanto es deseable encontrar compuestos de tetrapirrol alternativos que sigan poseyendo las propiedades ventajosas de los fotosensibilizadores basados en porfirina conocidos, pero que también muestran mayor absorción de luz a longitudes de onda mayores donde la penetración del tejido sea mayor.

La presente invención busca dirigir esta necesidad y en particular ayuda a proporcionar agentes que tengan un efecto fotosensibilizante mejorado frente a aquellos compuestos basados en porfirina descritos en la técnica anterior.

Se ha encontrado ahora que la reducción de un enlace doble en el macrociclo de porfirina de una meso-tetrafenilporfirina sulfonada (por ejemplo una meso-tetrafenilporfirina disulfonada) da lugar a compuestos que tienen de forma sorprendente propiedades fotosensibilizantes mejoradas. En particular, tales compuestos tienen mejores propiedades espectrales en comparación con las porfirinas correspondientes y se ha encontrado que muestran un aumento inesperado en el coeficiente de extinción tras exposición a luz roja, por ejemplo, a luz que tenga una longitud de onda en la región de 630 a 680 nm. Se considera, por tanto, que tales compuestos son particularmente adecuados para uso, no sólo en procedimientos convencionales de terapia fotodinámica, sino también en procedimientos de internalización fotoquímica de macromoléculas.

Así pues, según un aspecto, la invención proporciona un agente fotosensibilizante que comprende una meso-tetrafenilclorina sulfonada, por ejemplo, una meso-tetrafenilclorina disulfonada, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En tales compuestos, al menos uno de los cuatro anillos de fenilo portará de forma típica 1, 2 ó 3, preferiblemente 1 grupo sulfonato. Los compuestos preferidos de acuerdo con la invención incluyen aquellos en los que dos anillos de fenilo están sustituidos cada uno por un grupo sulfonato simple.

Según un aspecto más, la invención proporciona un agente fotosensibilizante que se obtiene mediante reducción de un enlace doble en el macrociclo de porfirina de una meso-tetrafenilporfirina sulfonada, en particular un agente que se obtiene mediante reducción de un enlace doble en el macrociclo de porfirina de una meso-tetrafenilporfirina disulfonada tal como TPPS_{2a}. Las sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos forman un aspecto adicional de la invención.

Ejemplos de agentes fotosensibilizantes de acuerdo con la invención incluyen aquellos compuestos de fórmula I:

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(en la que

X es -SO-{3}H;

n, p, q y r son cada uno independientemente O ó 1; y

la suma de n, p, q y r es un número entero de 1 a 4, preferiblemente al menos 2, por ejemplo, 2 ó 4) y sales farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Las formas isoméricas de los compuestos de fórmula I, por ejemplo aquellas en las que el enlace doble reducido se localiza en alguno de los tres anillos de pirrol restantes, también se considera que forman parte de la invención. Cualquier mezcla isomérica que comprenda al menos un compuesto de fórmula I o un isómero del mismo se considera que forma parte de la invención. Ejemplos de isómeros de compuestos de fórmula I que son particularmente adecuados para uso en la invención incluyen los siguientes compuestos de fórmulas la a Ic:

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(en las que X, n, p, q y r son como se definieron anteriormente en esta invención).

En los compuestos de fórmulas I, Ia, Ib y Ic, cuando cualquiera de n, p, q y r sea 1, esto significa la presencia de un grupo sulfonato simple unido al anillo de fenilo en cualquier posición de anillo (es decir, orto-, meta- o para-). En aquellos casos en donde más de un grupo sulfonato está presente, estos pueden estar presentes en las mismas o diferentes posiciones de anillo dentro de cada anillo de fenilo. Preferiblemente, estos estarán presentes en las mismas posiciones del anillo, lo más preferiblemente en la posición meta o para. Cuando cualquiera de n, p, q y r sea cero, esto significa la ausencia de cualquier sustituyente del anillo, es decir, fenilo no sustituido.

Compuestos particularmente preferidos de fórmulas I, Ia, Ib y Ic son aquellos en los que la suma de n, p, q y r es 2. Los más preferidos son aquellos compuestos en los que los anillos de fenilo sustituidos son adyacentes de forma adecuada a cada uno de los otros, por ejemplo, adyacentes al anillo de pirrol reducido, es decir en el que n=O, p=O, q=1 y r=1 en los compuestos de fórmula I. Compuestos preferidos alternativos de fórmulas I, Ia, Ib y Ic incluyen aquellos en los que la suma de n, p, q y r es 2 y los anillos de fenilo sustituidos están situados en frente de forma adecuada unos de otros, por ejemplo, compuestos de fórmula en la que n=O, p=1, q=O y r=1.

Independientemente en cada anillo de fenilo el grupo sulfonado X puede estar presente en la posición orto, meta o para. Preferiblemente, este estará presente en la posición meta o para, lo más preferiblemente la posición para. Compuestos preferidos de acuerdo con la invención incluyen los compuestos de fórmula II:

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Se considera también que forman parte de la invención formas isoméricas de los compuestos de fórmula II, por ejemplo, aquellas en las que el enlace doble reducido está localizado en alguno de los tres anillos de pirrol restantes. Cualquier mezcla isomérica que comprenda al menos un compuesto de fórmula II, e isómeros del mismo, se considera que forma parte de la invención.

Un compuesto particularmente preferido de fórmula II es aquel en el que los dos anillos de fenilo sustituidos son adyacentes al enlace doble reducido.

Los compuestos de la invención se pueden preparar usando procedimientos convencionales y procedimientos bien conocidos en la técnica.

De la forma más conveniente estos se pueden preparar mediante reducción de la porfirina correspondiente.

Así pues según un aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de los compuestos de la invención, comprendiendo dicho procedimiento al menos una de las siguientes etapas:

(a) reducción de una tetrafenilporfirina sulfonada o un completo quelato de hierro de la misma, por ejemplo reduciendo un tetrafenilporfirina de fórmula III:

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o un complejo quelato de hierro de la misma

(en la que X, n, p, q y r son como se definieron anteriormente en esta invención);

(b) si se desea, separación de la mezcla de compuestos formada en la etapa (a) mediante técnicas de separación convencionales; y

(c) transformación de un compuesto formado en la etapa (a) o etapa (b), por ejemplo, un compuesto de fórmula I, en una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En la etapa (a) el compuesto de porfirina usado como un material de partida se encuentra comercialmente disponible, o se puede obtener usando procedimientos conocidos en la técnica. Se encuentran disponibles porfirinas sulfonadas, incluyendo TPPS_{2a} (tetrafenilporfina disulfonada), por ejemplo, en Porphyrin Products, Logan, UT, Estados Unidos.

La transformación química del compuesto de porfirina de fórmula III en la clorina correspondiente en la etapa (a) se puede conseguir químicamente de varias formas distintas, por ejemplo, usando p-toluenosulfonilhidrazina como un precursor de diimida en la reducción de la porfirina base libre (véase, por ejemplo, Whitlock y col., J. Am. Chem. Soc. 91: 7485 a 7489, 1969). De forma alternativa, la producción de la clorina deseada se puede efectuar mediante la reducción de la hierro-porfirina correspondiente, por ejemplo, con sodio en alcohol isoamílico en ebullición (véase Eisner, J. Chem. Soc. 3461 a 3489, 1957; y Eisner y col., J. Chem. Soc. 733 a 739, 1957).

Particularmente preferido para uso en la preparación de compuestos de la invención es la reducción fotoquímica de porfirinas, de forma opcional en presencia de una base de amina terciaria. Por ejemplo, se puede fotorreducir una porfirina base libre en presencia de una amina, especialmente una amina terciaria (véase, por ejemplo, Harel y col., Photochem, Photobiol, 23, 337 a 341, 1976).

