DE69723298T2

DE69723298T2 - Iminochlorinasparaginsaeure-derivate

Info

Publication number: DE69723298T2
Application number: DE69723298T
Authority: DE
Inventors: Muneo Fujimi-shi HIKIDA; Masahiko Asaka-shi MORI; Isao Sakata; Susumu Nakajima; Hiroyuki Asakuchi-gun TAKATA
Original assignee: Photochemical Co Ltd; Wyeth Lederle Japan Ltd
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK; Pfizer Japan Inc
Priority date: 1996-10-01
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2017-10-01
Also published as: DK0945454T3; AU713059B2; KR100463478B1; DE69723298D1; JP3613599B2; WO1998014453A1; EP0945454A4; EP0945454B1; ES2202640T3; ATE244244T1; CA2268968A1; EP0945454A1; US6063777A; CA2268968C; PT945454E; AU4322997A; KR20000048843A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Iminochlorin-Asparaginsäurederivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Photosensibilisierungsmittel, umfassend das Iminochlorin-Asparaginsäurederivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, das für die Diagnose oder Behandlung von Menschen oder Tieren geeignet ist.
STAND DER TECHNIK
Als neues Verfahren zur Behandlung von Krebs ist die photophysikochemische Diagnose und Therapie (PDT: Photodynamische Therapie) eingesetzt worden. Es handelt sich um ein Verfahren, bei dem ein bestimmter Typ eines Porphyrinderivats einer Person, beispielsweise durch intravenöse Injektion, verabreicht wird um das Porphyrinderivat in den von Krebs befallenen Zielgeweben in der Person zurückzubehalten, gefolgt von einer Laserbestrahlung um eine selektive Zerstörung des Krebs-artigen Gewebes zu bewirken. Diese Therapie nutzt die zwei Eigenschaften eines Porphyrinderivats, nämlich die Selektivität für von Krebs befallene Gewebe und Photoempfindlichkeit, aus.
Das einzige Porphyrinderivat, das derzeit bei der PDT-Therapie verwendet wird, ist Porphymer-Natrium. Porphymer-Natrium ist ein Gemisch von Produkten, das dadurch hergestellt werden kann, dass Hämatoporphyrin mit Schwefelsäure in Essigsäure behandelt wird und dann mit 0,1 N Natriumhydroxidlösung hydrolysiert wird. Es handelt sich um ein 2- bis 6-Polymeres, umfassend einen Ether und/oder Ester eines Hämatoporphyrinderivats.
Es ist aber bekannt, dass Porphymer-Natrium als unerwünschte Nebenwirkung eine temporäre Lichtempfindlichkeit bewirkt, wenn es dem Menschen verabreicht wird. Weiterhin ist die selektive Verteilung in den von Krebs befallenen Geweben für die praktische Verwendung nicht ausreichend, so dass sich das Problem einer Akkumulierung in normalen Geweben stellt.
Unter diesen Umständen ist es erforderlich, dass ein mit Porphymer-Natrium behandelter Patient über einen langen Zeitraum im Dunkeln bleiben muss, bis das Mittel vollständig aus dem Körper ausgeschieden ist, so dass die normalen Zellen durch die photosensibilisierende Wirkung des in normalen Geweben angesammelten Porphymer-Natriums nicht geschädigt werden. Da jedoch das Porphymer-Natrium eine niedrige Ausscheidungsrate aus normalen Geweben zeigt, bewirkt es manchmal eine Photosensibilität über einen Zeitraum von mehr als sechs Wochen.
Hinzu kommt noch, dass eine PDT-Therapie, bei der Porphymer-Natrium verwendet wird, ein Problem hinsichtlich der Durchlässigkeit der Gewebe für das vom Laser abgestrahlten Licht hat. Porphymer-Natrium hat ein längstes Wellenlängenabsorptionsende bei 630 nm, und der molare Absorptionskoeffizient ist so klein wie 3.000. Da in einem lebenden Körper viele Komponenten vorhanden sind, die die Durchlässigkeit von Licht verhindern, wie Oxyhämoglobin und Wasser, zeigt Licht mit einer Wellenlänge von 630 nm eine schlechte Durchgängigkeit durch die Gewebe, und es kann daher tiefe Stellen nicht in genügender Weise erreichen. Daher ist eine PDT-Therapie unter Verwendung von Porphymer-Natrium nur für Krebsarten indiziert, die sich in Oberflächenschichten mit einer Tiefe von 5 bis 10 mm entwickeln. Die Wellenlänge, die durch die Lichtabsorption durch die Komponenten in einem lebenden Körper am geringsten beeinträchtigt wird, liegt im Bereich von 650 bis 750 nm, so dass Photosensibilisierungsmittel für die PDT-Therapie mit dem längsten Wellenlängenabsorptionsende innerhalb eines solchen Bereichs am meisten gewünscht werden.
Lasergeräte selbst haben gleichfalls Probleme. So haben z.B. Farbstofflaser, die zur Zeit am meisten verwendet werden, eine schlechte Stabilität der Eigenschaften, so dass sie bei der praktischen Verwendung nur mit Schwierigkeiten gehandhabt werden können. Andererseits ermöglichen es Titan-Saphir-Laser, die Durchführung die PDT-Therapie in erheblicher Weise zu erleichtern. Dieser Typ von Laser ist aber hinsichtlich der erregbaren Wellenlängen, die nicht weniger als 670 nm und nicht mehr als 600 nm sind, Einschränkungen unterworfen, und sie sind daher für Porphymer-Natrium mit einer Absorptionswellenlänge von nahe bei 630 nm nicht anwendbar.
In neuerer Zeit sind Halbleiterlaser (670 nm), die auf Verbindungen mit einer Absorption in der Nähe von 670 nm anwendbar sind, entwickelt worden. Erst kürzlich wurde ein OPO-YAG-Laser entwickelt, der es ermöglicht, fast alle Wellenlängen abzudecken.
