KR20050027197A - 신규한 포르피린 화합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 광역학치료법(Photodynamic therapy:PDT)에 사용되는 광민감성 물질로서, 하기 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 표시되는 신규한 포르피린(porphyrin) 화합물과 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 본 발명은 하기 화학식1 또는 화학식2에 표시된 바와 같이 트리에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OH)기가 에스테르결합으로 연결된 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물 및 그 이성질체이다.
[화학식 1] [화학식 2]
본 발명에 따르면 기존의 광민감성 물질의 단점을 개선한 것으로, 세개의 에틸렌글리콜기를 가지는 것을 특징으로 하기 때문에, 종래에 널리 알려진 포르피린 화합물에 비하여 단일항 상태의 산소를 생성시키는 양자수율이 우수하고 물리적 안정성이 좋으며 세포독성이 우수한 효과를 가지고 있다. 또한, PDT 활성과 세포내로의 흡수성면에서 현저하게 우수한 효과를 보이고 있으며, 나아가 세포가 응집하는 문제점을 해결하여 의약 치료제로서 개발 가능성이 무한한 신규한 물질에 관한 것이다.
Description
본 발명은 광역학치료법(Photodynamic therapy)에 사용되는 광민감성 물질로 포르피린(porphyrin) 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 보다 상세하게는 트리에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2OCH2
CH2OH)기가 에스테르결합으로 연결된 것을 특징으로 하는 신규한 포르피린 화합물이다.
광역학 치료법(Photodynamic therapy, 이하 'PDT'라 함)이란, 암세포나 각종 종양에 대한 선택성 및 광활성을 가지는 광민감성 물질(photosensitizer)을 이용하여 수술을 시행하지 않고 암 등의 난치병을 치료할 수 있는 기술의 하나로서, 화학요법제와는 달리 부작용이 거의 없는 획기적인 종양치료법이다. 예를들어, 광민감제의 치료기작은 상기의 광민감성 물질을 정맥주사에 의해 대상자에 투여하고, 이에 적절한 광(light)을 조사함으로써, 여기된 광민감성 물질이 산소분자를 활성화시켜 그것을 단일항(singlet) 상태의 산소로 변환시키거나, 새로운 라디칼을 만들거나 혹은 새로운 화학종을 만들어 암세포나 각종 종양조직만을 선택적으로 공격 또는 궤멸시키는 것이다.
이러한 광민감성 물질로는 포르피린(porphyrin)류의 화합물이 대표적인데, 누에의 잠분이나 뽕잎 및 녹조류 등에서 추출되는 포르피린계 화합물은 광민감성 물질로 사용하기에 적합한 분광학적 특성을 갖고 있고, 가장 중요한 성질은 비교적 세포 투과력이 큰 적색광선(700~900nm)에 의해 전자전이를 일으키는 성질과 3중항 여기상태를 효율적으로 생성할 수 있다. 광민감성 물질로서의 포르피린 유도체는 암세포나 종양조직에 선택적으로 침투 및 축적될 뿐만 아니라 화합물의 특징상 형광이나 인광을 나타내므로 종양의 조기진단용 물질로 활용되기도 한다.
포르피린 관련기술로서, 미국 특허(U.S. Pat. Nos. 5,633,275, 5,654,423, 5,675,001, 5,703,230 및 5,705,622)와 포토프린에 관한 미국 특허(U.S. Pat. No. 4,882,234)의 물질은 이미 시장에 나와 있고, 일부는 여러 임상단계에 올라 있는 것으로 알려 지고 있는데, 상기 포토프린은 헤마토포르피린(HpD)이 에스테르결합으로 연결된 올리고머로 이루어진 혼합물이다.
또한, BPDMA(verteporphin, WO 97/29915)는 벤조포르피린 유도체로서 현재 피부암과 건선 및 노인성 황반퇴화(AMD)에 특별한 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 식도 및 기관지 암의 치료에 유용한 가능성이 타진되는 m-THPC(WO 97/48393) 또는 모노아스피틸클로린(CA 2121716; JP 09071531)은 클로린 유도체들로서 클로린 유도체도 PDT에 효과적인 물질로서 다수가 특허파일에 등록되어 있는 상황이다(WO 97/19081, WO 97/32885; EP 569113; U.S. Pat. Nos. 5,587,394, 5,648,485, 5,693,632).
이러한 포르피린계 화합물은 대부분이 메조-테트라페닐포르피린(TPP)의 유도체이거나 클로린계, 클로로필계, 푸르푸린계, 베르딘 및 딜스-알더 부가물 등이 주종을 이루며, 비 포르피린계 물질로는 5-아미노레블로닉산 및 프탈로시아닌 등이 있다.