La reducción de la molécula de porfirina en presencia de dimida puede inducir la formación de bacterioclorinas mediante reducción de dos enlaces dobles en el macrociclo de porfirina. Por tanto se prefiere un procedimiento de fotorreducción que usa una amina, en particular preferiblemente una amina terciaria, para uso en la producción de los compuestos de clorina deseados de la invención. Ejemplos de aminas terciarias adecuadas para uso en un procedimiento de este tipo incluyen trietilamina (TEA), N-metilpirrolidona, tri-n-butilamina, trioctilamina, etc., y la reducción se efectuará por lo general en presencia de luz visible (es decir, fotorreducción).

La reducción fotoquímica de una porfirina se puede llevar a cabo de forma conveniente en un disolvente o mezcla de disolventes tales como benceno, piridina, dimetilsulfóxido, etc. a temperaturas en el intervalo de 10 a 30ºC, preferiblemente a temperatura ambiente (por ejemplo, de 20 a 25ºC, especialmente 22ºC).

La reducción fotoquímica de una porfirina se puede efectuar usando luz en el intervalo visible, por ejemplo, que tenga una longitud de onda en el intervalo de 400 a 640 nm, preferiblemente de 500 a 640 nm, por ejemplo de aproximadamente 545 \pm 15 nm. La irradiación se aplicará por lo general a un nivel de dosis de 1 a 50 W/m^{2}, por ejemplo aproximadamente 15 W/m^{2} durante un periodo de tiempo en el intervalo de 1 a 90 minutos, por ejemplo de 5 a 40 minutos. La formación de cualquier bacterioclorina no deseada se puede reducir limitando el periodo durante el cual el macrociclo de porfirina esté expuesto a la luz. Son bien conocidos en la técnica los procedimientos de irradiación de la porfirina, por ejemplo, usando lámparas o láseres. Es particularmente adecuada a este respecto una lámpara de xenon de alta presión o una lámpara de tungsteno y yodo tales como las disponibles en Philips. De forma típica, la reacción se lleva a cabo en condiciones anaerobias, por ejemplo, la mezcla de los materiales de partida y disolvente se pueden saturar con nitrógeno antes de la exposición a luz y, de forma opcional, también durante la exposición a luz.

Los compuestos de la invención pueden estar presentes en la forma de una mezcla de isómeros y se pueden usar en esta forma. Si se desea, los compuestos de la invención, por ejemplo, aquellos de fórmula I, se pueden separar en sus isómeros en base a sus diferencias físicas/químicas mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante cromatografía y/o cristalización fraccionada.

Como se mencionó anteriormente, los compuestos de la invención pueden tomar la forma de sales farmacéuticamente aceptables. Tales sales son preferiblemente sales de adición de ácido con ácidos orgánicos o inorgánicos fisiológicamente aceptables. Ácidos adecuados incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, láctico, cítrico, tartárico, succinico, maleico, fumárico y ascórbico. Las sales hidrófobas se pueden producir también de forma conveniente por ejemplo mediante precipitación. Sales apropiadas incluyen, por ejemplo, sales de acetato, bromuro, cloruro, citrato, clorhidrato, maleato, mesilato, nitrato, fosfato, sulfato, tartrato, oleato, estearato, to-
silato, calcio, meglumina, potasio y sodio. Son convencionales en la técnica los procedimientos para formación de sal.

Como se mencionó anteriormente, los compuestos de la invención y sus sales tienen propiedades farmacológicas de valor, a saber propiedades fotosensibilizantes que los hacen útiles para internalización fotoquímica de macromoléculas y como agentes fotoquimioterapéuticos.

Por tanto, según un aspecto más la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente fotosensibilizante como se describió en esta invención, por ejemplo un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con al menos un vehículo o excipiente farmacéutico.

Aún según un aspecto más la invención proporciona un agente fotosensibilizante como se describe en esta invención, por ejemplo, un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso como un medicamento, por ejemplo como un agente fotosensibilizante para uso en un procedimiento de internalización fotoquímica, en fotoquimioterapia o diagnóstico.

Todavía según un aspecto más, se proporciona el uso de un agente fotosensibilizante como se describe en esta invención, por ejemplo, un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un agente terapéutico para uso en un procedimiento de internalización fotoquímica, en fotoquimioterapia o diagnóstico, en particular en un procedimiento de tratamiento de trastornos o anormalidades de superficies externas o internas del cuerpo que responden a fotoquimioterapia.

"Internalización" tal como se usa en esta invención, se refiere a la liberación citosólica de moléculas e incluye la etapa de liberación de moléculas de compartimentos de unión intracelular/membrana en el citosol de las células. El término "célula" se usa en esta invención para incluir todas las células eucarióticas (incluyendo células de insecto y células fúngicas). De este modo "células" representativas incluyen todos los tipos de células de animales mamíferos y no mamíferos, células de plantas, células de insectos, células fúngicas y protozoos.

Los procedimientos para la introducción de moléculas en el citosol de células vivas son herramientas útiles para la manipulación y estudio de procedimientos biológicos. Son de gran interés aquellos procedimientos en los que las células se mantienen viables y/o funcionales tras la internalización. Se ha propuesto el uso de un agente fotosensibilizante para la introducción de otras moléculas impermeables de membrana en el citosol de una célula de forma que no da lugar necesariamente a una gran destrucción celular o muerte celular, por ejemplo, en los documentos WO 96/07432 y WO 00/54802. En este procedimiento la molécula que se va a internalizar y un compuesto fotosensibilizante se aplican de forma simultánea o secuencial a las células, tras lo cual el compuesto fotosensibilizante y la molécula se endocitosan o se translocalizan por otros medios en endosomas, lisosomas u otros compartimentos restringidos de membrana intracelular. La molécula que se translocaliza en compartimentos intracelulares de las células y el compuesto fotosensibilizante se aplican a las células conjuntamente o de forma secuencial y son recogidos por la célula en compartimentos intracelulares. La molécula que se va a internalizar dentro de la célula es liberada por exposición de las células a luz de longitudes de onda adecuadas para activar el compuesto fotosensibilizante que en cambio conduce a la ruptura de las membranas del compartimento intracelular y a la liberación subsiguiente de la molécula en el citosol. Este procedimiento, en el que las células se exponen a luz para liberar la molécula en cuestión desde el compartimento intracelular en el que está contenida mediante la acción de un agente fotosensibilizante, se denomina "internalización fotoquímica" o PCI.

Un procedimiento de introducción de una molécula (es decir, una molécula de transferencia) en el citosol de una célula bien in vitro o in vivo, comprende poner en contacto dicha célula con un agente fotosensibilizante como se describe en esta invención, por ejemplo, un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, poniendo en contacto dicha célula con la molécula que se va a introducir e irradiando dicha célula con luz de una longitud de onda efectiva para activar el agente fotosensibilizante, por ejemplo, luz que tenga una longitud de onda en el intervalo de 300 a 800 nm.

La temporización exacta de la adición de la molécula que es transferida (es decir, la molécula de transferencia) y el agente fotosensibilizante y la temporización de irradiación para conseguir los efectos anteriormente descritos necesita tener en cuenta varios factores, incluyendo las células que se van a tratar, la naturaleza de las moléculas de transferencia, el ambiente de las células, si el procedimiento se lleva a cabo in vitro o in vivo, y si la administración se dirige al tejido diana o a un sitio distante. Teniendo en cuenta estas consideraciones se pueden determinar fácilmente las temporizaciones apropiadas por parte de los especialistas en la técnica. De forma típica la molécula de transferencia y el agente fotosensibilizante se añadirán a las células antes de la irradiación. Por ejemplo, estos se pueden aplicar bien de forma simultánea o por separado de 1 a 72 horas antes de la irradiación, preferiblemente de 4 a 48, por ejemplo de 4 a 24 horas antes de la irradiación.

