KR20000048843A

KR20000048843A - 이미노클로린아스파르트산 유도체

Info

Publication number: KR20000048843A
Application number: KR1019990702842A
Authority: KR
Inventors: 히끼다무네오; 모리마사히꼬; 사까따이사오; 나까지마스스무; 다까따히로유끼
Original assignee: 마쓰자와 도로, 하야시 지로; 닛뽕 와이스 레다리 가부시키가이샤; 가부시키가이샤 히까리케미카루겡뀨쇼
Priority date: 1996-10-01
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 2000-07-25
Also published as: ATE244244T1; CA2268968A1; PT945454E; AU4322997A; ES2202640T3; DK0945454T3; DE69723298D1; AU713059B2; EP0945454B1; WO1998014453A1; EP0945454A4; KR100463478B1; US6063777A; CA2268968C; DE69723298T2; JP3613599B2; EP0945454A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 이미노클로린아스파르트산 유도체 및 그의 약리학적으로 허용되는 염에 관한 것이다 :

[화학식 Ⅰ]

(식 중, Asp 는 아스파르트산 잔기를 나타낸다.).

이들 화합물은 암의 광물리화학적 진단 및 치료에 있어서 유용한 광 증감제로서 사용되며, 암세포에 대한 선택적 집적성, 외부 에너지에 대한 반응성 및 세포파괴효과를 가지며, 심부의 암에도 치료효과를 발현하는 반면, 정상세포로부터는 신속하게 배설되어 손상을 입히지 않는 특징이 있다.

Description

이미노클로린아스파르트산 유도체 {IMINOCHLORINASPARTIC ACID DERIVATIVES}

암의 새로운 치료법으로서 광물리화학적 진단·치료법 (PDT : Photodynamic Therapy) 이 행해지고 있다. 이것은 어떤 종의 포르피린 유도체를 정맥주사 등의 방법으로 투여하여 암 조직에 선택적으로 집적시킨 후, 레이저광을 조사함으로써 암 조직만을 파괴하는 것으로, 포르피린 유도체가 갖는 암 조직에 대한 선택성과 광 증감작용의 두가지 성질을 이용한 요법이다.

현재, 이 PDT 에 임상적으로 사용되고 있는 유일한 포르피린 유도체는 포르피머(porphymer) 나트륨이다. 이 포르피머 나트륨은 헤마토포르피린을 아세트산 중 황산으로 처리한 후, 0.1 N 수산화나트륨 수용액에서 추가로 가수분해하여 수득되는 생성물의 혼합물이고, 헤마토포르피린 유도체의 에테르체 및/또는 에스테르체로 이루어진 2 내지 6 량체의 중합체이다.

그러나, 포르피머 나트륨은 인체에 투여했을 때 부작용으로서 일시적인 광과민증을 일으킨다고 하는 것이 알려져 있고, 또한, 아직 포르피머 나트륨의 암 조직에 대한 선택성은 충분한 것은 아니며, 정상조직에 대한 집적성도 인정된다.

따라서, 투여를 받은 환자는, 정상조직에 집적된 포르피머 나트륨에 의한 광 증감작용에 의해 정상세포가 파괴되지 않도록, 그것이 체외로 배설될 때까지 장시간에 걸쳐 어두운 곳에 머무르는 것이 필요하지만, 포르피머 나트륨은 정상조직에서의 배출속도가 느리기 때문에, 시간적으로 6 주간 이상에 걸쳐 광과민증이 남는다는 것도 보고되어 있다.

더불어, 포르피머 나트륨을 사용한 PDT 에서는, 사용되는 레이저광의 조직투과성에 대해서도 문제가 내재되어 있다. 포르피머 나트륨은 그 최장파장흡수단이 630 nm 이고, 몰 흡광계수도 3000 으로 낮다. 생체에는 옥시헤모글로빈이나 물과 같이 광의 투과를 방해하는 성분이 많이 존재하며, 이 630 nm 의 레이저광에서는 조직에 대한 투과성이 나쁘고, 심부까지 충분히 투과하지 않음으로 인해, 포르피머 나트륨을 사용한 PDT 의 대상은 5 내지 10 mm 의 표층부의 암에 한정되어 있다. 생체성분의 광흡수에 의한 영향이 가장 적은 파장은 650 내지 750 nm 의 범위인 사실로부터, 이 파장 범위내에서 최장파장흡수단을 가진 PDT 용 광 증감제가 가장 바람직한 것이라고 할 수있다.

그리고, 레이저장치에 대해서도 여러가지 문제가 있다. 현재 가장 자주 사용되고 있는 색소 레이저는 레이저광 자체의 안정성이 나쁘고, 운용상 취급이 어렵다. 이에 반해, 티탄 사파이어 레이저를 사용하면 운용이 꽤 간단해 지지만, 이 레이저를 사용하는 경우에는 여기가능한(excitable) 파장이 670 nm 이상 및 600 nm 이하로 한정되어지고, 630 nm 부근에 흡수파장을 갖는 포르피머 나트륨에는 적용불가능하다.