Wie vorstehend zum Ausdruck gebracht wurde, haben die derzeit für die PDT-Therapie verwendeten Photosensibilisierungsmittel verschiedene Mängel, und es wird daher die Entwicklung von neuen Mitteln ohne derartige Mängel stark angestrebt. In einem Versuch, diese Probleme zu überwinden, ist schon ein Mittel, das eine einzige Verbindung ist und eine Absorption in einem längeren Wellenlängenbereich (650-800 nm) zeigt, als Mittel der zweiten Generation für die PDT-Therapie vorgeschlagen worden.
Beispiele für solche Mittel der zweiten Generation sind Aminolävulinsäure (ALA), die ein Protoporphyrin-Vorläufer ist; Aspartylchlorin e6 (Np e6), das ein Chlorinderivat ist; ein Benzoporphyrinderivat (BPD) und Methatetrahydroxyphenylchlorin (m-THPC). Bei beiden Stoffen handelt es sich um neue Typen von Chlorinderivaten, erhalten durch eine Strukturumwandlung von von Hämoglobin abgeleiteten Porphyrinen.
Weiterhin haben die benannten Erfinder schon Chlorinderivate und Analoge davon, z.B. ein Hydroxyiminochlonyl-Asparaginsäurederivat (NOH-P-Asp) (JP-OS-EN Nrn. 5-97857 und 9-124652), vorgeschlagen worden und bestätigt, dass diese Verbindungen als Photosensibilisierungsmittel für PDT geeignet sind.
Trotzdem wird immer noch die Entwicklung von Photosensibilisierungsmittel für PDT mit höherer Sicherheit und besserer therapeutischer Wirksamkeit angestrebt.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein für die PDT-Therapie geeignetes Photosensibilisierungsmittel bereitzustellen, in dem ein Porphyrinderivat aufgefunden wird, das eine einzige Komponente ist, das stabil ist, das aus normalen Geweben eine höhere Ausscheidungsgeschwindigkeit hat und das daher eine verringerte Phototoxizität hat, während es eine gute Akkumulierbarkeit in Krebs-Geweben beibehält. Weiterhin soll erfindungsgemäß die Verwendung eines Titan-Saphir-Lasers (Wellenlänge von nicht weniger als 670 nm und nicht mehr als 600 nm) und eines Halbleiterlasers (Wellenlänge 670 nm) gestattet werden.
Die benannten Erfinder haben zuvor schon offenbart, dass, wenn eine Hydroxyiminogruppe und ein Rest der Asparaginsäure an die Seitenketten eines Chlorins gebunden sind, das eines der Porphyrinderivate ist, welches als Derivate aus von Hämoglobin abgeleiteten Protoporphyrindimethylester synthetisiert worden ist, ein Gemisch von zwei Typen von Positionsisomeren der folgenden Formeln (I) und (II) erhalten wurde (JP-PS Nr. 5-97857):
worin Asp den Rest von Asparaginsäure darstellt.
Die benannten Erfinder haben diese zwei Typen von Positionsisomeren voneinander durch Chromatographie oder Umkristallisation getrennt, und sie haben als Ergebnis gefunden, dass die Verbindung der Formel (I) mit einer Iminogruppe an Ring A davon eine erheblich höhere Akkumulierbarkeit in Krebs-Geweben im Vergleich zu der Verbindung der Formel (II), die eine Iminogruppe an Ring B davon hat, besitzt. Weiterhin wurde auch gefunden, dass die Verbindung der Formel (I) auch einen starken Zellzerstörungseffekt, induziert durch eine Photosensibilisierungsreaktion, und rasche Ausscheidungseigenschaften aus normalen Geweben sowie ein längstes Wellenlängenabsorptionsende bei 670 nm oder mehr hat.
Bei Untersuchung der Verbindung (I) durch den Albumin-Test [dabei handelt es sich um eine zweckmäßige Testmethode für die Bestimmung der Affinität gegenüber Krebs-Geweben, bei dem ein Chlorinderivat auf die Veränderung des Ultraviolett(UV)-Absorptionsspek-trums in eine Mischform mit Albumin untersucht wird und bei dem einer der benannten Erfinder eine bestimmte Regel gefunden hat], und durch den Dancyl-Methionin-Test [dabei handelt es sich um eine zweckmäßige Testmethode zur Bestimmung der Stärke der Photoreaktivität durch Dünnschichtchromatographie (TLC) oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)] (siehe JP-OS Nr. 5-97857) wurde bestätigt, dass die Verbindung der Formel (I) eine ausgezeichnete Übertragbarkeit in Krebs-Gewebe und eine starke Photoempfindlichkeit hat.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf der Basis der obigen Auffindungen vervollständigt worden. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Iminochlorin-Asparaginsäurederivat der folgenden Formel I
worin Asp für den Rest der Asparaginsäure steht, sowie ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Gemäß einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird ein Photosensibilisierungsmittel für die Diagnose oder Behandlung bereitgestellt, das das Iminochlorin-Asparaginsäurederivat der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon enthält.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Photosensibilisierungsmittel, enthaltend das Iminochlorin-Asparaginsäurederivat der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, zur Verwendung für die Diagnose oder Behandlung von Krebserkrankungen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Photosensibilisierungsmittel, enthaltend das Iminochlorin-Asparaginsäurederivat der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, zur Verwendung bei der Diagnose oder Behandlung einer Revaskularisierung in der Augenheilkunde.
Diese Photosensibilisierungsmittel sollen für die Diagnose oder Behandlung des Menschen oder von Tieren eingesetzt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum des Natriumsalzes des Iminochlorin-Asparaginsäurederivats der Formel (I) (NOH-P-Asp).
BESTE ART UND WEISE DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Das Iminochlorin-Asparaginsäurederivat, das durch die Formel (I) angegeben wird gemäß der vorliegenden Erfindung, kann durch das untenstehend beschriebene Verfahren hergestellt werden.