En determinados casos, la molécula de transferencia se administrará de forma simultánea con el agente fotosensibilizante. Según un aspecto más la invención proporciona así una composición farmacéutica que comprende un agente fotosensibilizante como se describe en esta invención, junto con una molécula de transferencia. Puede estar presente de forma adicional un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Aún según un aspecto más la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente fotosensibilizante como se describe en esta invención, junto con una molécula de transferencia, para uso en terapia, por ejemplo para uso en cáncer o terapia génica.

Todavía según un aspecto más la invención proporciona el uso de un agente fotosensibilizante como se describe en esta invención y/o una molécula de transferencia para la preparación de un medicamento para uso en terapia, por ejemplo, terapia de cáncer o génica, en el que dicho agente fotosensibilizante y dicha molécula de transferencia se ponen en contacto (bien por separado, simultánea o secuencialmente) con células o tejidos de un paciente y dichas células o tejidos son irradiados con luz de una longitud de onda efectiva para activar dicho agente fotosensibilizante.

Así pues los agentes fotosensibilizantes de la invención se pueden usar para transportar o transfectar cualquier molécula al citosol de células vivas bien in vitro (es decir, en cultivo) o in vivo. Estos se pueden usar no sólo para transferir moléculas (o partes o fragmentos de las mismas) al interior de una célula sino también, en ciertas circunstancias, para presentarlas o expresarlas sobre la superficie celular. Así pues, tras el transporte y liberación de una molécula de transferencia en el citosol celular, si la(las) célula(s) en cuestión es(son) célula(s) especializada(s), tal como por ejemplo células que presentan antígeno, la molécula o fragmento se pueden transportar a la superficie de la célula donde esta puede estar presente en la parte exterior de la célula, es decir, sobre la superficie celular. Tales procedimientos presentan utilidad particular en el campo de la vacunación, donde se pueden introducir componentes de vacuna, es decir antígenos o inmunógenos, en una célula para presentación sobre la superficie de esa célula con el fin de inducir, facilitar, o aumentar una respuesta inmune. Se describen más detalles en cuanto a la utilidad de la capacidad de expresar moléculas sobre la superficie celular en el documento WO 00/54802.

Las moléculas de transferencia que se pueden introducir en el citosol de células usando los agentes fotosensibilizantes de la presente invención incluyen moléculas que no penetran fácilmente las membranas celulares. De forma adicional, los agentes descritos en esta invención pueden aumentar la liberación en citosol y actividad de moléculas que son sólo parcialmente capaces de penetrar la membrana de la célula o las membranas de vesículas intracelulares. Las moléculas de transferencia pueden ser compuestos orgánicos, proteínas o fragmentos de proteínas tales como, por ejemplo, péptidos, anticuerpos o antígenos o fragmentos de los mismos. Otra clase de moléculas de transferencia que se pueden introducir usando los agentes de la invención son fármacos citóxicos tales como toxinas de proteína o compuestos orgánicos citotóxicos. Moléculas que puede ser de interés clínico para tratamiento de cáncer, pero que están restringidas por captación baja o nula en el citosol se pueden introducir en el citosol y dirigir a células específicas cuando se usan los procedimientos descritos en esta invención. La gelonina es un ejemplo de una molécula de este tipo.

Dependiendo de la naturaleza de la molécula de transferencia, los procedimientos descritos en esta invención se pueden usar para el tratamiento de varios trastornos, tales como artritis reumatoide, arteroesclerosis y otras enfermedades cardiovasculares, virus y otras infecciones, psoriasis, queratosis solar, curación de heridas, curación de fracturas, verrugas y trastornos genéticos heredados tales como fibrosis cística, síndrome de Gorlin y ataxia telangiectasia.

Aún otra clase de moléculas de transferencia apropiadas son los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se pueden usar en la forma de genes que codifican, por ejemplo, proteínas terapéuticas, moléculas de ARN antisentido, ribocimas, aptámeros de ARN u oligonucleótidos formadores de triple hélice. De forma alternativa los ácidos nucleicos se pueden usar en la forma de moléculas que no codifican tales como, por ejemplo, moléculas antisentido de ADN o ARN sintéticas, ribocimas, aptámeros, oligonucleótidos formadores de triple hélice, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ADN de factor de transcripción "decoy" u oligonucleótidos quiméricos para reparación de mutaciones específicas en el paciente. Cuando sea apropiado las moléculas de ácido nucleico puede estar en la forma de genes completos o fragmentos de ácido nucleico incorporadas opcionalmente en una molécula vector, por ejemplo, un vector plásmido. La última forma tiene aplicabilidad particular cuando la molécula de transferencia se va a usar en procedimientos de terapia génica en la que los genes se transfieren terapéuticamente a una célula del paciente. Esto se puede usar en el tratamiento de muchas enfermedades tales como cáncer, enfermedades cardiovasculares, infecciones virales, y trastornos monogénicos tales como fibrosis cística.

De forma opcional, uno u otro o ambos de los agentes fotosensibilizantes y la molécula de transferencia que se va a introducir en las células pueden estar unidas a o asociadas con o conjugadas con moléculas vehículo, moléculas diana o vectores que pueden actuar para facilitar o aumentar la captación del agente fotosensibilizante o la molécula de transferencia o pueden actuar para dirigir o liberar a estas entidades en un tipo de célula determinado, tejido o compartimento intracelular. Ejemplos de sistemas vehículo incluyen polilisina u otros policationes, sulfato de dextrán, lípidos catiónicos diferentes, liposomas, partículas de LDL reconstituidas o liposomas estéricamente estabilizados. Estos sistemas vehículo pueden mejorar por lo general la farmacocinética y aumentar la captación celular de la molécula de transferencia y/o del agente fotosensibilizante y pueden dirigir también la molécula de transferencia y/o el agente fotosensibilizante a compartimentos intracelulares que son especialmente beneficiosos para obtener internalización fotoquímica, pero no tienen en general la capacidad de dirigir la molécula de transferencia y/o el agente fotosensibilizante a células específicas (por ejemplo, células cancerígenas) o tejidos. Sin embargo, para conseguir tal direccionamiento específico o selectivo las moléculas vehículo, la molécula de transferencia y/o el fotosensibilizador pueden estar asociados con, unidos o conjugados con moléculas de direccionamiento específico que promoverán la captación celular específica de la molécula de transferencia en células o tejidos deseados. Tales moléculas de direccionamiento pueden dirigir también la molécula de transferencia a compartimentos intracelulares que son especialmente beneficiosos para obtener la internalización fotoquímica.

Se pueden usar muchas moléculas de direccionamiento diferentes, por ejemplo, como describe Curiel D.T. (1999), Ann. New York Acad. Sci. 886, 158 a 171; Bilbao G. y col. (1998) en Gene Therapy of Cancer (Walden y col., eds., Plenum Press, Nueva York), Peng K.W. y Russell S. J. (1999), Curr. Opin. Biotechnol. 10, 454 a 457, Wickham T.J. (2000), Gene Ther. 7, 110 a 114.

La molécula vehículo y/o la molécula de direccionamiento pueden estar asociadas, unidas o conjugadas con la molécula de transferencia, con el agente fotosensibilizante o ambos, y se puede usar el mismo o diferente vehículo o moléculas de direccionamiento. Tales moléculas de direccionamiento o vehículos se pueden usar para dirigir las moléculas de transferencia a compartimentos intracelulares determinados especialmente beneficiosos para el uso de PCI, por ejemplo lisosomas o endosomas.