최근, 반도체 레이저 (670 nm) 가 개발되어 670 nm 부근에 흡수를 갖는 화합물에도 적용가능해지고, 또한 아주 최근에는 OPO-YAG 레이저가 개발되어 대부분의 가시파장을 커버할 수 있다는 것을 알 수 있다.

상기와 같이, 현재 사용되고 있는 PDT 용 광 증감제에는 여러가지 문제점이 있고, 이들 문제점을 해소한 새로운 약제의 개발이 강하게 요망되고 있다. 상기 약제가 가진 결점을 극복하는 것으로서, 단일화합물이며 또한 장파장영역 (650 내지 800 nm) 에 흡수를 가진 화합물이 제 2 세대 약물로서 제안되었다.

이와 같은 제 2 세대 약물로서는, 프로토포르피린 전구체인 아미노레블린산 (ALA); 클로린유도체인 아스파르틸클로린e6 (NPe6); 혈색소 유래의 포르피린에서 구조변환된 신규 클로린 유도체인 벤조포르피린 유도체 (BPD) 및 메타테트라히드록시페닐클로린 (m-THPC) 등이 포함된다.

또한, 본 발명자들은 클로린 유도체와 그 유사체인 히드록시이미노클로리닐 아스파르트산 유도체 (NOH-P-Asp) 를 제안하였으며 (일본 공개특허공보 평5-97857호 및 일본 공개특허공보 평9-124652호), 이들 화합물이 PDT 용 광 증감제로서 유효한 것임을 확인하였다.

그러나, 더 큰 안전성과 더 높은 치료효과를 갖는 PDT 용 광 증감제의 개발이 요구되어지고 있다.

따라서, 본 발명은, 단일성분이고 안정하면서 암 조직에 대한 양호한 집적성을 유지한 채로, 정상조직에서는 배출속도가 빠르고 광독성을 저감시키며, 게다가 티탄 사파이어 레이저 (670 nm 이상 및 600 nm 이하의 파장) 및 반도체 레이저 (670 nm) 의 사용이 가능한 포르피린 유도체를 탐색하고, PDT 에 적합한 광 증감제를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 먼저, 포르피린 유도체 중에서 혈액 유래의 프로토포르피린 디메틸에스테르로부터 합성유도한 클로린의 측쇄에 히드록시이미노기 및 아스파르트산의 잔기를 결합시키면, 하기 화학식 Ⅰ 및 화학식 Ⅱ 로 나타내는 2종의 위치 이성체의 혼합물이 수득되는 것을 개시하고 있다 (일본 공개특허공보 평5-97857호) :

(상기 식에서, Asp 는 아스파르트산 잔기를 나타낸다.),

(상기 식에서, Asp 는 아스파르트산 잔기를 나타낸다.).

금번, 본 발명자들은 이 2 종의 위치 이성체 혼합물을 크로마토그래피 또는 재결정법에 의해 분리한 결과, A 환에 이미노기를 갖는 화합물 (Ⅰ) 이 B 환에 이미노기를 갖는 화합물 (Ⅱ) 에 비해, 암 조직에 대해 현저히 뛰어난 집적성을 갖는 것을 발견하였다. 게다가, 상기 식 Ⅰ 의 화합물은, 광 증감반응에 의한 강력한 세포파괴효과와 정상조직으로부터의 신속한 배출성 및 670 nm 이상에서 최장파장흡수단을 가지고 있는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자의 한사람이 법칙성을 발견한 알부민 테스트 (클로린 유도체와 알부민의 혼합물의 자외선 흡수 (UV) 스펙트럼의 변화를 조사하고, 암에 대한 친화성을 간편하게 평가하는 방법) 및 댄실(dancyl)메티오닌 테스트 (박층크로마토그래피 (TLC) 나 고속액체크로마토그래피 (HPLC) 에 의해 광에 대한 반응성의 강약을 간편하게 평가하는 방법) (일본 공개특허공보 평5-97857호 참조) 에 의해 상기 화학식 Ⅰ 의 화합물을 평가한 결과, 뛰어난 암 조직으로의 이행성과 강한 광 증감작용을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

발명의 개시

본 발명은 상기의 견지에 입각하여 완성된 것으로서, 그 양태로서 하기 화학식 Ⅰ 로 나타내는 이미노클로린아스파르트산 유도체 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 제공한다 :

[화학식 Ⅰ]

(식 중, Asp 는 아스파르트산 잔기를 나타낸다.).

또한, 본 발명은, 그 밖의 양태로서 식 Ⅰ 로 나타내어지는 이미노클로린아스파르트산 유도체 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 진단용 또는 치료용 광 증감제를 제공한다.

본 발명의 특히 바람직한 양태로서는, 암의 진단 또는 치료에 사용되는 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 이미노클로린아스파르트산 유도체 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 광 증감제이다.

또 다른 바람직한 양태로서는, 안과 분야에 있어서의 신생혈관의 진단 또는 치료에 사용되는 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 이미노클로린아스파르트산 유도체 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 광 증감제이다.

이들 광 증감제는 인간 또는 동물의 진단 혹은 치료에 사용되는 것이기도 하다.

본 발명은 이미노클로린아스파르트산 유도체 또는 그 약리학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 그리고, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 하는 인간 또는 동물의 진단 혹은 치료에 사용되는 광 증감제에 관한 것이다.