포르피린 화합물과 관련하여 다른 일본특허공개공보 평2-76881호는 '포르피린 유도체'에 관한 것으로 카르복실기(COO-)에 저급알킬기 또는 저급알킬-O-R기가 결합되어 있는 포르피린 유도체를 기재하고 있다. 그러나 상기 일본특허공개공보에는 상위개념으로 포괄적으로만 기재되어 있을뿐, 저급알킬기로서 에틸렌글리콜기를 세개 가지는 트리에틸렌글리콜에 대해서는 전혀 나타나 있지 않다.
또 다른 일본특허공개공보 소61-7279호는 '페오포바이드 유도체 및 이것의 알칼리염류'에 관한 것으로 카르복실기(COO-)에 에틸렌글리콜(COOCH2CH2OH)이 하나 붙어있는 에틸렌글리콜모노-10b-메틸페오포베이트에 대해서 기재하고 있다. 상기 물질은 메틸페오포바이드를 에틸글리콜과 에스테르 교환하여 에틸렌글리콜모노-10b-에틸페오포바이드를 유도하고, 이것을 산가수분해에 의해 목적하는 에틸렌글리콜모노-10b-메틸페오포베이트를 제조한다. 또한, 여기에는 브롬화수소산처리, 환원 혹은 아세틸화를 실시할 수 있고, 에틸렌 글리콜 대신에 페닐아라닌 t-부틸에스테르를 가할 수 있다고 기재되어 있을 뿐, 에틸렌글리콜이 두개이상 결합되어 있는 형태는 공개공보 어디에도 전혀 나타나있지 아니하며, 에틸렌글리콜을 두개 이상 사용하여 결합시킬 수 있다는 구체적인 내용조차 일절 언급도 되어있지 않다. 오히려 카르복실기(COO-)에 아세테이트(COOCH3)를 결합시키는 내용을 위주로 기재되어 있고, 이외에 수소(H), 에틸렌글리콜(COOCH2CH2OH) 또는 이와 유사한 물질(COOCH2CH2OCOCH3)이 결합될 수 있는 것으로 기재되어 있다. 다시 말해서, 에틸렌글리콜을 세개 결합시키는 트리에틸렌글리콜은 상기 일본특허공개공보에 기재된 내용과는 상이하고, 구체적으로 기재되어 나타나 있지도 않다. 또한, 트리에틸렌글리콜이 단 하나의 에틸렌글리콜이 결합되어 있을때보다 이질적이며 현저하게 우수한 효과를 가지고 있다는 사실 역시 전혀 기재되어 있지 않았다.
광역학치료법에 사용되는 광민감성 물질로서 단일항 산소분자를 생성시키는 수율은 세포독성효과와 직접 관련이 있기 때문에, 단일항산소 생성에 대한 효율이 높으면 더욱 효과적인 세포독성효과를 나타낼 수 있다. 이것은 인체잔류시간과 더불어 광역학 치료에 아주 중요한 요소이다. 그러나 위에서 살펴본 종래기술에 의하는 경우, 단일항 산소분자를 생성시키는 수율이 미흡하고, 광역학치료(PDT)활성이 떨어지며, 더불어 배양배지에서 세포내로 흡수되지 못하는 세포응집현상이 발생하는바 광민감성 물질로서 사용하기에 부적합한 문제점이 계속 제기되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고 종래의 광민감성 물질의 단점을 개선한 것으로, 유기합성을 통하여 얻어진 새롭게 변형된 클로린계 물질로서, 단일항 상태의 산소를 생성시키는 양자수율이 우수하고 물리적 안정성이 좋으며, 세포독성효과가 우수한 포르피린 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공하고자 하는 것이다.
나아가, 종래의 일본특허공개공보에 기재되어 있는 공지기술에 비하여 PDT 활성과 세포내로의 흡수성면에서 현저하게 우수한 효과를 가지고 있을 뿐만 아니라, 그동안 제기되어 오던, 화합물이 배양배지에서 세포내로 흡수되지 못하는 세포응집현상의 문제점을 해결하는 이질적 효과를 달성하여 의약 치료제로서 개발 가능성이 무한한 신규한 물질을 제작하는 것을 목적으로 하고 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 광역학치료법(Photodynamic therapy)에 사용되는 광민감성 물질로서, 하기 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 표시된 바와 같이 트리에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OH)기가 에스테르결합으로 연결된 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물 및 그 이성질체에 관한 것이다.
