AT400520B

AT400520B - Protoporphyrinogeninhibitoren und deren verwendung in zusammensetzungen zur erkennung und behandlung von tumoren

Info

Publication number: AT400520B
Application number: AT0903489A
Authority: AT
Inventors: Blaik Phillip Halling; Debra Ann Witkowski
Original assignee: Fmc Corp
Priority date: 1988-12-12
Filing date: 1989-12-08
Publication date: 1996-01-25
Also published as: GR890100817A; NZ231658A; BR8907817A; WO1990006748A2; GB9110472D0; GB2247404A; AR243605A1; HUT58202A; IE893925L; SE505938C2; DE3991484T; SE9101807D0; OA09362A; DK110791A; FI912784A0; IL92622A; ES2051675T1; ES2051675T3; MC2171A1; EP0447491A1

Description

AT 400 520 B

Diese Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung in der photodynamischen Behandlung von Säugetier-Tumorzellen, wie in der photodynamischen Behandlung von Krebs.

Es ist mittlerweile wohlbekannt, Saugetier-Tumorzellen mit Hämatoporphyrinderivaten oder einer Mischung von Porphyrinen, die sich davon abieiten, zu versorgen und dann diese Zellen Licht geeigneter Wellenlänge auszusetzen, um eine Zellzerstörung zu bewirken. Eine solche photodynamische Therapie ist Gegenstand einer Reihe von Artikeln, die eine spezielle Ausgabe von Photochemistry and Photobiology, Vol. 46, Nr. 5, November 1987, (im folgenden "P&P 46-5") bilden. Wie in diesen Artikeln gezeigt, wurde eine solche photodynamische Therapie zur Behandlung einer großen Vielzahl von Krebsarten verwendet (einschließlich Krebs der Bronchialröhren, der Blase, des Ösophagus, der Lunge, der Haut, des Kopfes und Halses, des Gehirns und Darmund Intraokular- und gynäkologischer Krebsarten). Es wurde festgestellt, daS die biochemischen Wirkungen einer solchen Porphyrin-Photosensibilisierung das Vernetzen von Membranproteinen, die Peroxidation von Lipiden, die Hemmung des Transports einiger wesentlicher Metaboliten, die Lyse von lysosomalen und Mitochondrien-Membranen, die Inaktivierung verschiedener Enzyme und eine vermehrte Zellaufnahme von Porphyrinen bewirken (P&P 46-5, S. 695). Das Porphyrinmaterial wird im allgemeinen injiziert, (z.B. intravenös oder intraperitoneal), wobei eine typische Dosis etwa 2 mg Porphyrinmischung ll/kg Körpermasse ist.

Das Porphyrinmaterial kann auch in ein Liposom eingebracht werden und injiziert werden (z.B. intraperitoneal) wie z.B. bei Spikes et. al "Photodyamic Behavior of Porphyrins in Model Cell, Tissue and Tumor Systems"; in Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases (herausgegeben von G. Jori und C.A. Perria); S. 45-53; Libreria Progetto, Padua, (1985) und den darin zitierten Referenzen offenbart ist.

Die technische Literatur zeigt, daß die Einführung von Protoporphyrin in Zellen wie menschliche Erythrozyten (Dubbelman et al., Biochemica et Biophysica Acta, 511 (1978) 141-151) oder Mäuseleukämiezellen (Kessel, Cancer Research 42, 1703-1706, Mai 1982) einen deutlichen photosensibilisierenden Effekt hat. Der Kessel-Artikel gibt an, daß es das stärkste photosensibiiisierende Mittel· von den getesteten ist. Jedoch fanden Kessel und andere (z.B. Berenbaum et al., Br.J.Cancer (1982) 45, 571-581), wenn sie Protoporphyrin in Tiere injizierten, kein nachweisbares Protoporphyrin in den Tumoren, was anzeigt, daß als solches in den Körper eingeführtes Protoporphyrin leicht im Kreislauf verlorengeht.

Es ist auch wohlbekannt, Hämatoporphyrinderivate und ähnliche Materialien für den Nachweis und die Lokalisierung von Tumoren, wie Krebs der Blase oder der Lungen, anzuwenden (P&P 46-5, S. 759 z.B.).