도 1 은, 본 발명의 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 이미노클로린아스파르트산 유도체 (NOH-P-Asp) 의 Na 염의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

본 발명이 제공하는 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 이미노클로린아스파르트산 유도체는, 다음과 같이 제조된다.

즉, 프로토포르피린 디메틸에스테르를 알데히드기를 갖는 클로린 유도체로 변환시키는 클로린화 공정 (a), 이어서 수득된 클로린 유도체의 알데히드기에 히드록실아민을 결합시키는 공정 (b), 그리고 수득된 화합물에 아스파르트산을 아미드 결합시키는 공정 (c) 를 차례로 실시함으로써 제조할 수 있다. 이 경우의 제조공정에 있어서는, 공정 (b) 와 공정 (c) 의 순서는 반드시 이 순서대로 행할 필요는 없고, 상기 공정 (c) 의 반응을 행한 후에 공정 (b) 의 반응을 행하는 것과 같이 공정순서가 바뀌어도 된다.

그리고, 상기 공정 (a) 의 실시에 의해, A 환에 알데히드기를 갖는 화합물 및 B 환에 알데히드기를 갖는 화합물의 2 종의 위치 이성체의 혼합물이 얻어지는데, 이 위치 이성체를 분리·정제함으로써, 목적으로 하는 A 환에 알데히드기를 갖는 클로린 유도체를 분리하고, 그 후 공정 (b) 및 공정 (c) 를 행함으로써, 본 발명의 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 이미노클로린아스파르트산 유도체를 단일 화합물로서 얻을 수 있다. 또한, 공정 (a) 에서 수득된 2 종의 위치 이성체 혼합물을 분리·정제하지 않고 그대로 사용하여 다음의 각 공정을 행한 후, 적절히 공정 (b) 또는 공정 (c) 의 종료후에 분리·정제를 행함으로써, 목적으로 하는 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 화합물을 단일화합물로서 얻을 수도 있다.

다음에, 각 공정에 대해 상세하게 설명한다.

상기 클로린화 공정 (a) 는, J.E.Falk 의 저술 [Porphyrins and Metalloporphyrins] (Elsevier 발행, 1975년) 및 D. Dolphin 의 저술 [The Porphyrins] (Academic Press 발행, 1978 년) 등에 기재된 통상적인 방법에 따라 이를 행할 수 있다.

즉, 클로린화 공정 (a) 에 있어서는, 프로토포르피린 디메틸에스테르 (이하, PP-Me 라고 함) 를 광화학 반응처리를 거침으로써, 본 발명의 화학식 Ⅰ 의 화합물의 전구체인 2-포르밀에틸리덴-1-히드록시-4-비닐-듀테로포르피린 디메틸에스테르 (이하, P-Me (Ⅰ) 이라 함) 와, 그의 위치 이성체인 4-포르밀에틸리덴-3-히드록시-2-비닐-듀테로포르피린 디메틸에스테르 (이하, P-Me (Ⅱ) 라 함) 의 혼합물이 수득된다. 이 혼합물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 또는 적당한 용매를 사용한 재결정법에 의해 분리·정제하여, P-Me (Ⅰ) 및 P-Me (Ⅱ) 를 각각 얻는다.

상기에서 수득되는 P-Me (Ⅰ) 의 구조는 다음의 NOE 실험결과에 기초하여 결정된다.

(1) 9α 위 수소 (δ9.79) 를 조사(照射)했을 때의 스펙트럼에 있어서, 7 위 수소 (δ8.63) 및 3 위 메틸수소 (δ3.51) 에서 NOE 가 관찰된다.

(2) 9β 위 수소 (δ10.18) 를 조사했을 때의 스펙트럼에 있어서, 6 위 메틸렌수소 (δ6.43) 및 8 위 메틸수소 (δ8.39) 에서 NOE 가 관찰된다.

(3) 9δ 위 수소 (δ9.70) 를 조사했을 때의 스펙트럼에 있어서, 1 위 메틸수소 (δ2.56) 및 2 위 메틸렌수소에서 NOE 가 관찰된다.

(4) 9γ 위 수소 (δ10.20) 를 조사했을 때의 스펙트럼에 있어서, 2 위 메틸렌수소 (δ3.33 내지 3.38) 및 5 위 메틸렌수소 (δ4.34 내지 4.43) 에서 NOE 가 관찰된다.

(5) 6 위 메틸렌수소 (δ6.43 및 6.17) 의 각각을 조사했을 때의 스펙트럼에 있어서, 6 위의 나머지 한쪽의 메틸렌수소 (δ6.17 및 6.43) 에서 NOE 가 관찰된다.

(6) 1 위 메틸수소 (δ2.56) 를 조사했을 때의 스펙트럼에 있어서, 9δ 위 수소 및 10 위 수소 (δ10.25) 에서 NOE 가 관찰된다.

다음으로, 상기 공정 (a) 에서 수득된 클로린 화합물 P-Me (Ⅰ) 에 대해 공정 (b) 를 수행한다. P-Me (Ⅰ) 과 히드록실아민을 반응시켜서 2-히드록시이미노에틸리덴-1-히드록시-4-비닐-듀테로포르피린 디메틸에스테르 (이하, NOH-P-Me (Ⅰ) 이라고 함) 를 제조한다.