Como se mencionó anteriormente, los agentes fotosensibilizantes de acuerdo con la invención se pueden usar en terapia fotodinámica, en particular fotoquimioterapia o diagnóstico. Tales procedimientos se encuentran bien documentados en la patente y bibliografía científica, por ejemplo, en el documento WO 96/28412 y 98/30242.

Cuando se usan los fotosensibilizadores en PDT, las anormalidades y trastornos que se pueden tratar incluyen cualquier anormalidad o trastorno maligno, pre-maligno y no maligno que responda a fotoquimioterapia, por ejemplo, tumores u otros crecimientos, trastornos de la piel tales como psoriasis o queratosis actínica y acné, abrasiones de la piel, y otras enfermedades o infecciones, por ejemplo, infecciones bacterianas, virales o fúngicas, por ejemplo infecciones por virus del herpes.

Las superficies corporales internas y externas que se pueden tratar usando los compuestos de la invención incluyen la piel y todas las demás superficies epiteliales y serosales incluyendo, por ejemplo, la mucosa, los revestimientos de órganos, por ejemplo, los tractos respiratorio, gastro-intestinal y genito-urinario y glándulas con conductos que descargan sobre tales superficies (por ejemplo, hígado, folículos capilares con glándulas sebosas, glándulas mamarias, glándulas salivales y vesículas seminales). Además de la piel, tales superficies incluyen, por ejemplo, el revestimiento de la vagina, el endometrio y el urotelio. Tales superficies pueden incluir también cavidades formadas en el cuerpo tras escisión
de tejido enfermo o canceroso, por ejemplo, cavidades cerebrales tras la escisión de tumores tales como gliomas.

Superficies ejemplo incluyen por tanto: (i) piel y conjuntivo; (ii) el revestimiento de la boca, faringe, esófago, estómago, intestinos y apéndices intestinales, recto y canal anal; (iii) el revestimiento de los pasos nasales, sinuosidades nasales, nasofaringe, tráquea, bronquios y bronquiolos; (iv) el revestimiento de los uréteres, vejiga urinaria, y uretra; (v) el revestimiento de la vagina, cerviz uterina y útero; (vi) la pleura parietal y visceral; (vii) el revestimiento de las cavidades del peritoneo y pélvicas, y la superficie de los órganos contenidos dentro de otras cavidades; (viii) la duramáter y meninges; (ix) cualquier tumor en tejidos sólidos que se pueda hacer accesible a luz fotoactivante ya sea, por ejemplo,
directamente en el momento de la cirugía, o bien mediante una fibra óptica insertada a través de una aguja.

Las composiciones de la invención se pueden formular de forma convencional con uno o varios vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica. La naturaleza de la composición y materiales vehículo o excipiente, dosificaciones etc. se pueden seleccionar de forma rutinaria de acuerdo con la elección y la ruta de administración deseada, finalidad del tratamiento etc. Las dosificaciones se pueden determinar igualmente de forma rutinaria y pueden depender de la naturaleza de la molécula de transferencia (cuando está presente), finalidad del tratamiento, edad del paciente, modo de administración etc.

Las composiciones se pueden administrar por vía tópica, oral o sistémicamente. Para uso en PDT se prefieren las composiciones para vía tópica e incluyen geles, cremas, ungüentos, pulverizaciones, lociones, pomadas, barras, jabones, polvos, pesarios, aerosoles, gotas, soluciones y cualquiera de las demás formas farmacéuticas convencionales en la técnica. La administración por vía tópica a lugares inaccesibles se puede conseguir mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante uso de catéteres u otros sistemas de liberación de fármaco apropiados.

De forma alternativa, las composiciones se pueden proporcionar en una forma adaptada para administración por vía oral o parenteral, por ejemplo, mediante inyección por vía intradérmica, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa. Formas farmacéuticas alternativas incluyen por tanto comprimidos planos o recubiertos, cápsulas, suspensiones y soluciones que contienen el componente activo opcionalmente junto con uno o varios vehículos y/o diluyentes inertes convencionales.

La concentración de los compuestos como se describen anteriormente en las composiciones, depende del uso pretendido del compuesto, la naturaleza de la composición, modo de administración, la afección que se trate y del paciente y se puede variar o ajustar según elección. Sin embargo por lo general, para uso en PDT, los intervalos de concentración del fotosensibilizador pueden estar en el intervalo de de 0,01 a 50%, por ejemplo de 0,05 a 20%, por ejemplo de 1 a 10% en peso. Para uso en PCI es importante que la concentración del agente fotosensibilizante sea tal que una vez captado dentro de la célula, por ejemplo, dentro, o asociado con, uno o varios de sus compartimentos celulares y activado mediante irradiación, una o varias estructuras celulares se rompan, por ejemplo uno o varios compartimentos intracelulares se lisan o rompen. Por ejemplo, se pueden usar agentes fotosensibilizantes a una concentración de, por ejemplo, 10 a 50 \mug/ml. Para uso in vitro el intervalo puede ser mucho más amplio, por ejemplo, de 0,05 a 500 \mug/ml. Para tratamientos humanos in vivo el agente fotosensibilizante se puede usar en el intervalo de 0,05 a 20 mg/kg de peso corporal cuando se administra sistémicamente o de 0,1 a 20% en un disolvente para aplicación por vía tópica. Cuando se usan los compuestos descritos en esta invención en PCI, el tiempo de incubación de las células con el agente fotosensibilizante (es decir, el tiempo de "contacto") puede variar de unos pocos minutos a varias horas, por ejemplo incluso hasta 48 horas o más. El tiempo de incubación debería ser tal que el agente fotosensibilizante es recogido por las células apropiadas. La incubación de las células con el agente fotosensibilizante puede ser seguida opcionalmente de un periodo de incubación con medio libre de fotosensibilizador antes de que las células se expongan a luz y/o se añada la molécula de transferencia.

La determinación de las dosis apropiadas de moléculas diana para uso de acuerdo con la presente invención es práctica rutinaria para un especialista en la técnica. Cuando la molécula de transferencia es una proteína o péptido, para aplicaciones in vitro las moléculas de transferencia se usarían por lo general a dosis inferiores a 5 mg/ml (por ejemplo de 0,1 a 5 mg/kg) y para aplicaciones in vivo las moléculas de transferencia se usarían por lo general a dosis inferiores a 5 mg/kg (por ejemplo de 0,1 a 5 mg/kg). Cuando la molécula de transferencia es un ácido nucleico, para aplicaciones in vitro una dosis ejemplo de las moléculas de transferencia sería aproximadamente de 0,1 a 50 \mug de ácido nucleico por 104 células y para aplicaciones in vivo aproximadamente de 10^{-6} a 1 g de ácido nucleico por inyección en humanos.

Tras administración de un compuesto o composición como se describe en esta invención (por ejemplo, a una superficie corporal), el área tratada se expone a luz para conseguir el efecto deseado, por ejemplo, internalización fotoquímica o efecto fotoquimioterapéutico. La etapa de irradiación de luz para activar el agente fotosensibilizante se puede efectuar de acuerdo con técnicas y procedimientos bien conocidos en la técnica. Son bien conocidas en la técnica fuentes de luz adecuadas capaces de proporcionar la longitud de onda e intensidad de luz deseadas. El tiempo durante el cual la superficie corporal o células están expuestas a luz en los procedimientos de la presente invención puede variar. Por ejemplo, en PCI la eficiencia de la internalización de las moléculas de transferencia dentro del citosol parece aumentar con mayor exposición a luz. Por lo general, el periodo de tiempo para la etapa de irradiación es del orden de minutos a varias horas, por ejemplo, preferiblemente de hasta 60 minutos, por ejemplo de 1 a 30 minutos, por ejemplo de 0,5 a 3 minutos o de 1 a 5 minutos o de 1 a 10 minutos, por ejemplo de 3 a 7 minutos, y preferiblemente de aproximadamente 3 minutos, por ejemplo de 2,5 a 3,5 minutos. Se pueden seleccionar dosis de luz apropiadas por parte de un especialista en la técnica y dependerá de la cantidad de fotosensibilizador acumulada en las células o tejidos diana. La irradiación se aplicará por lo general a un nivel de dosis de 40 a 200 Julios/cm^{2}, por ejemplo, a 100 Julios/cm^{2} a un intervalo de fluencia inferior a 200 mW/cm^{2}. La irradiación con longitudes de onda de luz en el intervalo de 500 a 750 nm, por ejemplo de 550 a 700 nm, es particularmente adecuada para uso in vivo en los procedimientos descritos en esta invención.