[화학식 1]
[화학식 2]
또한, 본 발명에 따른 포르피린 화합물의 농도를 0.4 ㎍/ml으로 하여 광역학치료(PDT) 처리를 하거나, 세포내의 흡수는 1시간, 빛의 조사강도는 1.2 J 또는 활성결과의 분석은 24시간으로 하여 처리한 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 표시되는 포르피린 화합물과 여기에 PDT처리를 거친 포르피린 화합물에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 종래의 광민감성 물질의 단점을 개선하여, 단일항 상태의 산소를 생성시키는 양자수율이 우수하고 물리적 안정성이 좋으며 세포독성이 우수한 효과를 가진 화합물을 만들어 내고자 연구노력한 결과, 트리에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OH)기가 에스테르결합으로 연결된 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물을 개발하였다. 또한, 상기 포르피린 화합물의 농도를 0.4 ㎍/ml으로 하여 광역학치료(PDT) 처리를 하거나, 세포내의 흡수는 1시간, 빛의 조사강도는 1.2 J 또는 활성결과의 분석은 24시간으로 처리하여 본 발명에 따른 포르피린 화합물을 제작하였고, 상기 포르피린 화합물을 사용하여 PDT 활성시험과 세포내로의 흡수성 테스트로 본 발명에 따른 효과를 분석함으로서, PDT 활성과 세포내로의 흡수성면에서 현저하게 우수한 효과를 가지고 있을 뿐만 아니라, 나아가 세포가 응집하는 문제점을 해결하여 의약 치료제로서 개발 가능성이 무한한 신규한 물질에 관한 것임을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 상기 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 표시되어 트리에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2OCH
2CH2OH)기가 에스테르결합으로 연결된 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물에 관한 것이다. 본 발명에 따라 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물은 먼저, 페오피틴(pheophytin)-a(화학식3)를 추출하고 상기 페오피틴-a로부터 페오포바이드(pheophorbide)-a-메틸에스테르(화학식4)를 합성한뒤, 상기 페오포바이드(pheophorbide)-a-메틸에스테르를 이용하여 합성되는 것이다.
이하에서는 본 발명을 실시예를 통하여 보다 자세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물 합성
본 발명에 따라 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물은 페오피틴(pheophytin)-a를 추출하는 단계와 페오포바이드(pheophorbide)-a-메틸에스테르를 제조하는 단계를 거치어서 합성된다.
(1) 페오피틴(pheophytin)-a를 추출하는 단계
본 발명에 따른 포르피린 화합물을 합성하기 위해서는 우선적으로 하기한 화학식3에 나타난 바와 같은 페오피틴-a가 필요하며, 페오피틴-a는 건조된 잠분 또는 녹조류로부터 유기용매(물, 클로로포름, 알코올, 아세톤)를 이용하여 추출하는 것이 바람직하다.
[화학식 3]
페오피틴-a는 상기한 화학식3에 나타난 바와 같이 포르피린기를 갖는 포르피린 유도체(derivative)의 일종으로, 16개의 탄소기가 일렬로 길게 연결된 것이 특징이다.
또한, 본 발명은 트리에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2OCH2
CH2OH)기가 에스테르결합으로 연결된 것을 특징으로 하는바, 상기 화학식3에 있어서, R4의 위치에 수소기가 결합된 페오피틴-a가 가장 바람직하지만, R4의 위치(포르피린환 넘버 10)에 히드록시기(OH)가 결합된 10-히드록시페오피틴-a를 이용하는 것도 바람직하다.
(2) 페오포바이드(pheophorbide)-a-메틸에스테르를 제조하는 단계
다음으로, 페오포바이드-a-메틸에스테르를 제조하기 위해서는 상기에서 추출한 페오피틴-a 또는 10-히드록시페오피틴-a를 관크로마토그래피 과정을 거치거나 얇은 막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography : TLC) 방법등으로 분리하였다. 그리고, 이들을 산 또는 염기의 존재하에서 실온 또는 환류의 조건에서 메탄올과 반응시킨 뒤에 하기한 화학식4에 나타난 바와 같은 페오포바이드-a-메틸에스테르 또는 10-히드록시페오포바이드-a-메틸에스테르를 제조하였다.
[화학식 4]
페오포바이드-a-메틸에스테르는 상기한 화학식4에 나타난 바와 같이 포르피린기를 갖는 포르피린 유도체(derivative)의 일종으로, 페오피틴-a에 있었던 16개의 탄소기가 절단된 것이 특징이다.
또한, 본 발명은 트리에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2OCH2
CH2OH)기가 에스테르결합으로 연결된 것을 특징으로 하는바, 상기 화학식4에 있어서, R4의 위치에 수소기가 결합된 페오포바이드-a-메틸에스테르가 가장 바람직하지만, R4의 위치(포르피린환 넘버 10)에 히드록시기(OH)가 결합된 10-히드록시페오포바이드-a-메틸에스테르를 이용하는 것도 바람직하다.
(3) 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물 합성
본 발명에 따라 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물은 상기에서 제조된 페오포바이드-a-메틸에스테르 또는 10-히드록시페오포바이드-a-메틸에스테르를 이용하여 제작하였다.