In einer Hinsicht der Erfindung ist das Mittel zur Behandlung der Zellen in einer solchen photodynamischen Behandlung oder für die bekannten Methoden zum Nachweis und zur Lokalisierung von Tumoren nicht ein Porphyrin oder nicht ein Porphyrin allein. Stattdessen umfaßt es einen Enzymhemmstoff, der die enzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Häm in diesen Zellen hemmt, wodurch eine Anreicherung endogenen Protoporphyrins IX in diesen Zellen bewirkt wird. Es wurde festgestellt, daß Mittel wie bestimmte Arten von Herbizidverbindungen, die die enzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen. zu Chlorophyll in Pflanzenzellen hemmem, auch die enzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Häm in Säugetiersellen hemmen. Es wird angenommen, daß die Hemmung durch diese Mittel wahrscheinlich den Schritt der Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch ein Enzym (Proto-porphyrinogen-Oxidase E.C. 1.3.3.4) beeinflußt, sodaß das Protoporphyrinogen nicht dem normalen enzymatischen Abbauweg zu Protoporphyrin IX folgen kann, sondern stattdessen in der Zelle oxidiert wird (z.B. im Plasma), aber außerhalb des normalen enzymatischen Stoffwechselwegs (z.B. außerhalb der Organelien-Membran) und daß das Ergebnis eine Akkumulation von Protoporphyrin IX an Stellen ist, wo es unerreichbar für die normale Umwandlung zu Häm ist, mit dem Ergebnis, daß dieses akkumulierte Protoporphyrin IX, wenn die Zellen Licht ausgesetzt werden, eine zelizerstörende Wirkung hat, wie die, die'bei der oben beschriebenen photodynamischen Behandlung gezeigt wird.

Die weiter unten durch zahlreiche Beispiele belegten Enzymhemmstoffe dieser Erfindung sind spezifische Inhibitoren der Protoporphyrinogen-Oxidase in dem Sinn, daß sie nicht als allgemeines Enzymgift wirken, wie denaturierende oder vernetzende Mittel (z.B. Sulfhydryl-Reagenzien), vorzugsweise sind es nicht Materialien, die die Oxidationsbedingungen wie Elektronenakzeptoren beeinflußen; daher haben die bevorzugten Mittel dieser Erfindung Redoxpotentiale, die negativer als etwa -500 mV sind, wie z.B. negativer als -800 mV (gemessen z.B. in üblicher Weise in einem aprotischen Lösungsmittel für das Mittel wie durch zyklische Voltametrie oder polarographisch). Es ist auch bevorzugt, daß das Mittel nicht ein Tetrapyrrol ist und daß sein bo für Protoporphyrinogen Oxidase nicht nur geringer als etwa 1uM sondern geringer als etwa 0,3 U.M ist, z.B. ein bo von etwa 0,1 oder 0,03 oder 0,01 u.M oder weniger.

Der Enzymhemmstoff ist vorzugsweise einer, der eine hohe Kapazität für das Aufbrechen des Plasmalemmas von Pflanzenmaterial hat. Ein Test für diese Kapazität ist das Efflux-Experiment, das in dem Artikel von Halling und Peters in Plant Physiology, 84, 1114-5 (1987) beschrieben wird. In einem solchen 2

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Test (im einzelnen in Appendix A unten beschrieben) zeigen die bevorzugten Mittel einen Gesamtefflux von mindestens 50 % bei einer Behandlungsrate von 100 uM, vorzugsweise einer Behandlungsrate von 1U.M oder weniger wie 100 nM; hochaktive Materialien wie 1-(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloryphenyl)-3-methyl-4-difluormethyl-A2-1,2,4-triazolin-5-on oder Lactophen (unten beschrieben) ergeben Gesamtefflux-Prozentwer-te von mehr als 90 % bei 100 nM Konzentration.

Ein weiterer Test der Kapazität eines Materials zum Aufbrechen des Plasmalemmas von Pflanzenmäte-rial ist der lichtinduzierte Ergrünungshemmungstest, der genauer in Appendix B unten beschrieben ist. Dieser Test mißt die Kapazität, das im Licht Ergrünen von im dunkeln gebleichter Chlamydomonas Reinhardi Mutante y-1 zu hemmen (einer Algenart, die, wenn sie im dunkeln wächst, kein Chlorophyll bildet, so daß die Algenmasse wegen der Gegenwart neuer nicht grüner Zellen bleicht und die Chlorophyll wieder produziert, wenn sie Licht ausgesetzt wird) zu hemmen. Viele der bevorzugten Verbindungen (Mittel), die erfindungsgemäß verwendet werden, haben die Fähigkeit, das im Licht Ergrünen um mindestens 50 % zu hemmen, wenn die Verbindung mit einer Konzentration von 10-5 M, bevorzugter einer Konzentration von 10-6 M oder weniger, z.B. 10-7 M verwendet wird. Zusätzlich sollte die Verbindung eine sein, die, wenn sie bei dieser Konzentration im Lichtergrünungshemmungstest verwendet wird, einen Überstand ergibt, der einen Lichtabsorptionspeak bei 405 nm zeigt, der höher ist als der Chlorophyllpeak (der Peak bei 668 nm in diesem System), z.B. zeigt der Überstand einen 405 nm Peak, dessen Höhe 2, 3 oder 4 mal höher ist, als die Höhe des 668 nm Peaks.