Un procedimiento del tratamiento fotoquimioterapéutico de trastornos o anormalidades de superficies externas o internas del cuerpo comprende la administración a las superficies afectadas de un agente fotosensibilizante como se describe en esta invención, por ejemplo, un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y exposición de dichas superficies a luz, preferiblemente a luz en la región de longitud de onda de 300 a 800 nm, por ejemplo de 500 a 700 nm.

Son bien conocidos en la técnica procedimientos para irradiación de diferentes zonas del cuerpo, por ejemplo, mediante lámparas o láseres (véase, por ejemplo, Van den Bergh, Chemistry in Britain, Mayo 1986, páginas 430 a 439). Para regiones inaccesibles esto se puede conseguir de forma conveniente usando fibras ópticas.

Los compuestos de la invención se pueden formular y/o administrar con otros agentes fotosensibilizantes, por ejemplo, ALA o Photofrin®, o con otros componentes activos que pueden mejorar el efecto fotoquimioterapéutico. Por ejemplo, se pueden incluir agentes quelantes tales como ácidos aminopolicarboxílicos (por ejemplo, EDTA), con el fin de mejorar la acumulación de Pp y aumentar así el efecto fotosensibilizante. El agente quelante se puede usar de forma conveniente a una concentración de 0,05 a 20%, por ejemplo de 0,1 a 10% en peso.

Se pueden usar también agentes de refuerzo a la penetración de superficie, en particular dialquilsulfóxidos tales como dimetilsulfóxido (DMSO) para mejorar el efecto fotoquimioterapéutico. El agente de penetración de superficie se puede proporcionar de forma conveniente en un intervalo de concentración de 0,2 a 50%, por ejemplo de aproximadamente 10% en peso.

De acuerdo con la afección que se trate, y la naturaleza de la composición, los compuestos para uso en la invención pueden ser co-administrados con otros agentes opcionales, por ejemplo, en una composición única o se pueden administrar secuencialmente o por separado. Incluso, en muchos casos se puede obtener un efecto fotoquimioterapéutico particularmente beneficioso mediante pre-tratamiento con el agente de refuerzo de penetración de superficie en una etapa a parte, antes de la administración de los compuestos para uso en la invención.

Así pues en vista de un aspecto más, la invención proporciona un producto que comprende un agente fotosensibilizante como se describe en esta invención, por ejemplo, un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con al menos un agente de refuerzo de la penetración de superficie, y de forma opcional uno o varios agentes quelantes como una preparación combinada para uso simultáneo, por separado o secuencial en tratamiento de trastornos o anormalidades de superficies externas o internas del cuerpo que responden a fotoquimioterapia.

Desde el punto de vista alternativo, este aspecto de la invención también proporciona un kit para uso en fotoquimioterapia de trastornos o anormalidades de superficies externas o internas del cuerpo que comprenden:

a) un primer recipiente que contiene una agente fotosensibilizante como se describe en esta invención, por ejemplo, un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

b) un segundo recipiente que contiene al menos un agente de refuerzo de la penetración de superficie; y de forma opcional

c) uno o más agentes quelantes contenidos bien dentro de dicho recipiente o en un tercer recipiente.

Se apreciará que el procedimiento de terapia que usa los compuestos como se describen anteriormente en esta invención involucra de forma inevitable la fluorescencia del trastorno o anormalidad que se trate. Mientras que la intensidad de esta fluorescencia se puede usar para eliminar células anormales, la localización de la fluorescencia se puede usar para visualizar el tamaño, extensión y situación de la anormalidad o trastorno.

La anormalidad o trastorno así identificado o confirmado en el sitio de investigación se puede tratar luego mediante técnicas terapéuticas alternativas, por ejemplo, tratamiento quirúrgico o químico, o mediante el procedimiento de terapia de la invención por formación continuada de fluorescencia o mediante aplicación adicional de compuestos de la invención en el sitio apropiado. Se apreciará que las técnicas de diagnóstico pueden requerir niveles inferiores de fluorescencia para visualización a los usados en tratamientos terapéuticos. Así, por lo general, son adecuados intervalos de concentración de 0,2 a 30%, por ejemplo de 1 a 5% (en p/p). Los sitios, procedimientos y modos de administración se han considerado con anterioridad en lo que respecta a los usos terapéuticos y son aplicables también a usos diagnósticos aquí descritos.

Los compuestos de la invención se pueden usar también para técnicas de diagnóstico in vitro, por ejemplo para examen de las células contenidas en fluidos corporales. La mayor fluorescencia asociada con tejido no normal puede ser indicativa convenientemente de una anormalidad o trastorno. Este procedimiento es muy sensible y se puede usar para la detección temprana de anormalidades o trastornos, por ejemplo, carcinoma de vejiga o pulmón mediante examen de las células epiteliales en orina o muestras de esputo respectivamente. Otros fluidos corporales útiles que se pueden usar para diagnóstico además de orina y esputo incluyen sangre, semen, lágrimas, fluido espinal etc. Se pueden evaluar también muestras o preparaciones de tejido, por ejemplo, muestras de tejido o médula ósea de biopsia. La presente invención se extiende así al uso de compuestos de la invención, o sales de los mismos, para diagnóstico de acuerdo con los procedimientos anteriormente mencionados para fotoquimioterapia, y productos y kits para llevar a cabo dicho diagnóstico.

Un aspecto más de la invención se refiere a un procedimiento de diagnóstico in vitro, de anormalidades o trastornos mediante ensayo de una muestra de fluido corporal o tejido de un paciente, dicho procedimiento comprende al menos las siguientes etapas:

i) mezcla de dicho fluido corporal o tejido con un agente fotosensibilizante como se describe en esta invención, por ejemplo, un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

ii) exposición de dicha mezcla a luz, por ejemplo luz que tenga una longitud de onda en el intervalo de 300 a 800 nm,

iii) comprobar el nivel de fluorescencia, y

iv) comparar el nivel de fluorescencia con niveles de control.

La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La figura 1 muestra el espectro de absorción de TPPS_{2a} en presencia de trietilamina (TEA) en benceno tanto antes como después de la exposición a luz monocromática durante varios periodos de tiempo.

La figura 2 es un gráfico que muestra el efecto de la exposición a luz a la densidad óptica máxima del pico de 646 a 655 nm de TPPS_{2a}. La solución que contiene TPPS_{2a} en presencia de TEA en benceno se expuso a luz monocromática y se midió la densidad óptica.

La figura 3 muestra cromatografías de HPLC de derivados formados mediante exposición de TPPS_{2a} a luz. Se expuso TPPS_{2a} en presencia de TEA en benceno a luz no monocromática y se evaluó mediante HPLC de fase inversa en cuanto a la formación de derivados fluorescentes. Se expuso la solución a luz y se aislaron muestras para medida.