Das heißt, die Verbindung kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das folgendes umfasst: Eine Stufe (a), bei der ein Protoporphyrindimethylester in ein Chlorinderivat umgewandelt wird, das darin eine Aldehydgruppe hat; eine Stufe (b), bei der die Aldehydgruppe des so erhaltenen Chlorinderivats an ein Hydruoxylamin gebunden wird; und eine Stufe (c), bei der die so erhaltene Verbindung weiterhin an Asparaginsäure auf dem Wege über eine Amidbindung gebunden wird. Es ist nicht wichtig, die Reaktionen nacheinander in der Reihenfolge von (a), (b) und (c) durchzuführen. Die Reihenfolge kann auch variiert werden, wie beispielsweise in der Reihenfolge von (a), (c) und (b).
Die oben angegebene Stufe (a) liefert ein Gemisch von zwei Typen von Positionsisomeren, d.h. eins, das eine Aldehydgruppe an Ring A hat, und ein anderes, bei dem sich die Aldehydgruppe an Ring B befindet. Durch Isolierung und Reinigung dieser Isomere wird das angestrebte Chlorinderivat mit einer Aldehydgruppe an Ring A erhalten. Dann kann durch Durchführung der Stufe (b) und der Stufe (c) das Iminochlorin-Asparaginsäurederivat der Formel (I) gemäß der vorliegenden Erfindung als einzige Verbindung erhalten werden. Alternativ kann die Isolierung und Reinigung des Gemisches der zwei Typen von Positionsisomeren, erhalten in Stufe (a), nach der Stufe (b) oder nach der Stufe (c) durchgeführt werden um die Verbindung der Formel (I) als einzige Verbindung zu erhalten.
Nachstehend werden die einzelnen Stufen genauer wie folgt erläutert.
Die Stufe (a) zur Umwandlung der Ausgangsverbindung in das Chlorinderivat kann nach einer der herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise nach dem Verfahren, beschrieben in J. E. Falk: "Porphyurins and Metalloporphyrins", veröffentlicht von Elsevier im Jahre 1975; D. Dolphin: "The Porphyrins", veröffentlicht von der Academic Press im Jahre 1978, und so weiter.
Das heißt, in Stufe (a) wird ein Protoporphyrindimethylester (nachstehend als "PP-Me" abgekürzt) als Ausgangsverbindung einer photochemischen Reaktionsbehandlung unterworfen um den 2-Formylethyliden-1-hydroxy-4-vinyl-Deuteroporphyrindimethylester (nachstehend als "P-Me (I)" bezeichnet). der der Vorläufer der Verbindung der Formel (I) gemäß der vorliegenden Erfindung ist, und den 4-Formuylethyliden-3-hydroxy-2-vinyl-Deuteroporphyrindimethylester (nachstehend als "P-Me (II)" bezeichnet), der ein Positionsisomeres von P-Me (I) ist, in Form eines Gemisches zu erhalten. Aus dem so erhaltenen Gemisch werden P-Me (I) und P-Me (II) durch Silicagelsäulenchromatographie oder Umkristallisation unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels jeweils isoliert.
Die Struktur des auf die obige Weise erhaltenen P-Me (I) kann auf der Grundlage der Ergebnisse des NOE-Tests wie folgt festgelegt werden.

(1) Bei der Bestrahlung von Wasserstoff in 9α-Position (δ 9,79) wurde in dem resultierenden Spektrum NOE bei Wasserstoff in 7-Position (δ 8,63) und Methylwasserstoff in 3-Position (δ 3,51) beobachtet.
(2) Bei der Bestrahlung von Wasserstoff in 9β-Position (δ 10,18) wurde in dem resultierenden Spektrum NOE bei Methylenwasserstoff in 6-Position (δ 6,43) und Wasserstoff in 8-Position (δ 8,39) beobachtet.
(3) Bei Bestrahlung von Wasserstoff in 9δ-Position (δ 9,70) wurde im resultierenden Spektrum NOE bei Methylwasserstoff in 1-Position (δ 2,56) und Methylenwasserstoff in 2-Position beobachtet.
(4) Bei Bestrahlung von Wasserstoff in 9γ-Position (δ 10,20) wurde in dem resultierenden Spektrum NOE bei Methylenwasserstoff in 2-Position (δ 3,33–3,38) und Methylenwasserstoff in 5-Position (δ 4,34–4,43) beobachtet.
(5) Bei Bestrahlung von Methylenwasserstoff in 6-Position (δ 6,43 und 6,17) wurde in dem resultierenden Spektrum NOE bei dem Methylenwasserstoff in der anderen 6-Position (δ 6,17 und 6,43) beobachtet.
(6) Bei Bestrahlung von Methylwasserstoff in 1-Position (δ 2,56) wurde in dem resultierenden Spektrum NOE bei Wasserstoff in der 9δ-Position und bei Wasserstoff in der 10-Position (δ 10,25) beobachtet.

Als nächstes wird die in Stufe (a) erhaltene Chlorinverbindung P-Me (I) der Stufe (b) unterworfen. Das P-Me (I) wird mit Hydroxylamin umgesetzt, wodurch der 2-Hydroxyiminoethyliden-1-hydroxy-4-vinyl-Deuteroporphyrindimethylester (nachstehend als "NOH-P-Me (I)") erhalten wird.
Diese Reaktion kann entsprechend einer herkömmlichen Verfahrensweise, wie in "Condensation reaction between hydroxylamine and an aldehyde compound" in Ippan Yuki Kagaku Jikken Sho (Text für allgemeine organisch-chemische Experimente) beschrieben, durchgeführt werden. Das so erhaltene NOH-P-Me (I) wird der Stufe (c) unterworfen. Das heißt, NOH-P-Me (I) wird mit Alkali in herkömmlicher Weise hydrolysiert und dann mit Asparaginsäure-Methylester aminiert um den 2-Hydroxyiminoethyliden-1-hydroxy-4-vinyl-Deuteroporphinyl-diasparaginsäuremethylester (nachstehend als "NOH-P-Asp (OMe) (I)" bezeichnet) zu erhalten.