먼저, 반응용기에 페오포바이드-a-메틸에스테르 또는 10-히드록시페오포바이드-a-메틸에스테르를 100mg 넣고, 여기에 피리딘 16mg과 톨루엔 15mL를 넣었다. 또한, 트리에틸렌글리콜 0.033mL를 넣고 질소기류하에서 빛이 차단된 상태에서 반응시켜 16시간 동안 가열하였다. 이어서, 메틸렌클로라이드로 추출하고 용매를 제거한 후, 남은 물질을 관크로마토그래피로 분리하여, 본 발명에 따라 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물 73mg을 얻었다. 이후에 본 발명은 화학식1과 화학식2를 적절한 비율로 혼합하여 포르피린 혼합물을 제작할 수 있고, 바람직하게는 화학식1과 화학식2의 비율을 9:1로 하는 것이 가장 바람직하다.
[화학식 1]
[화학식 2]
본 발명은 이상에서 나타난 바와 같이, 트리에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH
2OCH2CH2OH)기가 에스테르결합으로 연결된 것으로, 종래의 광민감성 물질의 단점을 개선하여, 단일항 상태의 산소를 생성시키는 양자수율이 우수하고 물리적 안정성이 좋으며 세포독성이 우수한 효과를 가진 화합물로서 우리가 원하고 목적하는 물질인 것이다.
여기서, 본 발명에 따라 우리가 원하는 목적물의 구조식이 상기한 화학식1과 동일한 구조를 갖는지 여부를 확인하기 위하여 분광학적인 방법으로 핵자기공명(Nuclear Magnetic Resonance:NMR) 또는 질량분석기를 이용하여 확인하는 절차를 거치었고, 그 결과는 아래와 같다.
상기한 결과에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 우리가 원하는 목적물의 구조식은 상기한 화학식1과 동일한 구조를 갖고 있음을 확인하였다.
실시예 2
본 실시예2에서는 상기 실시예1에서 제작되어 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물과 종래기술로 널리 알려진 에틸렌글리콜(CH2CH2OH)기 또는 디에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2OH)기가 에스테르결합으로 연결된 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물의 효과를 비교하여서, 본 발명이 선행발명과는 전혀 다르고 선행발명에 본 발명이 구체적으로 기재되어 있지 아니하며 본 발명에 따른 화합물의 성질이 예측할 수 없는 특유의 것이거나 또는 그 성질의 정도가 현저히 우수한 것임을 실험을 통하여 증명하였다. 실험은 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 본원발명과 종래기술로서 디에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2
OH)기가 에스테르결합으로 연결된 포르피린 화합물을 대상으로 하여 광역학치료(PDT) 활성과 세포내로의 흡수성 실험을 수행하였다.
(1) 광역학치료(PDT)에 의한 활성 비교
먼저, 본원발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어진 포르피린 화합물 및 선행발명을 HL-60 세포주에 각각 0.3 ㎍ 및 3 ㎍ 씩 투여한 후, 빛을 조사하였을 경우와 조사하지 않았을 경우의 PDT 활성을 570 ㎚의 흡광도에서 살펴보았다.
그 결과, 빛을 조사하지 않았을 경우에는 세포독성이 나타나지 아니하였으나, 빛을 조사하였을 경우 선행발명의 포르피린 유도체에서는 0.61의 열악한 PDT 활성을 나타내었으나(도 11), 본원발명의 포르피린 유도체는 0.3 ㎍의 적은 양의 투여만으로도 0.125의 현저하게 우수한 PDT 활성을 나타냄을 확인하였다(도 12).
(2) 세포에 대한 흡수성 정도
HL-60 세포주에 각각 10 ㎍/㎖의 본원발명의 포르피린 유도체 및 선행발명의 포르피린 유도체 1 ㎖를 가한후, 회전 드럼에서 30분 내지 210분 동안 배양하였다. 배양물을 0 °C, 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 침전시켰다. 침전된 세포펠렛을 냉각 생리 식염수로 세척한 다음, 재차 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 상기 수득된 침전물에 DMF(Dimethyl formamide)를 가한 후, 생성 혼합물을 실온에서 진탕한 후 4°C에서 원심분리하여 침전시켰다. 300 ㎕의 상층액 세포 추출액에 200 ㎕의 증류수 및 500 ㎕의 1N 염산을 가하여 최종부피가 1 ㎖가 되도록 하였다. 이후, 본원발명의 포르피린 유도체 및 선행발명의 포르피린 유도체를 각각 570 ㎚의 흡광도에서 측정하여 세포에 흡수된 포르피린 유도체의 양을 측정하였다.