La figura 4 muestra cromatografías de HPLC de TPCS_{2a} y extractos celulares de células V79 tratadas con TPCS_{2a}. Se trataron las células V79 con 1 \mug/ml de TPCS_{2a} formado tras 10 minutos de exposición a luz (a) de acuerdo con la figura 3. Se extrajo TPCS_{2a} de las células tras 18 horas de incubación y se evaluó mediante HPLC (b). Se indican en la figura los tiempos de retención de pico.

La figura 5 muestra micrografías de fluorescencia de células V79 tratadas con TPPS_{2a} y TPCS_{2a}. Se incubaron las células con (a) 1 \mug/ml de TPPS_{2a} o (b) 1 \mug/ml de TPCS_{2a} durante 18 horas seguido de incubación de 1 hora en medio libre de sensibilizador antes de la evaluación microscópica.

La figura 6 muestra curvas de respuesta a la fluencia para inactivación de actividad de \beta-AGA en células V79 expuestas a 1 \mug/ml de TPCS_{2a} durante 18 horas seguido de incubación de 1 hora en medio libre de sensibilizador antes de la exposición a luz roja.

La figura 7 muestra las curvas de respuesta a la dosis para células V79 incubadas con TPPS_{2a} y TPCS_{2a} y expuestas a (a) luz roja o (b) luz azul. Se incubaron las células con 1 ó 2 \mug/ml de TPPS_{2a} o 1 \mug/ml de TPCS_{2a} durante 18 horas seguido de incubación de 1 hora en medio libre de sensibilizador antes de la exposición a luz.

La figura 8 muestra la síntesis de proteína tras tratamientos fotoquímicos y con gelonina combinados en células V79. Se trataron las células con 1 \mug/ml de TPCS_{2a} en ausencia (círculos sólidos) o presencia (círculos huecos) de 1 \mug/ml de gelonina y se expusieron a luz roja. Las barras en ésta y en figuras precedentes muestran la desviación estándar de los experimentos realizados por triplicado.

Ejemplos Materiales y Procedimientos Materiales

El fotosensibilizador TPPS_{2a} fue suministrado por Porphyrin Products (Logan, UT, Estados Unidos). Se disolvió la solución madre (2 mg/ml) de TPPS_{2a} en DMSO de Sigma (St. Louis, MO, Estados Unidos). Se adquirió gelonina en Sigma. Se preparó solución madre de toxina (2 mg/ml) mediante disolución de polvo de gelonina en PBS, pH 8,5 y se mantuvo a -20ºC hasta su uso. Se adquirió p-nitrofenil-N-acetil-D-glucosaminida en Sigma (St. Louis, MO, Estados Unidos).

Preparación de disulfonato de tetrafenilclorina - TPCS_{2a}

Se preparó disulfonato de tetrafenilclorina (TPCS_{2a}) a partir de TPPS_{2a} esencialmente de acuerdo con el procedimiento descrito por Harel y col. (Photochem. Photobiol. 23: 337 a 341, 1978).

Se preparó una mezcla de 950 \mul de benceno/trietilamina (TEA) (18:7), 32 \mul de dimetilsulfóxido (DMSO) y 18 \mul de TPPS_{2a} (de una solución de 1 mg/ml en DMSO) y se saturó con nitrógeno durante 5 minutos en una cubeta de 1 ml. Se expuso luego la mezcla a la luz de una lámpara de xenon de 500 w de alta presión equipada con un monocromador de rejilla Bausch and Lomb. La cubeta se expuso a 545 \pm 15 nm de luz a 15 w/m^{2}. Se siguió la tasa de fluencia por medio de un fotodetector UDT 11 A con un filtro radiométrico 223. Se midió el espectro de absorción de forma regular mediante un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 15 UVNIS. El paso de luz fue de 1 cm.

Para producción a gran escala de TPCS_{2a} (para estudios en célula) se preparó la mezcla de un matraz cubierto con lámina de plástico y se continuó fluyendo con nitrógeno durante la exposición a la luz. Se mantuvo el paso de luz por debajo de 1 cm. Se expuso la mezcla a un banco de lámparas TL'/03 y se agitó vigorosamente durante la exposición a la luz. Tras irradiación se liofilizó la mezcla y se disolvió en DMSO.

Cultivo celular

Se usaron células de la línea establecida V79 (ATCC CCL-93) derivadas de fibroblastos de pulmón de hámster chino. Se criaron las células en medio MEM que contiene suero bovino fetal al 10% (FCS de Gibco, Paisley, RU), penicilina 100 U ml^{-1} y 100 \mug ml^{-1} de estreptomicina (Gibco) a 37ºC en un incubador por el que fluye CO_{2} al 5% en aire. Se subcultivaron las células dos veces a la semana.

Marcado con fotosensibilizador

Se inocularon las células en matraces de 25 cm^{2} (Nunclon, Dinamarca) que contienen medio MEM con FCS al 10% y se dejaron a 37ºC durante 4 a 5 horas para unión apropiada al sustrato. Subsiguientemente, se lavaron las células 3 veces con medio y se expusieron a 1 \mug/ml de TPPS_{2a} o TPCS_{2a} en medio que contiene suero durante 18 horas. Se lavaron subsiguientemente las células 3 veces con el medio libre de sensibilizador y se incubaron durante 1 hora antes de la exposición a la luz. Se expusieron luego las células a luz roja (Phillips TL 20 W/09) filtrada a través de un filtro Cinemoid 35 o luz azul (Appl. Photophysics, Nood. 3026, Londres). Las tasas de fluencia que alcanzan las células fueron 1,35 mW/cm^{2} y 1,5 mW/cm^{2} desde las lámparas roja y azul respectivamente.

Ensayos de toxicidad

Se midió la supervivencia celular mediante el ensayo de formación de colonia como describió Berg y col. (Photochem. Photobiol. 53: 203 a 210, 1991). Se inocularon 1500 células en matraces de cultivo de tejido de plástico de 25 cm^{2} y se trataron con el fotosensibilizador y luz como se describe anteriormente. Después del tratamiento fotoquímico se dejaron las células V79 durante 5 días a 37ºC en medio de cultivo que contiene suero para permitir la formación de colonias contables. Se fijaron luego las células en etanol, se tintaron con azul de metileno y se recuentan las colonias. Se valoró la inhibición de la síntesis de proteína mediante incorporación de [^{3}H]-leucina a las proteínas, medida a las 24 horas tras la exposición a la luz como describieron Llorente y col. (FEBS Left. 431: 200 a 204, 1998).

HPLC

Se extrajeron las porfirinas de las células mediante rasquetado de las células en metanol acidificado (5 \mul de HCI concentrado en 10 ml de metanol), como describió Berg y col. (Br. J. Cancer, 74: 688 a 697, 1996). Se agregó la debris celular y se recogió el sobrenadante. Se concentraron las porfirinas mediante fluencia de los extractos con N_{2} hasta que se redujo el volumen hasta aproximadamente 150 a 200 \mul y adicionalmente se agregaron las proteínas precipitadas. Se mezcló 100 \mul del sobrenadante con 235 \mul de Na_{2}PO_{4} 10 mM, se ajustó el pH hasta aproximadamente 10,5 por medio de KOH 5 M, y se usó directamente para el análisis por HPLC. Las porfirinas se extrajeron cuantitativamente de las células mediante este procedimiento. Se diluyeron soluciones madre de fotosensibilizadores directamente en el tampón de inicio.