이 반응은, 일반유기화학실험서 중 「히드록실아민과 알데히드 화합물과의축합반응」에 기재된 통상의 방법에 따라 행할 수 있다.

이상과 같이 하여 제조된 NOH-P-Me (Ⅰ) 에 대해 공정 (c) 를 수행한다. 즉, NOH-P-Me (Ⅰ) 을 통상적인 방법에 따라 알칼리로 가수분해한 후, 아스파르트산 메틸 에스테르와 아미드반응시킴으로써, 2-히드록시이미노에틸리덴-1-히드록시-4-비닐-듀테로포르피닐 디아스파르트산 메틸에스테르 (이하, NOH-P-Asp (OMe) (Ⅰ) 이라고 함) 를 얻는다.

이 반응은 이즈미야 외 공저 「펩티드합성의 기초와 실험」(마루젠 발행, 1985년) 등에 기재된 통상적인 방법에 따라 행할 수 있고, 특히 일본 공개특허공보 소64-61481호, 일본 특허공보 평7-25763호, 일본 공개특허공보 평2-138280호, 일본 공개특허공보 평4-59779호, 일본 공개특허공보 평5-97857호 및 일본 공개특허공보 평9-124652호에 기재된 방법에 따라 실시하면 된다.

이렇게 하여 수득된 본 발명의 화합물 (Ⅰ) 의 메틸에스테르체를 에탄올에 용해·현탁시킨 후, 수산화나트륨 수용액으로 가수분해를 행함으로써, 본 발명 화합물 (Ⅰ) 의 나트륨염을 얻을 수 있다. 또한, 이 나트륨염을 적당한 약산으로 처리함으로써, 유리(遊離) 카르복실산을 얻을 수 있다.

이하, 대표적 합성예를 들어 본 발명 화합물 (Ⅰ) 의 전구체인 P-Me (Ⅰ) 의 분리·정제를 더욱 구체적으로 설명한다.

우선, 공정 (a) 에 있어서 수득된 P-Me (Ⅰ) 과 P-Me (Ⅱ) 의 혼합물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리·정제하는 경우에는, 적당한 용출용매, 예를 들면, 헥산-클로로포름의 혼합용매 등을 사용할 수 있다. 이 공정에서는, 최초로 미반응의 PP-Me 가 용출되고, 이어서 P-Me (Ⅱ), P-Me (Ⅰ) 의 순으로 용출되므로, 나중에 용출하는 P-Me (Ⅰ) 의 분획을 농축함으로써 목적물이 수득된다.

한편, 상기 화합물을 재결정법에 의해 분리·정제하는 경우에는, 적당한 용매, 즉, 테트라히드로푸란-헥산의 혼합용매 등을 사용하여 수회의 재결정화를 반복한다. 최초로 미반응의 PP-Me 가 석출되고, 이어서, P-Me (Ⅱ) 가, 그리고 마지막에 목적물인 P-Me (Ⅰ) 이 석출되므로, 이것을 수집한다.

그리고, 상기 크로마토그래피 또는 재결정법을, 공정 (a) 다음이 아니라 공정 (b) 또는 공정 (c) 의 다음에 실시하여도 마찬가지로 위치 이성체를 분리할 수 있다.

상기 방법에 의해 수득된 P-Me (Ⅰ) 을, 상기와 같이 공정 (b) 및 공정 (c) 를 거친 후 생성물을 가수분해함으로써, 본 발명의 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 이미노클로린아스파르트산 유도체 (NOH-P-Asp (Ⅰ)) 를 얻는다.

또한, P-Me (Ⅰ) 의 분리 정제시에 부생성물로서 수득되는 P-Me (Ⅱ) 를, 마찬가지로 공정 (b) 및 공정 (c) 를 거친 후 생성물을 가수분해함으로써, 본 발명의 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 화합물의 위치 이성체인 화학식 Ⅱ 의 NOH-P-Asp (Ⅱ) 를 얻는다. 이 화합물을 하기 실시예에 있어서의 시험에서 대조 화합물로서 사용한다.

본 발명에 의한 화학식 Ⅰ 의 이미노클로린아스파르트산 유도체를 함유하는 제제의 조제는 그 자체로 공지된 방법에 의해 실시할 수 있고, 본 발명에 의한 유도체가 유리산인 경우에는 적당한 완충액, 또는 그것이 Na 염인 경우에는 생리식염수로 용해시키는 것만으로 제제를 조제할 수 있다. 바람직한 첨가물로서, 의약적으로 허용가능한 첨가제, 예컨대 용해보조제 (예를 들면, 유기용매), pH 조정제 (예를 들면, 산, 염기, 완충액), 안정제 (예를 들면, 아스코르브산), 부형제 (예를 들면, 말토오스), 등장화제 (예를 들면, 염화나트륨) 등을 배합하여도 된다.