그 결과, 본원발명의 포르피린 유도체를 투여한 군에서는 배양시간이 길어질수록 세포내 흡수량이 증가됨을 확인할 수 있었다. 그러나, 선행발명의 포르피린 유도체를 투여한 군에서는 세포내 흡수량에 있어 유의성 있는 증가를 보이지 않았다(도 13). 이는 선행발명의 포르피린 유도체의 배양배지에서 포르피린 유도체가 세포내로 흡수되지 못하고 세포응집 현상이 발생하기 때문이다. 참고로 도면 13에서 DH-I-180-3은 본원발명을 나타내고 DH-I-171-1은 선행발명을 나타낸다.
이와 같이, 본 발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 유도체는 디에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2OH)기가 에스테르결합으로 연결된 포르피린 화합물에 비하여 광역학치료(PDT) 활성과 세포내로의 흡수성이 현저하게 우수한 효과를 보이고 있으며, 화합물이 배양배지에서 세포내로 흡수되지 못하는 세포응집현상의 문제점을 해결하는 이질적 효과를 달성하였다.
더불어, 상기 테스트는 선행발명으로 디에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2
OH)기가 에스테르결합으로 연결된 포르피린 화합물을 대상으로 하였지만, 에틸렌글리콜이 두개 결합된 디에틸렌글리콜에 비하여 에틸렌글리콜이 세개 결합된 트리에틸렌글리콜이 현저하게 효과를 보이고 있는바, 본 발명에 따라 트리에틸렌글리콜이 결합된 것은 단 하나의 에틸렌글리콜이 결합된 것에 비하여 훨씬 현저하게 우수한 광역학치료(PDT) 활성과 세포내로의 흡수성을 갖게된다는 것은 이 기술분야에서 보통의 지식을 가진 당업자에게는 자명하게 생각해 낼 수 있는 사실이다. 그렇다고 에틸렌글리콜을 4개 이상 가지는 포르피린 화합물이 더욱 우수한 효과를 가지는 것은 아니다. 에틸렌글리콜을 4개 이상 가지는 포르피린 화합물은 물에 쉽게 용해되어버리는 치명적인 단점을 가지고 있어서 광역학치료법(Photodynamic therapy)에 사용되는 광민감성 물질로는 적합하지 않다는 것을 알아냈다. 이와 같이 본 발명자들은 에틸렌글리콜의 갯수를 달리하여 포르피린 화합물을 제작함에 있어서 에틸렌글리콜의 갯수가 3개인 트리에틸렌글리콜을 에스테르결합으로 연결시키는 것이 그보다 적거나 또는 많게 에킬렌글리콜을 연결시키는 경우에 비하여 현저하게 우수한 효과를 가지고 있다는 것을 오랜 실험과 연구를 통하여 비로소 알게 되었다.
화학발명에 있어서, 동일한 물질이라도 여기에 결합되는 작용기 하나 또는 변형되는 유도체 하나가 상이하거나 고분자 화합물에서 반복되는 단위구성요소의 갯수에 따라서 그 효과는 전혀 예측할 수 없는 현저한 효과를 가질 수 있다는 것은 당해 기술분야의 당업자에게는 명백한 사실이다.
본 발명에 따라 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어진 포르피린 화합물은 에틸렌글리콜기가 세개가 에스테르결합으로 연결된 것으로서, 이보다 상위개념(저급알킬)으로 널리 알려진 공지기술 또는 수소(H), 에틸렌글리콜(COOCH2CH2OH)이 하나 연결되어 있는것과 아세테이트(COOCH3) 및 이와 유사한 물질(COOCH2CH2OCOCH3)을 포함하여 알려진 공지기술에는 본 발명에 따른 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물의 구조가 구체적으로 개시되어 있지 아니한바 본 발명은 선택발명으로서 진보성이 인정되는 신규한 발명이다. 본 발명은 종래의 공지기술의 단점이었던 세포가 응집하는 문제점을 해결하여 의약 치료제로서 개발 가능성이 무한한 신규한 물질에 관한 효과를 보이는 것과 같이 이는 종래의 공지기술과는 다른 특유의 것이고, 이와 더불어서 광역학치료(PDT) 활성과 세포내로의 흡수성은 종래기술에 비하여 그 효과가 현저하게 우수하기 때문에 선택발명으로서의 요건을 모두 갖춘 발명에 해당한다.
실시예 3
본 실시예3에서는 상기 실시예1에서 제작되어 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물에 대해서 광역학치료(PDT), 세포내의 흡수, 빛의 조사 또는 활성결과 분석등의 처리과정을 거치었고, 이를 통해 본 발명의 우수한 효과를 확인하였다.
(1) 자외선(UV) 스펙트럼
도1은 본 발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물에 대한 자외선 스펙트럼을 나타내고 있다. 도1에 나타난 바와 같이 640~700 ㎚에서 피크파장을 나타내므로, 본 발명은 암세포에 대해서 현저한 선택적 친화성이 존재하는 것을 알 수 있다.