\newpage

El sistema de HPLC consistía en una bomba (Spectra Physics 8800), una columna de fase inversa (Supelcosil LC-18-T (4,6 x 250 mm), Supelco SA., Gland, Suiza), un detector de fluorescencia (fluoromonitor Ill LDC) y un integrador (Spectra Physics Data jet) conectado a un equipo informático. El disolvente A era una mezcla de metanol y agua (30:70 en volumen) que contiene fosfato 1,5 mM, ajustado a pH 7,0. El disolvente B era una mezcla de metanol y agua (95:5 en volumen) que contiene fosfato 1,5 mM, ajustado a pH 7,5. Se aplicó un gradiente lineal de 30 minutos entre el 40 y 20% de disolvente A seguido de gradiente lineal de 5 minutos a 100% de disolvente B. Se detectó la fluorescencia mediante excitación en la región de longitud de onda de 330 a 400 nm. Se eliminó la luz dispersada de la fluorescencia por medio de un filtro de corte que transmite sólo luz con una longitud de onda mayor de 410 nm.

Microscopía de fluorescencia

Se usaron discos de 28 cm^{2} (Falcon 3002, Becton Dickinson, Plymouth, Reino Unido) en los estudios microscópicos. Se lavaron las células una vez con PBS y se dispuso un vidrio de cubrición sobre la parte superior de la capa de PBS. Se estudiaron subsiguientemente las células mediante un microscopio Zeiss Axioplan (Zeiss, Obercochen, Alemania) equipado con epifluorescencia. Se usó una lámpara de mercurio HBO/100 W para la excitación. Se estudiaron y la fluorescencia celular por medio de una cámara con dispositivo acoplado a carga refrigerado (CCD) (TE2, Astromed, Cambridge, Reino Unido). Un equipo informático controló la operación de la cámara y se usó para el procesamiento y almacenamiento de la imagen digital. Se equipó el microscopio con un filtro de excitación de tipo paso de banda de 390 a 440 nm, un divisor de haz dicróico de 470 nm y un filtro de paso largo de 610 nm.

Ensayo del enzima

Se midió la inactivación fotoquímica del enzima lisosomal \beta-AGA como describió Beaufay y col. (J. Cell. Biol. 61: 188 a 200, 1974). El procedimiento se basa en la formación de p-nitrofenol (a partir del sustrato p-nitrofenil-N-acetil-D-glucosaminida) que se puede medir espectrofotométricamente a 420 nm. Se aislaron las células inmediatamente tras exposición a luz y se prepararon para análisis enzimático.

Ejemplo 1 Reducción fotoquímica de TPPS_{2a}

De acuerdo con el procedimiento descrito por Harel y col. (Photochem. Photobiol. 23: 337 a 341, 1976), se expuso TPPS_{2a} a luz en una solución de trietilamina (TEA) en benceno saturado con nitrógeno. Se expuso la solución a luz de 545 nm en una cubeta como se describió anteriormente en "Materiales y Procedimientos".

La figura 1 muestra el cambio en el espectro de absorción tras exposición a luz y un espectro para el producto final que es característico de clorinas. El pico de la banda I de las bandas Q se desplazó de 646 nm a 655 nm y aumentó en intensidad 5,8 veces en el máximo (figura 2). Se observaron puntos isobésticos a 593 nm así como también a 505 nm, 518 nm y 577 nm. Las bandas de absorción tras irradiación son características de clorinas.

Con el fin de aumentar la escala de producción de la clorina para estudios celulares, se expusieron mayores volúmenes de soluciones de TPPS_{2a} a luz y se prepararon como se describe en "Materiales y Procedimientos". La escala de tiempo para el aumento en el pico de absorción a 655 nm fue similar a la que se describió anteriormente y se muestra en la figura 2. La formación de la clorina fue seguida de HPLC como se muestra en la figura 3, que muestra que se formaron distintos isómeros de la clorina. Se usaron además soluciones expuestas a 10 minutos de luz para el tratamiento de células en cultivo. Aproximadamente el 23% del producto tras 10 minutos de irradiación tuvo un tiempo de retención similar a TPPS_{2a}, pero el pico mostró un espectro de absorción de clorina típico.

Ejemplo 2 Evaluación fotobiolóqica de TPCS_{2a}

Se usaron fibroblastos de pulmón de hámster chino de la línea celular V79 para evaluaciones biológicas de los efectos fotoquímicos de la clorina, TPCS_{2a}. Se incubaron las células durante la noche con la clorina, se evaluaron mediante HPLC el fotosensibilizador extraído de las células y los extractos. Como se aprecia en la figura 4 el patrón de picos de fluorescencia en los extractos celulares era similar al de la solución madre. Se usó una columna C-18 de fase inversa para la cromatografía en donde en general el tiempo de retención aumentó con la hidrofobicidad de los compuestos. Se encontró que la captación celular de la clorina aumenta con la hidrofobicidad de los isómeros.

Se ha encontrado previamente que el fotosensibilizador TPPS_{2a} se localiza en vesículas endocíticas de células incubadas con este compuesto (Berg y col. Photochem. Photobiol. 52: 481 a 487, 1990). Se encontró que la localización intracelular de TPCS_{2a} es similar a la del TPPS_{2a}, lo que indica que TPCS_{2a} también se localiza en vesículas endocíticas (véase la figura 5). Esto se demostró adicionalmente mediante la inactivación fotoquímica del enzima lisosomal \beta-N-acetil-glucosaminidasa (véase la figura 6). Así, mediante comparación del modelo de fluorescencia intracelular del fotosensibilizador de localización lisosomal TPPS_{2a}, se mostró que TPCS_{2a} se localiza indirectamente en vesículas endocíticas de células V79 mediante microscopía de fluorescencia y directamente mediante medidas de inactivación fotoquímica del enzima lisosomal 13-AGA.

El beneficio del uso de una clorina en lugar de una porfirina en terapia fotodinámica es el mayor coeficiente de extinción de la clorina en la zona de longitud de onda roja. Esto se demostró claramente mediante comparación de la exposición de células tratadas con TPPS_{2a} y TPCS_{2a} en luz azul y roja (véase la figura 7). En la figura 7b se aprecia que las células tratadas con TPPS_{2a} o TPCS_{2a} eran igualmente sensibles a luz azul mientras que las células tratadas con TPCS_{2a} eran aproximadamente 6 veces más sensibles a luz roja que las células tratadas con la porfirina, TPPS_{2a} (figura 7a).

La localización intracelular de TPCS_{2a} en vesículas endocíticas y por tanto su posible uso en la internalización fotoquímica (PCI) de macromoléculas se evaluó mediante internalización de la toxina de proteína de inactivación del ribosoma tipo I gelonina. Se ha encontrado que la gelonina ejerce baja toxicidad sola o en combinación con luz (Berg y col. Cancer Res. 59: 1180 a 1183, 1999). La síntesis de proteína se redujo en aproximadamente 10% en células tratadas con 1 \mug/ml de gelonina durante 18 horas. Sin embargo, como se muestra en la figura 8, TPCS_{2a} y luz potencian fuertemente la citotoxicidad de gelonina como se mide mediante síntesis proteica durante 24 horas tras exposición a la luz. Hay una ligera reducción (20%) en la síntesis de proteína inducida por TPCS_{2a} sólo que no se observó en el ensayo de clonogenicidad. Los resultados demuestran que la gelonina se internaliza dentro de las células tras tratamiento fotoquímico con TPCS_{2a}.

Discusión

El presente estudio muestra que una tetrafenilporfina disulfonada se puede reducir hasta su forma de clorina mediante reducción fotoquímica en presencia de TEA en condiciones anaerobias. La reducción fotoquímica conduce a un aumento de 5,8 veces en el coeficiente de extinción de la banda I de las bandas Q provocado por la formación de distintos isómeros de clorina. Cuando se comparó con la porfirina padre, TPPS_{2a}, se encontró que la capacidad fotosensibilizante de la clorina TPCS_{2a} en células V79 era igualmente eficiente en células sensibilizantes en cuanto a fotoinactivación con luz azul y 6 veces más eficiente con luz roja.