본 발명의 화학식 Ⅰ 의 화합물은 PDT 용 광 증감제로서의 필요충분한 특성, 즉, 긴 인광 수명, 알부민에 대한 친화성, 특정 장기, 특히 암에 대한 특이적 집적성, 광에 노출되었을 때의 살세포효과(cell killing effect) (댄실메티오닌 테스트로 측정됨), 흡수파장, 수용성, 순도 등을 충분히 만족하는 것이다. 본 발명의 화합물은, 그 양호한 수용성에 의해 고농도 용액 (50 mg/㎖) 의 제조를 가능하게 하며, 또한, 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서도 더욱 높은 안정성을 나타낸다. 일반적으로, PDT 용 광 증감제로서 적용하기 위해서는 본 발명의 화합물을 1 mg 내지 5 mg/kg 체중의 양으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 화학식 Ⅰ 의 화합물은, 클로린 골격의 A 환에 히드록시이미노기를 갖고 그 골격의 프로피온산 측쇄에 아스파르트산 잔기를 갖는 점에 화학구조상의 특징을 가지며, 그 결과 여러가지 생리학적 또는 약리학적 특성을 발휘한다.

그 특성으로서, 암세포에 선택적으로 집적하고, 또한 암세포에서의 배설이 느린 것을 들 수 있다. 그러나, 정상의 장기나 세포에서는 빠르게 배설되므로, 그것들에 손상을 주지않고, 광독성의 발현을 회피할 수 있다.

또한, 포르피린을 클로린 유도체로 전환시킴으로써 흡수파장이 적외선 영역으로 이동하고, 이로써 심부의 암에 대해서도 치료효과를 발휘하는 것이 가능해진다. 따라서, 본 발명의 포르피린 유도체는 암, 악성종양, 안과 분야에 있어서 맥락막 신생혈관의 발생으로 생기는 노화성 황색반 변성증 및 망막 신생혈관의 발생으로 생기는 당뇨병성 망막증에 대한 PDT 용 광 증감제로서 매우 유용하다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1

포토프로토포르피린(photoprotoporphyrin) 디메틸에스테르 (P-Me (A,B 환 위치 이성체의 혼합물)) 의 합성

P.K.Dinello 등의 방법 [참조 : "The Porphyrins", Academic Press 발행, Vol. 1, 303 (1978)] 에 따라 표기 화합물을 합성한다. 즉, 프로토포르피린 디메틸에스테르 (PP-Me) 100 g 을 클로로포름 10 ℓ에 용해시키고, 광조사(光照射)하에서 일주일간 반응시킴으로써 포르피린의 클로린 유도체를 얻는다. 반응종료후, 반응액을 감압농축하고 잔류물로서 표제 화합물 (P-Me) 100 g 을 얻는다.

실시예 2

실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의한 A,B 환 위치 이성체 (P-Me (Ⅰ,Ⅱ)) 의 분리 및 정제

실시예 1 에서 수득된 P-Me (100 g) 를 실리카겔 크로마토그래피를 거쳐, 10 % 스텝와이즈법 (n-헥산/클로로포름) 으로 용출한다. 우선, 50 % 클로로포름 용액에서 미반응의 PP-Me 가 용출되고, 80 % 의 클로로포름 용액에서 P-Me (Ⅱ) (B 환 위치 이성체 ; 화학식 Ⅱ 의 화합물의 전구체) 가 용출되며, 이어서, 90 % 의 클로로포름 용액에서 본 발명의 화합물 (Ⅰ) 의 전구체인 P-Me (Ⅰ) (A 환 위치 이성체) 이 용출된다. 이들 용출액의 각각을 감압농축하여, PP-Me 23.3 g (23.3 %), P-Me (Ⅱ) 20.0 g (18.2 %) 및 P-Me (Ⅰ) 10.0 g (9.1 %) 을 각각 얻는다.

실시예 3

재결정법에 의한 A 환 위치 이성체 [P-Me (Ⅰ)] 와 B 환 위치 이성체 [P-Me (Ⅱ)] 의 분리·정제

실시예 1 에서 수득된 P-Me (100 g) 를 피리딘 1 ℓ에 용해시키고, 10 ℃ 에서 결정화하여 생성된 미반응의 PP-Me 20.6 g (20.6 %) 을 여과수집한다. 이어서, 여과액을 원래 부피의 2/3 으로 감압농축하고, -10 ℃ 에서 재결정화하여 생성된 미반응의 PP-Me 10.5 g (10.5 %) 을 회수한다. 이렇게 하여 수득된 여과액을 감압농축하고, 테트라히드로푸란에 용해시킨 후 n-핵산을 첨가하여 실온에서 재결정하여, P-Me (Ⅱ) 8.9 g (8.1 %) 을 여과채취한다. 그 후, 여과액을 감압농축하고, 테트라히드로푸란에서 재결정을 반복 실시함으로써, 본 발명의 화합물 (Ⅰ) 의 전구체인 P-Me (Ⅰ) 4.5 g (4.1 %) 을 얻는다.