Diese Reaktion kann durch eine herkömmliche Verfahrensweise, wie in Izumiya et al.: "Peptide gosei no kiso to jikken (Grundlage und Experimente der Peptidsynthese), veröffentlicht von Maruzen im Jahre 1985, durchgeführt werden. Insbesondere wird eine Verfahrensweise beschrieben in den JP-OS Nrn. 64-61481, 2-138280, 4-59779, 5-97857 oder 9-124652 oder der JP-PS Nr. 7-25763, bevorzugt.
Der so erhaltene Methylester der Verbindung der Formel (I) gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Ethanol aufgelöst und dann mit Natriumhydroxid hydrolysiert werden, wodurch das Natriumsalz der Verbindung der Formel (I) erhalten wird. Das Natriumsalz kann mit einer geeigneten schwachen Säure behandelt werden um die freie Carbonsäure zu erhalten.
Das Verfahren zur Isolierung und Reinigung von P-Me (I), einem Vorläufer der Verbindung der Formel (I) gemäß der vorliegenden Erfindung wird nachstehend genauer durch die folgenden repräsentativen Beispiele beschrieben.
Wenn die Isolierung und die Reinigung von P-Me (I) aus dem Gemisch von P-Me (I) und P-Me (II) durch Silicagelsäulenchromatographie durchgeführt wird, dann kann ein geeignetes Lösungsmittel, z.B. ein Mischlösungsmittel aus Hexan/Chloroform, verwendet werden. Bei diesem Verfahren werden nichtumgesetztes PP-Me, P-Me (II) und P-Me (I) in dieser Reihenfolge eluiert, so dass das angestrebte P-Me (I) durch Konzentrierung seiner Fraktion, die die letzte Fraktion der Elution ist, erhalten werden kann.
Wenn andererseits die Isolierung und Reinigung durch Umkristallisation durchgeführt wird, dann muss diese mehrere Male wiederholt werden, wobei ein geeignetes Lösungsmittel, wie ein Mischlösungsmittel aus Tetrahydrofuran/Hexan, eingesetzt wird. Bei diesem Verfahren werden nichtumgesetzte PP-Me, P-Me (II) und P-Me (I) in dieser Reihenfolge eluiert, so dass die Fraktion von P-Me (I), die die letzte Fraktion der Elution ist, gesammelt werden soll.
Es ist nicht wesentlich, die vorgenannte Chromatographie oder Umkristallisation nach der Stufe (a) durchzuführen, sondern diese kann auch nach der Stufe (b) oder (c) durchgeführt werden.
Das so erhaltene P-Me (I) wurde den vorgenannten Reaktionen der Stufen (b) und (c) unterworfen, und die resultierende Verbindung wurde hydrolysiert, wodurch das Iminochlorin-Asparaginsäurederivat der Formel (I) (NOH-P-Asp (I)) gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Andererseits wurde auch P-Me (II), das ein Nebenprodukt, gebildet bei der Isolierung und Reinigung von P-Me (I), ist, gleichfalls den Stufen (b) und (c) in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, unterworfen, und die resultierende Verbindung wurde hydrolysiert, wodurch ein Positionsisomeres der Verbindung der Formel (I) gemäß der vorliegenden Erfindung, d.h. NOH-P-Asp (II), das durch die Formel (II) angegeben wird, erhalten wurde. Diese Verbindung wurde als Kontrolle bei den später in den Beispielen beschriebenen Versuchen eingesetzt.
Ein pharmazeutisches Präparat, umfassend das erfindungsgemäße Iminochlorin-Asparaginsäurederivat der Formel (I), kann durch an sich bekannte herkömmliche Verfahren hergestellt werden. So kann z.B. die Verbindung einfacherweise in einem geeigneten Puffer aufgelöst werden, wenn sie in Form der freien Säure vorliegt, während sie einfacherweise in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst werden kann, wenn sie in Form eines Natrium salzes vorliegt. In jedem Falle können geeignete pharmazeutisch annehmbare Additive verwendet werden, wie Solubilisierungsmittel (z.B. ein organisches Lösungsmittel), ein pH-Einstellungsmittel (z.B. eine Säure, eine Base, ein Puffer), ein Stabilisierungsmittel (z.B. Ascorbinsäure), ein Träger (z.B. Maltose) und ein Mittel zur Erzielung von Isotonizität (z.B. Natriumchlorid).
Die Verbindung der Formel (I) gemäß der vorliegenden Erfindung hat zufriedenstellende Eigenschaften als Photosensibilisierungsmittel für die PDT-Therapie, wie eine lange Phosphoreszenz/Lebenszeit, eine gute Affinität gegenüber Albumin, eine spezifische Akkumulationsfähigkeit in einem bestimmten Organ, insbesondere einem Krebsort, sowie einen guten Zellabtötungseffekt, wenn sie Licht ausgesetzt wird, wie durch den Dancylmethionin-Test festgestellt worden ist. Sie besitzt auch eine zufriedenstellende Absorptionswellenlänge, Wasserlöslichkeit und Reinheit. Die gute Wasserlöslichkeit dieser Verbindung gestattet die Herstellung einer Lösung mit hoher Konzentration (z.B. 50 mg/ml). Weiterhin zeigt die Verbindung eine hohe Stabilität in vivo sowie in vitro. Im Allgemeinen ist es zur Verwendung als Photosensibilisierungsmittel für die PDT-Therapie zweckmäßig, die Verbindung einer Person mit einer Dosis von 1 bis 5 mg/kg Körpergewicht zu verabreichen.