(2) 단일항 산소 측정
본 발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물에 대해서 단일항 산소 측정을 하였다. 실험조건은, 에어포화상태(99.999% 고순도 공기 사용)에서 용매는 톨루엔(머크사, HPLC grade)으로 하였으며, 용액 중의 산소농도 2.1 ×10-³M, 온도는 21℃였다. 단일항 산소 인광 측정결과(λexcitation = 508nm)를 도2에 나타냈고, 이로부터 계산한 양자수율은 0.60(5%)로서, 단일항 상태의 산소를 생성시키는 양자수율이 우수하고 물리적 안정성이 양호함을 확인하였다. 참고로 도면 13에서 DH-I-180-3은 본원발명을 나타내고 DH-I-171-1은 선행발명을 나타낸다.
(3) 세포 독성 비교 측정
본 발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물과 종래기술로서 포토프린을 대조군으로 하여 단일항 산소 측정을 비교실험으로 하였다. 여기서 포토프린은 헤마토포르피린(HpD)이 에스테르 결합으로 연결된 올리고머로 이루어진 혼합물이다.
먼저, 유방암 세포(EMT6)를 배양하여(배양배지 ; DMEM + 10% FBS + 100U pencillium + 100 ㎍ streptomycin) 실험에 사용하였다. 세포를 상기 배지에서 배양하고, 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EthyleneDiamine Tetraacetic Acid:EDTA)을 처리하여 세포를 수거한 후 트립판 블루를 이용해 세포를 계수하였다. 그리고, 2 ×105 cells/ml 농도의 세포를 35 mm 배양접시에 3 ml첨가하여 24시간 동안 5% CO₂배양기에서 배양함으로서 모든 세포가 배양접시에 단층이 되게 하였다. 디메틸포름알데히드(N,N-DiMethylFormamide:이하 'DMF'라 함)에 용해한 본 발명을 여러 농도로 희석하여 35 mm 배양접시에 첨가하였다. 이 때, DMF에 의한 효과를 배제하기 위하여 사용한 DMF의 농도는 0.5%를 넘지 않았다. 그 후, 화학식1에 따른 포르피린 화합물을 세포에 첨가하고 1시간 후, 할로겐 램프를 이용하여 1.2 J의 농도로 빛을 조사하였다. 빛을 조사한 다음, 배양접시를 배양기로 옮겨 배양하였다. PDT에 의한 세포독성은 24시간 후에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석법을 이용하여 분석하였고, 세포의 형태는 광학현미경을 통해 관찰하였다.
도3에는 마우스 유래 유방암 세포(EMT6)에 대한 세포 독성을 MTT 분석법으로 측정한 결과를 나타내었다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군(control), 빛만 조사할 때(light), 용매만 처리했을 경우(DMF), 빛이 없을 때(Ps(2) only), 그리고 본 발명인 화학식1과 화학식2의 혼합물에 따른 포르피린 화합물의 농도를 다양화하여 측정한 결과, 빛과 용매 및 광민감성 물질만 처리했을 경우에는 전혀 세포독성을 보이지 않은 반면, 본 발명의 함량이 0.2 ㎍ 일 때 현저한 세포독성이 나타나고, 0.4 ㎍에서 LD100 이 나타나 최적효능농도가 0.4 ㎍임을 확인할 수 있었다. 참고로 도면 3에서 DH-I-180-3은 본원발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어진 포르피린 화합물을 나타낸다.
(4) 세포 사멸 기전 비교 측정
본 발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물과 종래기술로서 포토프린을 대조군으로 하여 세포 사멸 기전을 비교실험으로 하였다. 여기서 포토프린은 헤마토포르피린(HpD)이 에스테르 결합으로 연결된 올리고머로 이루어진 혼합물이다.
도4에는 세포 사멸의 기전을 연구하기 위하여 아넥신 브이피아이(Annexin V/PI) 염색을 실시한 결과가 나타나 있으며, 도면에 나타난 바와 같이 대조군에서는 90%이상이 생존해 있는 반면, PDT 처리군(0.4 ㎍/1hr)에서는 50~60% 이상 세포가 고사(cell apoptosis)됨으로서 유방암 세포(EMT6)가 사멸되고 있음을 확인할 수 있다.
(5) 포르피린 화합물의 농도에 따른 세포내 축적량 측정
도5는 화학식1과 화학식2의 혼합물에 따른 포르피린 화합물의 농도를 달리했을 때, 세포내에 얼마나 많이 축적(uptake)되는 가를 측정한 도표로서, 본 발명에 따른 포르피린 화합물의 세포내 농도를 형광활성세포분리(Fluorescence-activated cell sorting:FACs)분석을 통하여 살펴본 결과, 다분히 농도 의존성이 강하며, 세포독성과 비교하여 보았을 때 상관관계가 있으며, 최소한 208.92 평균형광강도(MFI), 즉, 본 발명의 광민감성 물질 본 발명의 농도가 0.4 ㎍은 되어야만 세포독성이 강하게 나타남을 알 수 있다. 참고로 도면 3에서 DH-I-180-3은 본원발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어진 포르피린 화합물을 나타낸다.