MS : M⁺622

실시예 4

P-Me (Ⅰ) 과 P-Me (Ⅱ) 의 히드록시이미노화 및 가수분해

실시예 3 에서 수득된 P-Me (Ⅰ) 과 P-Me (Ⅱ) 의 각 10 g 을 따로따로 취하여 피리딘 190 ㎖ 에 각각 용해시킨다. 각 용액에 히드록실아민 염산염의 피리딘 용액 (2 g/200 ㎖) 을 첨가하여 실온교반하 1.5 시간 반응시킨다. 반응후, 반응액을 얼음속에 붓고 결정을 석출시켜 그것을 여과수집 건조한다. 이상의 조작으로 P-Me (Ⅰ) 로부터 본 발명 화합물 (Ⅰ) 의 전구체인 히드록시이미노-P-Me (NOH-P-Me (Ⅰ)) 10 g (98 %) 을 얻고, P-Me (Ⅱ) 로부터는 그 위치 이성체인 NOH-P-Me (Ⅱ) 10 g (98 %) 을 얻는다.

MS : M⁺637

상기에서 수득된 NOH-P-Me (Ⅰ) 과 NOH-P-Me (Ⅱ) 의 전량을 각각 따로따로 테트라히드로푸란 200 ㎖ 에 용해시킨다. 각 용액에 1 N 수산화나트륨액을 첨가하여 통상적인 방법에 따라 가수분해를 하고, 이어서, 20 % 의 시트르산 용액을 첨가하여 중화하고, 침전물을 석출시킨다. 석출한 침전물을 여과수집하여 건조한다. 이상의 조작으로 NOH-P-Me (Ⅰ) 로부터 본 발명 화합물 (Ⅰ) 의 전구체인 히드록시이미노-P (NOH-P (Ⅰ)) 9.1 g (95 %) 을 얻고, NOH-P-Me (Ⅱ) 로부터는 그 위치 이성체인 NOH-P (Ⅱ) 9.1 g (95 %) 을 얻는다.

MS : M⁺609

실시예 5

NOH-P (Ⅰ) 과 NOH-P (Ⅱ) 의 아스파르트산 유도체화

상기 실시예 4 에서 수득된 NOH-P (Ⅰ) 과 NOH-P (Ⅱ) 의 각 2 g 을 취하여 각각 디메틸포름아미드에 용해시키고, 디시클로헥실아민 (DCHA) 을 사용하여 통상적인 방법에 따라 DCHA 염 (각 2.0 g) 으로 전환시킨다. 각각의 DCHA 염을 각각 디메틸포름아미드 100 ㎖ 에 용해시키고, 아스파르트산 디메틸에스테르 (AspOMe) 염산염 2 g 을 첨가하며, 또한 수용성 카르보디이미드 (WSC) 2 g 을 교반하 서서히 첨가하여 10 시간 반응시킨다. 반응후 (TLC 로 반응종말점을 확인), 각 반응액에 물을 첨가하여 침전물을 석출시킨다. 각 침전물을 물로 세정하고 건조후, 아세톤-아세트산에틸로 재결정을 반복하여 행한다. 이상의 조작으로 NOH-P (Ⅰ) 로부터 본 발명 화합물 (Ⅰ) 의 메틸에스테르인 히드록시이미노에틸리덴클로리닐 디아스파르트산 메틸에스테르 (NOH-P-Asp(OMe) (Ⅰ)) 0.4 g (13.8 %) 을 암녹갈색 결정으로 얻고, NOH-P (Ⅱ) 로부터는 그 위치 이성체인 NOH-P-Asp(OMe) (Ⅱ) 0.5 g (17.2 %) 을 암녹갈색 결정으로 얻는다.

MS : M⁺895

실시예 6

NOH-P-Asp(OMe) (Ⅰ 과 Ⅱ) 의 가수분해 (Na 염의 제조)

실시예 5 에서 수득된 NOH-P-Asp(OMe) (Ⅰ) 과 NOH-P-Asp(OMe) (Ⅱ) 의 각 1 g 을 따로따로 취하여 각각에 에틸알코올 20 ㎖ 와 1 N 수산화나트륨액 30 ㎖ 를 서서히 첨가하고, 통상적인 방법에 따라 가수분해한다. 반응후 (TLC 로 반응종말점을 확인), 각 반응액에 에틸알코올을 첨가하여 침전물을 석출시킨다. 각 침전물을 여과수집하여 물에 용해시키고, 다시 에틸알코올을 첨가하여 침전물을 석출시킨 후, 침전물을 여과수집한다. 본 조작을 수회 반복하여 정제를 행한다. 이상의 조작으로 NOH-P-Asp(OMe) (Ⅰ) 로부터 본 발명 화합물 NOH-P-Asp (Ⅰ) 의 나트륨염 (0.9 g ; 87.4 %) 을 수득하고, NOH-P-Asp(OMe) (Ⅱ) 로부터는 그 위치 이성체인 NOH-P-Asp (Ⅱ) 의 나트륨염 (0.98 g ; 95.1 %) 을 얻는다.

MS : M⁺927

NOH-P-Asp (Ⅰ) 의 나트륨염의 적외선 흡수 스펙트럼을 도 1 로서 나타낸다.