Wie oben zum Ausdruck gebracht wurde, ist die Verbindung der Formel (I) der vorliegenden Erfindung strukturell dahingehend charakterisiert, dass sie eine Hydroxyiminogruppe in dem Ring A und einen Asparaginsäurerest an der Propionsäureseitenkette ihres Chlorinskeletts hat. Sie zeigt daher als Ergebnis verschiedene physiologische und pharmakologische Eigenschaften.
Als eine ihrer Eigenschaften akkumuliert sich die Verbindung selektiv in den Tumorzellen, und sie wird davon mit geringer Geschwindigkeit ausgeschieden. Andererseits ist die Ausscheidung von normalen Organen und Zellen rasch, so dass die Verbindung solche Organe und Zellen nicht beschädigt und keine Phototoxizität bewirkt.
Weiterhin gestattet gemäß der vorliegenden Erfindung die Umwandlung eines Porphyrins in ein Chlorinderivat, dass die Absorptionswellenlänge in den Infrarotbereich verschoben wird und dass es als Ergebnis möglich gemacht wird, eine therapeutische Wirksamkeit gegenüber Krebs in tiefen Stellen zu erhalten. Demgemäß ist das Porphyrinderivat gemäß der vorliegenden Erfindung als Photosensibilisierungsmittel für die PDT-Therapie von Krebserkrankungen, von bösartigen Tumoren, einer makulären Alterungsdegenerierung, begleitet von einer choroidalen Revaskularisierung und einer diabetischen Retinopathie, einhergehend mit einer retinalen Revaskularisierung, in der Augenheilkunde geeignet.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genauer unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Synthese des Photoprotoporphyrin-Dimethylesters (P-Me (ein Gemisch der A- und B-Ringpositionsisomeren))
Die Titelverbindung wurde nach der Methode von P. K. Dinello et al., (vergleiche "The Porphyrins", Academic Press, Bd. 1, 303 (1978)), wie folgt synthetisiert. Protoporphyrin-Dimethylester (PP-Me; 100 g) wurde in Chloroform (10 1) aufgelöst. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde eine Woche lang unter Bestrahlung mit Licht umsetzen gelassen, wodurch ein Chlorinderivat des Porphyrins erhalten wurde. Nach beendigter Umsetzung wurde die Reaktionslösung unter vermindertem Druck konzentriert, wodurch die Titelverbindung (P-Me, 100 g) als Rückstand erhalten wurde.
Beispiel 2
Isolierung und Reinigung des A-Ringpositionsisomeren von P-Me (P-Me (I)) und des B-Ringpositionsisomeren von P-Me (P-Me (II)) durch Silicagelsäulenchromatographie
Im Beispiel 1 erhaltener P-Me (100 g) (d.h. ein Gemisch von P-Me (I) und P-Me (II)) wurde einer Silicagelsäulenchromatographie unterworfen und durch eine 10% stufenweise Methode (Elutionsmittel: n-Hexan/Chloroform) wie folgt eluiert. Zuerst wurde nichtumgesetzter PP-Me mit einer 50%igen Chloroformlösung eluiert, und dann wurde P-Me (II) (B-Ringpositionsisomeres; ein Vorläufer der Verbindung (II)) mit einer 80%igen Chloroformlösung eluiert, und am Schluss wurde P-Me (I) (A-Ringpositionsisomeres; ein Vorläufer der Verbindung (I) gemäß der vorliegenden Erfindung) mit einer 90%igen Chloroformlösung herauseluiert. Die einzelnen resultierenden Lösungen wurden gesondert unter vermindertem Druck konzentriert, wodurch nichtumgesetzter PP-Me (23,3 g; 23,3%), P-Me (II) (20,0 g; 18,2%) beziehungsweise P-Me (I) (10,0 g; 9,1 %) erhalten wurde.
Beispiel 3
Isolierung und Reinigung des A-Ringpositionsisomeren (P-Me (I)) und des B-Ringpositionsisomeren (P-Me (II)) durch Umkristallisation
Im Beispiel 1 erhaltener P-Me (100 g) wurde in Pyridin (1 1) aufgelöst, bei 10°C kristallisiert und filtriert um nichtumgesetzten PP-Me (20,6 g (20,6%)) zu sammeln. Das resultierende Filtrat wurde bei vermindertem Druck auf 2/3 seines ursprünglichen Volumens konzentriert, erneut bei –10C kristallisiert und filtriert, wodurch weiterer nichtumgesetzter PP-Me (10,5 g (10,5%)) gesammelt wurde. Das resultierende Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert und in Tetrahydrofuran aufgelöst. Zu der Lösung wurde n-Hexan gegeben, und die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur umkristallisiert. Das resultierende Material wurde einer Filtration unterworfen, wodurch P-Me (II) (8,9 g (8,1 %)) erhalten wurde. Danach wurde das Filtrat unter vermindertem Druck konzentriert und dann wiederholt einer Umkristallisation mit Tetrahydrofuran unterworfen, wodurch P-Me (I), der ein Vorläufer der Verbindung (I) gemäß der vorliegenden Erfindung ist, erhalten wurde (4,5 g (4,1 %)).
¹H-NMR: δ 1,7 (3H, s, CH ₃-C-OH), 7,0 (1H, d, =CH-CHO), 11,0 (1H, d, =CH-CHO), MS: M⁺ 622
Beispiel 4
Hydroxyiminierung und Hydrolyse von P-Me (I) und P-Me (II)
Im Beispiel 3 erhaltene P-Me (I) und P-Me (II) wurden jeweils gesondert abgewogen (jeweils 10 g) und jeweils in Pyridin (190 ml) aufgelöst. Zu der resultierenden Lösung wurde eine Lösung von Hydroxylaminhydrochlorid in Pyridin (2 g/20 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 1,5 Stunden lang unter Rühren bei Raumtemperatur umsetzen gelassen. Nach beendigter Reaktion wurde die Reaktionslösung in Eiswasser eingegossen um eine kristalline Substanz zur Ausfällung zu bringen. Die kristalline Substanz wurde durch Filtration gesammelt. Auf diese Weise wurde ein Vorläufer der Verbindung (I) gemäß der vorliegenden Erfindung, Hydroxyimino-P-Me NOH-P-Me (I); (10 g (98%)) aus P-Me (I) erhalten, und sein Positionsisomeres NOH-P-Me (II) (10 g (98%)) wurde aus P-Me (II) erhalten.