(6) 포르피린 화합물의 배양시간에 따른 세포내 축적량 측정
도6은 화학식1과 화학식2의 혼합물에 따른 포르피린 화합물의 시간에 따른 세포축적율을 나타낸 도표로서, 세포에 광민감성 물질을 첨가하고 시간에 따라 형광활성세포분리(Fluorescence-activated cell sorting:FACs)분석을 통하여 살펴본 결과, 시간에 의존적임을 알 수 있고, 세포독성과 비교하여 살펴볼 때, 최소한 평균형광강도(MFI)가 208.92, 즉, 시간이 최소 60분은 되어야만 세포독성이 강하게 나타나는 것을 알 수 있다. 참고로 도면 3에서 DH-I-180-3은 본원발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어진 포르피린 화합물을 나타낸다.
(7) 포르피린 화합물에 대한 빛의 조사시기에 따른 세포내 축적량 측정
도7은 빛의 조사세기에 따른 세포독성을 시험한 도표로서, 조사하는 빛의 세기가 1.2 J일 때 가장 효과가 우수하고, 그 이상이 되어도 더 이상의 효과는 없는 것을 확인할 수 있다. 참고로 도면 3에서 DH-I-180-3은 본원발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어진 포르피린 화합물을 나타낸다.
(8) 광역학 치료처리후 미토콘드리아막 포텐셜(MMP) 측정
도8은 유방암 세포(EMT6)내의 미토콘드리아막 포텐셜(MMP)을 측정한 그림으로서, PDT 처리 후 세포의 MMP를 측정하기 위하여 JC-1 dye로 염색하여 FACs 분석을 수행한 결과, PDT에 의해 MMP가 강하게 소실되는 것을 볼 수 있고, 이러한 결과는 형광현미경에 의한 관찰과 일치하였다.
(9) 종양의 크기 측정 비교
본 발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물과 종래기술로서 포토프린을 대조군으로 하여 세포 사멸 기전을 비교실험으로 하였다. 여기서 포토프린은 헤마토포르피린(HpD)이 에스테르 결합으로 연결된 올리고머로 이루어진 혼합물이다.
우선, 유방암 세포(EMT6 ; 1 ×106 cells/마우스)를 BALB/c 마우스(군 당 12마리)에 이식하고, 7~10일 후 1% Tween80으로 희석한 본 발명(각 마우스 당 0.4, 0.8 mg/kg)과 주사용 증류수로 희석한 포토프린(각 마우스 당 2 mg/kg)을 정맥 주사하였다. 주사 3시간 후 마우스를 마취시켜 할로겐 램프를 이용하여 1.2 J로 조사하고 2~3일 간격으로 캘리퍼를 이용하여 종양의 크기를 측정함은 물론, 동시에 그에 따른 마우스의 생존율을 측정하였다.
그 결과, 도9는 본 발명에 따라 처리된 유방암 세포(EMT6)에 의해 종양이 유발된 BALB/c 마우스의 종양 억제를 나타낸 도표로서, 본 발명의 광민감성 물질로 처리한 군은 대조군 및 포토프린 처리군과 비교하여 처리 후 시간이 경과함에따라 유방암 세포(EMT6)의 종양성장율이 현저히 줄어 들었다. 참고로 도면 3에서 DH-I-180-3은 본원발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어진 포르피린 화합물을 나타낸다.
(10) 종양의 크기에 따른 마우스의 생존율 측정 비교
도10은 도9의 결과에 의해서 도출된 마우스의 생존곡선으로, PDT로 인해 생존율이 대조군에 비해서 연장된 결과를 나타낸 것이다. 참고로 도면 3에서 DH-I-180-3은 본원발명에 따라 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어진 포르피린 화합물을 나타낸다.
위와 같은 각 시험결과를 토대로, 본 발명에 따라 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물의 처리조건은, 포르피린 화합물의 농도를 0.4 ㎍/ml으로 하여 광역학치료(PDT) 처리를 하거나, 세포내의 흡수는 1시간, 빛의 조사강도는 1.2 J 또는 활성결과의 분석은 24시간으로 하는 것이 가장 바람직하다.