Se demostró que TPCS_{2a} se localiza indirectamente en vesículas endocíticas de células V79 mediante microscopía de fluorescencia. Esto se confirmó directamente mediante medidas de inactivación fotoquímica del enzima lisosomal \beta-AGA. Se encontró que la tasa de inactivación de \beta-AGA respecto a la supervivencia celular es similar a la encontrada previamente para TPPS_{2a} (Berg y col., Int. J. Cancer 59: 814 a 822, 1994) lo que indica una distribución similar de estos compuestos entre las membranas de las vesículas endocíticas y su lumen.

Se demostró también que TPCS_{2a} se puede usar como un fotosensibilizador para internalización fotoquímica (PCI) de macromoléculas, como se demostró mediante el PCI de la gelonina.

Claims (35)

1. Un agente fotosensibilizante que comprende una meso-tetrafenilclorina sulfonada, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en la reivindicación 1, en el que al menos uno de los cuatro anillos de fenilo presentes en dicha clorina está sustituido con un grupo sulfonato.

3. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dos anillos de fenilo presentes en dicha clorina están cada uno sustituidos con un grupo sulfonato simple.

4. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicha clorina es un compuesto de fórmula (I):

5

(en la que

X es -SO_{3}H;

n, p, q y r son cada uno independientemente 0 ó 1; y

la suma de n, p, q y r es un número entero de 1 a 4);

un isómero, o una sal farmacéuticamente aceptable de alguno de los anteriores.

5. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en la reivindicación 4, en el que la suma de n, p, q y r es al menos 2.

6. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en la reivindicación 5, en el que la suma de n, p, q y r es 2 ó 4.

7. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en la reivindicación 4, en el que la suma de n, p, q y r es 2 y cada grupo X está presente en la misma posición de anillo dentro de cada anillo de fenilo.

8. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en la reivindicación 7, en el que dicha posición de anillo es la posición meta o para.

9. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que la suma de n, p, q y r es 2 y los anillos de fenilo sustituidos están situados adyacentemente al anillo de pirrol reducido.

10. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en la reivindicación 4, en el que dicha clorina es un compuesto de fórmula (II):

6

un isómero, o una sal farmacéuticamente aceptable de uno cualquiera de los anteriores.

11. Un agente fotosensibilizante que se puede obtener mediante reducción de un enlace doble en el macrociclo de porfirina de una meso-tetrafenilporfirina sulfonada, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

12. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en la reivindicación 11, en el que dicho macrociclo de porfirina es una meso-tetrafenilporfirina disulfonada.

13. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en la reivindicación 12, en el que dicha porfirina es TPPS_{2a} (disulfonato de tetrafenilporfina).

14. Un procedimiento para la preparación de un agente fotosensibilizante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, comprendiendo dicho procedimiento al menos una de las siguientes etapas:

(a) reducir una meso-tetrafenilporfirina sulfonada o un completo quelato de hierro de la misma;

(b) si se desea, separación de la mezcla de compuestos formada en la etapa (a); y

(c) transformación de un compuesto formado en la etapa (a) o etapa (b) en una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

15. Una composición farmacéutica que comprende un agente fotosensibilizante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con al menos un vehículo o excipiente farmacéutico.

16. Un agente fotosensibilizante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso como un medicamento.

17. Uso de un agente fotosensibilizante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un agente terapéutico para uso en un procedimiento de internalización fotoquímica, en fotoquimioterapia o diagnóstico.

18. Una composición farmacéutica que comprende un agente fotosensibilizante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, una molécula de transferencia y al menos un vehículo o excipiente farmacéutico.

19. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 18, en la que dicha molécula de transferencia se selecciona del grupo constituido por compuestos orgánicos, proteínas, fragmentos de proteínas y ácidos nucleicos.

20. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 18 o reivindicación 19 para uso en terapia.

21. Uso de un agente fotosensibilizante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y una molécula de transferencia, para la preparación de un medicamento para uso en terapia en el que dicho agente fotosensibilizante y dicha molécula de transferencia se ponen en contacto (bien por separado, simultáneamente o secuencialmente) con células o tejidos de un paciente y dichas células o tejidos se irradian con luz de una longitud de onda efectiva para activar dicho agente fotosensibilizante.

22. Uso como se reivindica en la reivindicación 21, en el que dicha molécula de transferencia se selecciona del grupo constituido por compuestos orgánicos, proteínas, fragmentos de proteínas y ácidos nucleicos.

23. Uso como se reivindica en la reivindicación 21 6 22, en el que dicha terapia es cáncer o terapia génica.

24. Uso como se reivindica en la reivindicación 21 o reivindicación 22, para tratamiento de artritis reumatoide, arteroesclerosis, infecciones virales, psoriasis, queratosis solar, heridas, fracturas, verrugas, fibrosis cística, síndrome de Gorlin o ataxia telangiectasia.

25. Uso de un agente fotosensibilizante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y una molécula de transferencia que se selecciona del grupo constituido por un gen que codifica para una proteína terapéutica, una molécula de ADN o ARN antisentido, un ribocima, un aptámero, un oligonucleótido formador de triple hélice, un ácido nucleico peptídico (PNA), un ADN de factor de transcripción "decoy" y un oligonucleótido quimérico, para la preparación de un medicamento para uso en un procedimiento de terapia génica.

26. Uso como se reivindica en la reivindicación 25 para el tratamiento de cáncer, enfermedades cardiovasculares, infecciones virales, o trastornos monogénicos tales como fibrosis císitica.

27. Una composición farmacéutica como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 o uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en la que dicho agente fotosensibilizante y/o dicha molécula de transferencia está unida a, asociada con o conjugada con una molécula barrera, molécula o vector de direccionamiento.

28. Uso de un agente fotosensibilizante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un agente terapéutico para uso en el tratamiento de cualquier anormalidad o trastorno maligno, pre-maligno o no maligno que responda a fotoquimioterapia.

29. Uso como se reivindica en la reivindicación 28 para el tratamiento de tumores u otros crecimientos, trastornos de piel, abrasiones de piel y otras enfermedades o infecciones.

30. Uso como se reivindica en la reivindicación 29, en el que dicho trastorno de piel es psoriasis, queratosis actínica o acné.

31. Uso como se reivindica en la reivindicación 29, en el que dicha infección es una infección bacteriana, viral o fúngica.

32. Uso como se reivindica en la reivindicación 31, en el que dicha infección en una infección viral de herpes.

33. Un producto que comprende un agente fotosensibilizante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con al menos un agente de refuerzo de la penetración de superficie y/o uno o varios agentes quelantes, como una preparación combinada para uso simultáneo, por separado o secuencial en tratamiento de trastornos o anormalidades de superficies externas o internas del cuerpo que responden a fotoquimioterapia.

34. Un kit para uso en fotoquimioterapia de trastornos o anormalidades de superficies externas o internas del cuerpo que comprenden:

a) un primer recipiente que contiene un agente fotosensibilizante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

b) un segundo recipiente que contiene al menos un agente de refuerzo de la penetración de superficie; y de forma opcional

c) uno o más agentes quelantes contenidos bien dentro del primer recipiente o en un tercer recipiente.

35. Un procedimiento de diagnóstico in vitro de anormalidades o trastornos mediante ensayo de una muestra de fluido o tejido corporal de un paciente, comprendiendo dicho procedimiento:

i) mezcla de dicho fluido o tejido corporal con un agente fotosensibilizante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

ii) exposición de dicha mezcla a luz;

iii) comprobar el nivel de fluorescencia; y

iv) comparar el nivel de fluorescencia con niveles de control.