¹H-NMR: δ 2,5 (3H, s, CH ₃-C-OH), 8,6 (1H, d, =CH-CH=NOH), 10,2 (1H, d, =CH-CH=NOH), MS: M⁺ 637
Die Gesamtmenge von jeweils NOH-P-Me (I) und NOH-P-Me (II), erhalten bei der obigen Verfahrensweise, wurde getrennt in Tetrahydrofuran (200 ml) aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde mit einer 1N Natriumhydroxidlösung in herkömmlicher Weise hydrolysiert, und dann wurde eine 20%ige Zitronensäurelösung zur Neutralisation hinzugegeben. Auf diese Weise wurde ein Niederschlag erhalten. Der so erhaltene Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und getrocknet. Auf diese Weise wurde ein Vorläufer der Verbindung (I) gemäß der vorliegenden Erfindung, nämlich Hydroxyimino-P (NOH-P (I); 9,1 g (95%)) aus NOH-P-Me (I) erhalten, und sein Positionsisomeres, NOH-P (II) (9,1 g (95%)) wurde aus NOH-P-Me (II) erhalten.
MS: M⁺ 609
Beispiel 5
Umwandlung von NOH-P (I) und NOH-P (II) in ihre Asparaginsäurederivate
In Beispiel 4 erhaltene NOH-P (I) und NOH-P (II) wurden jeweils gesondert abgewogen (jeweils 2 g), in Dimethylformamid aufgelöst und in ein Dicyclohexylamin (DCHA)-Salz (jeweils 2,0 g) mit DCHA in herkömmlicher Weise umgewandelt. Die jeweiligen resultierenden DCHA-Salze wurden in Dimethylformamid (100 ml) aufgelöst. Zu der resultierenden Lösung wurde Asparaginsäuredimethylester(AspOMe)hydrochlorid (2 g) gegeben, und es wurde weiterhin wasserlösliches Carbodiimid (WSC; 2 g) langsam unter Rühren hinzugesetzt. Die jeweiligen resultierenden Lösungen wurden 10 Stunden lang umsetzen gelassen. Nach beendigter Reaktion (der Reaktionsendpunkt wurde durch TLC bestätigt) wurde zu jeder Reaktionslösung Wasser zugesetzt um eine Ausfällung zu bewirken. Die einzelnen resultierenden Niederschläge wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet und wiederholt mit Aceton/Ethylacetat umkristallisiert. Auf diese Weise wurde ein Methylester der Verbindung (I) gemäß der vorliegenden Erfindung, d.h. der Hydroxyiminoethylidenchlorinyl-Diasparaginsäuremethylester (NOH-P-Asp(OMe) (I); 0,4 g (13,8%)) aus NOH-P (I) erhalten, und sein Positionsisomeres, NOH-P-Asp(OMe) (II) (0,5 g (17,2%)) wurde aus NOH-P (II) als dunkelgrünlich-braune Kristalle erhalten.
¹H-NMR: δ 2,5 (3H, s, CH ₃-C-OH), 5,2 (1H, m, -CONH-CH-CH2OOOCH₃), 8,6 (1H, d, =CH-CH=NOH), 10,2 (1H, d, =CH-CH=NOH) MS: M+ 895
Beispiel 6
Hydrolyse von NOH-P-Asp (OMe) (I und II) (Herstellung der Natriumsalze)
In Beispiel 5 erhaltenes NOH-P-Asp (OMe) (I) und NOH-P-Asp (OMe) (II) wurden jeweils gesondert abgewogen (jeweils 1 g) und in herkömmlicher Weise durch langsame Zugabe von Ethylalkohol (20 ml) und einer 1N Natriumhydroxidlösung (30 ml) hydrolysiert. Nach beendigter Reaktion (der Reaktionsendpunkt wurde durch TLC bestätigt) wurde Ethylalkohol zu jeder Reaktionslösung hinzugesetzt um hierdurch eine Ausfällung zu bewirken. Die einzelnen resultierenden Niederschläge wurden durch Filtration gesammelt und in Wasser aufgelöst. Zu der resultierenden Lösung wurde zusätzlich Ethylalkohol gegeben um hierdurch eine Ausfällung zu bewirken. Jeder resultierende Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt. Diese Verfahrenweise wurde zur Reinigung mehrere Male wiederholt. Auf diese Weise wurde ein Natriumsalz von NOH-P-Asp (I) (Verbindung (I) gemäß der vorliegenden Erfindung; 0,9 g (87,4%)) aus NOH-P-Asp (OMe) (I) erhalten, und sein Positionsisomeres NOH-P-Asp (II) (ein Natriumsalz von NOH-P-Asp (II); 0,98 g (95,1%)) wurde aus NOH-P-Asp (OMe) (II) erhalten.
MS: ^M+ 927
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Natriumsalzes von NOH-P-Asp (I) ist in 1 gezeigt.
Beispiel 7
Hydrolyse von NOH-P-Asp (OMe) (I und II) (Herstellung der freien Säuren)
NOH-P-Asp (OMe) (I) und NOH-P-Asp (OMe) (II), erhalten in Beispiel 5, wurden jeweils gesondert abgewogen (jeweils 1 g) und in der gleichen Weise wie im Beispiel 6 zur Hydrolyse behandelt. Zu jeder der resultierenden Lösungen wurde das doppelte Volumen von Wasser gegeben. Die Mischlösung wurde mit 5%iger Zitronensäurelösung neutralisiert um eine Ausfällung zu bewirken. Jeder resultierende Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise wurde NOH-P-Asp (I) (Verbindung (I) gemäß der vorliegenden Erfindung; 0,8 g (85,0%)) aus NOH-P-Asp (OMe) (I) erhalten, und sein Positionsisomeres, NOH-P-Asp (II) (0,9 g (95,4%)) wurde aus NOH-P-Asp (OMe) (II) erhalten.