실시예 7

NOH-P-Asp(OMe) (Ⅰ 과 Ⅱ) 의 가수분해 (유리산의 제조)

실시예 5 에서 수득한 NOH-P-Asp(OMe) (Ⅰ) 과 NOH-P-Asp (Ⅱ) 의 각 1 g 을 따로따로 취하여 실시예 6 과 동일한 조작으로 가수분해를 행한다. 각 반응액에 2 배량의 물을 첨가한 후, 5 % 의 시트르산액으로 중화하고, 침전물을 석출시킨다. 석출한 침전물을 여과수집하고 물로 세정후 건조한다.

이상의 조작으로, NOH-P-Asp(OMe) (Ⅰ) 로부터 본 발명의 화학식 Ⅰ 의 화합물인 NOH-P-Asp (Ⅰ) (0.8 g ; 85.0 %) 을 수득하고, NOH-P-Asp(OMe) (Ⅱ) 로부터는 그 위치 이성체인 화학식 Ⅱ 의 화합물인 NOH-P-Asp (Ⅱ) (0.9 g ; 95.4 %) 을 얻는다.

MS : M⁺839

실시예 8

적출기관에서의 레이저 조사 (장기 표면의 여기 형광스펙트럼(excited fluorescent spectrum))

결장암 Colon 26 을 이식한 지 2 주일 된 CDF₁마우스 (1 군당 5 마리) 에, 주사용 증류수에 용해시킨 화학식 Ⅰ 의 화합물과 화학식 Ⅱ 의 화합물의 각각의 나트륨염 (각 마우스당 10 mg/kg) 을 정맥주사한다. 주사후 3 시간, 6 시간 및 12 시간에 있어서, 혈액 샘플을 수집하고, 암을 포함하는 각 장기를 적출하여 N₂-펄스 레이저(N₂-pulsed laser) (N₂, 파장 337 nm, 2 ns) 를 조사하고, 여기 형광스펙트럼을 측정한다. 470 nm 에서의 NADH 의 피크파장을 기준으로 하여 600 내지 900 nm 에서의 파장을 검토한다 (N₂-PLS (N₂-pulsed laser spectrophotometry) 의 표면형광법에 의한 시험화합물의 생체내 분포의 측정). 즉, 470 nm 에서의 피크파장을 기준값 1 로 하여, 600 내지 900 nm 에서의 피크파장을 산출함으로써, 암/장기 (또는 혈청) 의 비를 구한다. 그 결과를 표 1 및 표 2 에 나타낸다.

표 1 은 화학식 Ⅰ 의 화합물의 나트륨염을 투여한 경우의 값을 나타내고, 표 2 는 화학식 Ⅱ 의 화합물의 나트륨염을 투여한 경우의 값을 나타낸다.

상기 표에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 화합물은, 그 위치 이성체에 비해 암 조직에 대한 집적성이 현저히 높은 것이 확인되었다.

실시예 9

HeLa 세포를 5 ×10³개/웰(well) 씩 96-웰 플레이트에 뿌리고, 100 ㎕ 의 배양액 중 37 ℃ 에서 하룻밤 배양한다. 각 웰에서, 배양액을 제거하고, 본 발명의 화합물 (Ⅰ) 의 나트륨염과 그 위치 이성체의 나트륨염을 각각 0, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 μM/㎖ 의 농도로 함유하는 약액 각 100 ㎕ 을 첨가하여 (각 농도군 에 대해 3 개의 웰), 37 ℃ 에서 6 시간 배양한다. 각 웰을 PBS (-) 에서 1 회 세정 후, 신선한 배지를 100 ㎕ 첨가한다. 다이오드 레이저 (672 nm) 를 사용하여 레이저 강도 0.44 W, 조사면적 0.785 ㎠ (직경 1 ㎝), 레이저 에너지 25 J/㎠ 의 조건에서 광조사를 행한다. 조사후, 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하고, 각 웰을 PBS (-) 에서 1 회 세정한 후, 신선한 배지를 100 ㎕ 첨가한다. MTS-PMS 시약을 20 ㎕ 씩 각 웰에 첨가하고, 37 ℃ 에서 2 내지 4 시간 배양한다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 492 nm 의 흡광도를 측정하고, 0 μM/㎖ 의 시험화합물의 웰에 대한 값을 100 % 로 하여 각 농도에서의 세포생존율을 산출한다.

그 결과를 표 3 에 나타낸다.

상기 표에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화학식 Ⅰ 의 화합물은, 그 위치 이성체에 비해 종양세포에 대한 살세포효과가 현저히 높은 것이 확인된다.

실시예 10

안맥락막 신생혈관의 폐쇄시험

본 발명의 화합물과 다이오드 레이저 (하마마쯔 포토닉스사 제조, 파장 672 nm) 를 사용하는 PDT 에 의한, 맥락막 신생혈관의 선택적 폐쇄를 위한 최적 파라미터 (화합물 투여후의 레이저 조사의 타이밍 및 광조사량) 를 탐색하기 위해, 다음의 실험을 행한다.

1. 방법

랫트 (체중 200 내지 300 g, 롱 에반스 랫트(Long Evance Rats)) 의 안저의 망막유두 부근에 아르곤·그린 레이저(Argon green laser) (조사직경 100 ㎛, 140 mW, 0.1 초) 를 조사하여 광응고가 일어나게 한다. 10 일간 경과후에 안저 사진 및 플루오레세인 형광조영에 의해 맥락막 신생혈관의 생성이 확인된 고체를 11 일째에 시험에 사용한다.