이에 반해, 대조군으로 사용한 포토프린은 사용된 농도가 50~100 ㎍/ml 이고, 24시간이 지나도 세포내 흡수는 효과적이지 못하고, 빛의 조사강도도 본 발명에 따른 화합물에 비하여 10~100배 이상이어야 함을 알 수 있다. 즉, 본 발명은 종래 기술에 비하여 세포독성효과가 우수하여 광역학치료법에 유용하게 사용할 수 있는 물질임을 확인하였다. 따라서 본 발명은 상기 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 이루어진 포르피린 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하여 광역학적으로 고형암을 치료하기 위한 치료제를 제공할 수 있는 특징을 가지고 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물의 포르피린 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 따르면, 기존의 광민감성 물질의 단점을 개선한 것으로, 단일항 상태의 산소를 생성시키는 양자수율이 우수하고 물리적 안정성이 좋으며, 기존의 포토프린보다 세포독성효과가 우수하여 관련 분야에의 이용 및 응용이 가능하다 하겠다.
또한, 본 발명은 종래의 공지기술에 비하여 광역학치료(PDT) 활성과 세포내로의 흡수성이 현저하게 우수한 효과를 보이고 있으며, 화합물이 배양배지에서 세포내로 흡수되지 못하는 세포응집현상의 문제점을 해결하는 이질적 효과를 달성하였다.
따라서, 이와 같은 효과를 가진 포르피린 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은 이것을 유효성분으로 포함하여 광역학적으로 고형암을 치료하기 위한 치료제를 제공할 수 있는 것이다.
도1은 본 발명에 따른 화학식1과 화학식2의 혼합물의 포르피린 화합물에 대한 자외선(UV) 스펙트럼을 나타낸다.
도2는 본 발명에 따른 화학식1과 화학식2의 혼합물의 포르피린 화합물에 대한 단일항 산소 인광 측정 그래프를 나타낸다.
도3은 본 발명에 따른 화학식1과 화학식2의 혼합물의 포르피린 화합물에 대하여 마우스 유래 유방암 세포(EMT6)에 대한 세포 독성을 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석법으로 측정한 그래프를 나타낸다.
도4는 본 발명에 따른 화학식1과 화학식2의 혼합물의 포르피린 화합물에 대한 세포 사멸의 기전을 연구하기 위하여 아넥신 브이피아이(Annexin V/PI) 염색을 실시한 결과 그래프이다.
도5는 본 발명에 따른 화학식1과 화학식2의 혼합물의 포르피린 화합물에 대하여 배양농도를 달리하여 세포독성을 측정한 그래프이다.
도6은 본 발명에 따른 화학식1과 화학식2의 혼합물의 포르피린 화합물에 대하여 배양시간을 달리하여 세포독성을 측정한 그래프이다.
도7은 본 발명에 따른 화학식1과 화학식2의 혼합물의 포르피린 화합물에 대하여 빛의 조사세기를 달리하여 세포독성을 시험한 그래프이다.
도8은 본 발명에 따른 화학식1과 화학식2의 혼합물의 포르피린 화합물에 대하여 유방암 세포(EMT6)내의 미토콘드리아막 포텐셜(MMP)을 측정한 그래프이다.
도9는 본 발명에 따른 화학식1과 화학식2의 혼합물의 포르피린 화합물에 대하여 유방암 세포(EMT6)로 유발된 마우스 종양의 크기를 측정한 그래프이다.
도10은 본 발명에 따른 화학식1과 화학식2의 혼합물의 포르피린 화합물에 대하여 유방암 세포(EMT6)로 유발된 마우스 종양 크기에 따라 마우스의 생존율을 측정한 그래프이다.
Claims (3)
- 광역학치료법(Photodynamic therapy)에 사용되는 광민감성 물질로서, 하기 화학식1 또는 그 이성질체인 화학식2 또는 화학식1과 화학식2의 혼합물로 표시되어 트리에틸렌글리콜(CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OH)기가 에스테르결합으로 연결된 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물 및 그 이성질체.[화학식 1][화학식 2]
- 제1항의 포르피린 화합물의 농도를 0.4 ㎍/ml으로 하여 광역학치료(PDT) 처리를 하거나, 세포내의 흡수는 1시간, 빛의 조사강도는 1.2 J 또는 활성결과의 분석은 24시간으로 하여 처리한 것을 특징으로 하는 포르피린 화합물.
- 제1항 내지 제2항에 따른 포르피린 화합물에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료하기 위한 치료제.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101493889B1 (ko) * | 2013-02-27 | 2015-03-09 | 건국대학교 산학협력단 | 광역학 진단 또는 치료용 광감작제 및 그 제조방법 |
-
2004
- 2004-08-19 KR KR1020040065586A patent/KR20050027197A/ko not_active Ceased
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|---|---|---|---|---|
| KR101493889B1 (ko) * | 2013-02-27 | 2015-03-09 | 건국대학교 산학협력단 | 광역학 진단 또는 치료용 광감작제 및 그 제조방법 |
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