Beispiel 8
Laserbestrahlung eines exstirpierten Organs (angeregtes Fluoreszenzspektrum der Oberfläche des Organs)
CDF₁-Mäusen (5 pro Gruppe) wurden die Tumorgewebe von Darmkrebs Colon 26 implantiert. Zwei Wochen nach der Implantation erhielten die Mäuse eine intravenöse Injektion der Natriumsalze der einzelnen Verbindungen (I) und (II) (10 mg/kg für jede Maus), die mit destilliertem Wasser zur Injektion verdünnt worden waren. 3 h, 6 h und 12 h nach der Injektion wurden Blutproben abgenommen, und die Organe mit dem Tumorgewebe wurden entfernt, mit einem N₂-gepulstem Laser (N₂, Wellenlänge: 337 nm, 2 ns) bestrahlt, und dann wurde das angeregte Fluoreszenzspektrum gemessen. Die Wellenlängen im Bereich von 600 bis 900 wurden auf der Basis der Peakwellenlänge von NADH bei 470 nm bestimmt (Bestimmung der Verteilung der Testverbindung in dem Organ durch Oberflächenfluoreszenzverfahren unter Verwendung der N₂-gepulsten Laserspektrophotometrie). Das heißt, das Krebs/Organ (oder Plasma)-Verhältnis wurde dadurch bestimmt, dass die Peakwellenlänge im Bereich von 600 bis 900 nm errechnet wurde, wobei die Peakwellenlänge bei 470 nm als Grundwert 1 angenommen wurde. Die Ergebnisse sind in den untenstehenden Tabellen 1 und 2 zusammengestellt.
Die Tabelle 1 zeigt die erhaltenen Werte nach der Verabreichung des Natriumsalzes der Verbindung (I). Die Tabelle 2 zeigt die erhaltenen Werte nach der Verabreichung des Natriumsalzes der Verbindung (II).
Tabelle 1 Verteilung der Verbindung (I) im Körper
Tabelle 2 Verteilung der Verbindung (II) im Körper
Wie aus den obigen Tabellen ersichtlich wird, wurde gefunden, dass die Verbindung (I) gemäß der vorliegenden Erfindung eine erheblich höhere Akkumulierbarkeit in Krebs-Geweben im Vergleich zu seinem Positionsisomeren hat.
Beispiel 9
HeLa-Zellen wurden in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen, jeweils enthaltend 100 μl eines Kulturmediums, bei 5 × 10³/Vertiefung eingeimpft. Dann wurde bei 37°C über Nacht inkubiert. In jeder Vertiefung wurde das Kulturmedium entfernt, und es wurden 100 μl einer Lösung, enthaltend das Natriumsalz der Verbindung (I) oder der Verbindung (II), in Konzentrationen von 0, 6,25, 12,5, 25, 50 und 100 μM/ml zugegeben (3 Vertiefungen für jede Gruppe der Konzentrationen). Es wurde 6 h bei 37°C inkubiert. Jede Vertiefung wurde einmal mit PBS() gewaschen, und dann wurden 100 μl frisches Medium zugesetzt. Die Vertiefungen wurden unter Verwendung eines Diodenlasers (670 nm) bei den Bedingungen einer Laserintensität von 0,44 W, einer Bestrahlungsfläche von 0,785 cm² (Durchmesser 1 cm) und einer Laserenergie von 25 J/cm² bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurde jede Vertiefung über Nacht bei 37°C inkubiert und einmal mit PBS(–) gewaschen. Dann wurden 100 μl eines frischen Mediums zugesetzt. In jede Vertiefung wurden 20 μl des MTB-PMS-Reagenzes gegeben, und die Vertiefung wurde weiter 2 bis 4 h lang bei 37°C inubiert. Die Extinktion jeder Vertiefung bei 492 nm wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Ablesegeräts gemessen. Die Zellenüberlebensrate bei jeder der oben angegebenen Konzentrationen der Testverbindung wurde errechnet, wobei der Wert für eine Vertiefung mit 0 μM/ml der Testverbindung als 100% gesetzt wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Tabelle 3 Zellüberlebensrate (%)
Aus Tabelle 3 wird ersichtlich, dass bestätigt wurde, dass die Verbindung der Formel (I) gemäß der vorliegenden Erfindung einen erheblich höheren Zellabtötungseffekt gegenüber Tumorzellen im Vergleich zu ihrem Positionsisomeren hat.
Beispiel 10
Untersuchungen bezüglich der Okklusion von choroidalen neoplastischen Gefäßen
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt um die optimalen Behandlungsparameter (das Timing der Laserbestrahlung nach Verabreichung der Verbindung; Laserbestrahlungsdosis) für die selektive Okklusion von choroidalen neoplastischen Gefäßen durch PDT-Therapie unter Verwendung der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung und eines Diodenlasers (hergestellt von Hamamatsu Photonics; Wellenlänge: 672 nm) zu bestimmen.
1. Methoden
Eine Photokoagulierung wurde bei Ratten (Long Evance-Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 300 g) durch eine Argon-Grünlaser-Bestrahlung (Strahlungsdurchmesser: 100 μm, 140 mW, 0,1 s) in der Nähe der retinalen Papilla auf dem Augenhintergrund induziert. Zehn Tage nach der Photokoagulierung wurden Fotografien des Augenhintergrunds und Fluorescein- Antiographien erstellt. Die Tiere, die eine Entwicklung einer choroidalen Revaskularisierung zeigten, wurden für die Experimente am 11. Tag verwendet.