본 발명 화합물의 투여는 랫트 꼬리정맥에서 행하고, 투여량은 16 mg/kg 으로 한다. 투여후, 시간이 경과함에 따른 상기 화합물의 안구조직에 대한 분포를 형광현미경으로 확인한다.

레이저 조사는 상기 다이오드 레이저를 사용하여 행한다. 레이저는 망막표면에 대해 직경 500 ㎛ 의 범위에 미치는 것을 확인하였다. 조사시간은 4 분으로 하고, 이 때의 조사강도는 망막표면에 있어서 30.6, 91.7, 152.9 및 244.9 mW/㎠ 로 한다. 이 강도는 각각 7.4, 22.0, 36.7 및 58.8 J/㎠ 에 해당한다.

본 발명의 화합물을 사용한 PDT 의 평가는, 레이저 조사후 1 시간 및 24 시간에 있어서 안저 카메라 (제네시스 고와사 제조) 에 의한 안저 사진에 기초하여 행한다. 이 때, 신생혈관의 폐쇄와 주변조직의 손상을 플루오레세인 형광조영 및 조직학적 검사에 의해 확인하고, 치료효과의 선택성을 평가한다.

2. 결과

(1) 시간이 경과함에 따른 본 발명 화합물의 분포

1) 랫트 및 집토끼를 이용한 예비실험에서는 본 발명의 화합물은 정맥내 투여후의 혈중반감기가 30 분이며, 24 시간후에는 혈중에서 검출되지 않았다.

2) 본 발명 화합물의 투여후 5 분에서, 맥락막 신생혈관의 조직전체에 본 발명 화합물에 기인한 약한 형광이 확인되었다. 그러나, 신생혈관과 그밖의 주변조직 사이에는 형광강도에 명확한 차는 나타나지 않았다. 맥락막에 있어서는, 형광은 맥락막 모세혈관, 맥락막 동맥 및 정맥의 관강내에서 확인되었다. 또한, 맥락막 동맥벽에 본 발명 화합물에 의한 형광이 보여진다. 망막에서는 동맥벽에 뚜렷하게 밝은 형광이, 또한 모세혈관의 관강내에 약한 형광이 나타났다.

3) 투여후 30 분 내지 1 시간후에 신생혈관 전체에서의 형광강도는 증대하였다.

4) 투여후 2 시간이 되면, 맥락막 동맥벽에서는 뚜렷하게 밝은 형광이 보여지는데, 맥락막의 굵은 혈관의 관강 및 망막의 동맥벽에서의 형광은 약해진다. 또한, 맥락막 모세혈관에서의 형광은 소멸된다.

5) 투여후 4 시간에서, 맥락막의 동맥벽 및 망막의 혈관벽에서는 형광이 점점 약해져 가는데, 맥락막 신생혈관에서는 형광은 유지된다.

6) 24 시간후에는, 맥락막 신생혈관 및 그 밖의 혈관의 형광은 전부 소멸한다.

(2) 레이저 조사에 의한 효과

레이저 조사 24 시간 후에 조직학적 검사에 의해 관찰한 결과를 하기 표 4 에 나타낸다.

상기 표에서 명백하듯이, 맥락막 신생혈관, 맥락막 모세혈관, 망막 모세혈관 및 맥락막의 동·정맥의 폐쇄의 정도는 레이저 조사량과 본 발명 화합물의 투여에서 조사까지의 시간에 의존한다. 즉, 상기 화합물을 투여하고 바로 7.4 J/㎠ 의 레이저 조사를 행한 경우, 및 투여후 2 내지 4 시간 경과한 후에 22.0 J/㎠ 의 레이저 조사를 행한 경우에, 망막 모세혈관이나 맥락막의 동·정맥 혈관에 대한 심한 손상을 부여하지 않고, 맥락막 신생혈관 및 맥락막 모세혈관의 선택적인 폐쇄를 얻을 수 있다.

본 발명이 제공하는 이미노클로린아스파르트산 유도체는 암세포에 대한 집적성, 외부 에너지에 대한 반응성 및 암세포의 파괴작용을 가지며, 게다가 생체내 대사가 빠르기 때문에, 정상세포에 대해 독성을 발현하지 않는 점에서, 암이나 안과에 있어서의 신생혈관의 진단 또는 치료약으로서 매우 유용하다.

Claims

하기 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 이미노클로린아스파르트산 유도체 및 그의 약리학적으로 허용되는 염 :

[화학식 Ⅰ]

(식 중, Asp 는 아스파르트산 잔기를 나타낸다.).
제 1 항에 기재된 화학식 Ⅰ 로 나타내어지는 이미노클로린아스파르트산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 진단용 또는 치료용 광 증감제.
제 2 항에 있어서, 암의 진단 또는 치료에 사용되는 광 증감제.
제 2 항에 있어서, 안과영역에 있어서의 신생혈관의 진단 또는 치료에 사용되는 광 증감제.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 동물의 진단 혹은 치료에 사용되는 광 증감제.