Die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde auf dem Weg über die Schwanzvene mit einer Dosis von 16 mg/kg verabreicht. Nach der Verabreichung wurde die Verteilung im Lauf der Zeit der Verbindung in den Augapfelgeweben durch Fluoreszenz-Mikroskopie bestimmt.
Die Laserbestrahlung erfolgte unter Verwendung des vorgenannten Diodenlasers. Es wurde bestätigt, dass das Laserbündel sich im Bereich von 500 μm im Durchmesser auf der retinalen Oberfläche ausdehnte. Die Bestrahlungsdauer war 4 Minuten, und die Bestrahlungsintensität variierte bei 30,6, 91,7, 152,9 und 244,9 mW/cm² auf der retinalen Oberfläche. Diese Werte entsprechen 7,4, 22,0, 36,7 beziehungsweise 58,8 J/cm².
Die Bewertung der PDT-Therapie unter Verwendung der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgte auf der Basis der Hintergrundfotografien, aufgenommen mit einer Hintergrundkamera (hergestellt von Jenesis Kowa), 1 Stunde und 24 Stunden nach der Bestrahlung mit dem Laser. Eine Okklusion der neoplastischen Gefäße und eine Beschädigung des umgebenden Gewebe wurden durch eine Fluoreszein-Angiographie und durch histologische Untersuchungen untersucht um die Selektivität des therapeutischen Effekts zu bestimmen.
2. Ergebnisse
(1) Verteilung der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung im Laufe der Zeit

1) Bei den vorläufigen Experimenten mit Ratten und Kaninchen betrug die Halbwertszeit der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung im Blut 30 Minuten nach der intravenösen Verabreichung. Nach 24 Stunden war die Verbindung im Blut nicht mehr feststellbar.
2) Fünf Minuten nach der Verabreichung der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine schwache Fluoreszenz, herrührend von der Verbindung in den gesamten choroidalen neovaskulären Geweben, beobachtet. Jedoch war die Intensität der Fluoreszenz zwischen den neoplastischen Gefäßen und den umgebenden Geweben nicht klar unterschiedlich. In der Aderhaut wurde eine Fluoreszenz in den Lumina der Choriokapillaren der choroidalen Arterien und der Venen beobachtet. Eine Fluoreszenz, resultierend von der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung, wurde auch in der choroidalen Arterienwand beobachtet. In der Retina wurde eine vorherrschende Fluoreszenz in der Arterienwand beobachtet, und eine schwache Fluoreszenz wurde in den Lumina der Blutkapillaren beobachtet.
3) 30 Minuten bis 1 Stunde nach der Verabreichung nahm die Fluoreszenz von den gesamten neoplastischen Gefäßen zu.
4) Zwei Stunden nach der Verabreichung wurde eine markante Fluoreszenz in der choroidalen Arterienwand beobachtet, während die Fluoreszenz in den Lumina der großen choroidalen Gefäße und der retinalen Arterienwand verringert war. Die Fluoreszenz in den Choriocapillaris-Venen war verschwunden.
5) Vier Stunden nach der Verabreichung nahm die Fluoreszenz in der choroidalen Arterienwand und den retinalen Gefäßen allmählich ab, während die Fluoreszenz in den choroidalen neoplastischen Gefäßen andauerte.
6) Vierundzwanzig Stunden nach der Verabreichung war die gesamte Fluoreszenz in den choroidalen neoplastischen Gefäßen und in anderen Gefäßen verschwunden.

(2) Effekte der Laserbestrahlung
In der untenstehenden Tabelle 4 sind die histologischen Ergebnisse 24 Stunden nach der Bestrahlung mit Laser zusammengestellt.
Tabelle 4
Wie aus der obigen Tabelle klar ersichtlich wird, hing das Ausmaß der Okklusion der choroidalen neoplastischen Gefäße der Choriocapillaris, der retinalen Kapillaren, der choroidalen Arterien und der Venen von der Dosis der Laserbestrahlung und der Zeitspanne zwischen der Verabreichung der Verbindung und der Laserbestrahlung ab. Als Ergebnis wurde eine selektive Okklusion der choroidalen neoplastischen Gefäße und der Choriocapillaris erzielt, ohne dass eine schwerwiegende Beschädigung der retinalen Kapillaren und der choroidalen Arterien sowie der Venen bewirkt wurde, als die Laserbestrahlung mit 7,4 J/cm² unmittelbar nach Verabreichung der Verbindung oder mit 22,0 J/cm² 2 bis 4 Stunden nach der Verabreichung durchgeführt wurde.
Technische Anwendbarkeit
Das Iminochlorin-Asparaginsäurederivat gemäß der vorliegenden Erfindung hat eine hohe Akkumulierbarkeit in Krebszellen, eine Reaktivität gegenüber äußerer Energie und einen Zerstörungseffekt für Krebszellen. Weiterhin zeigt es keine Toxizität gegen normale Zellen wegen seines raschen Stoffwechsels in dem lebenden Körper. Demgemäß ist es ausnehmend gut als diagnostisches und therapeutisches Mittel für Krebserkrankungen und eine Revaskularisierung in der Augenheilkunde geeignet.

Claims

Iminochlorin-Asparaginsäurederivat der folgenden Formel (I)
worin Asp einen Asparaginsäurerest bedeutet, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Photosensibilisierungsmittel für die Diagnose oder Behandlung, umfassend das Iminochlorin-Asparaginsäurederivat der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nach Anspruch 1.
Photosensibilisierungsmittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es für die Diagnose oder Behandlung von Krebs verwendbar ist.
Photosensibilisierungsmittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es für die Diagnose oder Behandlung einer Augen-Revaskularisierung geeignet ist.
Photosensibilisierungsmittel nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es für die Diagnose oder Behandlung des Menschen oder Tieren geeignet ist.