Unter den Enzymhemmstoffen, die bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden können, sind Herbizidverbindungen der folgenden Klassen (A - D): A Heterocyclische Arylherbizide der allgemeinen Formel

Ph-NHet, worin "Ph" ein substituierter Phenylrest, vorzugsweise 2,4-disubstituierter Phenylrest, bevorzugter ein 2,4,5-trisubstituierter Phenylrest ist und NHet ein 5- oder 6-gliedriger heterocyclischer Ring mit ein bis vier Ringstickstoffatomen und mit der Formel -N—0=0 oder -N-c-OH oder -N-C-Cl

Q

Q— C -R

Q —C —R ist, worin Q den Ausgleich des heterocyclischen Rings darstellt und R Wasserstoff oder eine Substituentengruppe ist. Diese Klasse von Verbindungen schließt solche Materialien ein, wie die, die als "die cyclische Imidklasse der Herbizide" in einem Artikel von Wakabayashi et al., J.Pesticide Sei., 11, 635-460 (1986) bezeichnet ist, die folgende Verbindungen in Figur 1 zeigt:

Verbindung I ist ein Aryloxadiazolherbizid, nämlich 2-tert.-Butyl-4-(2,4-dichlor-5-isopropoxyphenyl)-Δ2-1,3,4-oxadiazolin-5-on. Andere 2-Alkyl-4-(2,4,5-trisubstierte phenyl)-A2-1,3,4-oxadiazolin-5-one, 3

AT 400 520 B die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind z.B. in den US- 3 385 862A, US 3 836 539A und US 3 876 413A geoffenbart.

Die Verbindung II ist ein Aryltetrahydroindazol-Herbizid, nämlich 3-Chlor-2-(4-chlor-2-fluor-5-iso-propoxy-phenyl)-4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazol. Andere 3-substituierte 2-(2,4,5-trisubstierte Phenyl)-tetrahydroindazoie, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind z.B. in der US 4 670 043A geoffenbart.

Die Verbindungen III, IV und V sind Aryltetrahydrophthalimid-Herbizide. Andere Aryltetrahydropht-haiimide, die bei der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, sind z.B. in den US-4 431 822A; 4 670 046A; 4 670 042A und 4 439 229A und der WO 87/07602A offenbart. Die letzteren zwei Literaturstellen offenbaren auch andere NHet-Ringe, die verwendet werden können, wie die Ringe, die z.B in Spalte 4, Zeile 25 bis Spalte 5, Zeile 20 von US- 4 439 229A und auf den Seiten 12-14 von WO 87/07602A dargestellt sind.

Andere geeignete Herbizide des PhNHet-Typs sind : Aryitriazolinone wie die, die in den US- 4 318 731A; 4 398 943A; 4 404 019A; 4 702 945A; 4 705 557A; 4 702 763A; 4 761 174A und den WO 85/01637A; WO 85/04307A; WO 87/00730A; WO 87/03782A; WO 86/04481A und WO 88/01133A; Aryltetrazolinone wie die, die in den US- 4 734 124A und den WO 85/01939A und WO 87/03873A geoffenbart sind; Aryltriazindione, wie die, die in den US- 4 755 217A und 4 766 233A, der WO 86/00072A geoffenbart sind; Arylhydantoine wie die, die in US- 4 427 438A geoffenbart sind; Arylurazole, wie die, die in US- 4 452 981A geoffenbart sind und Arylhexahydropyridazine, wie die, die in US- 4 619 687A geoffenbart sind. B. Heterocyclische Arylurethane, wie die, die in US- 4 521 242A geoffenbart sind. C. Phenylether-Herbizide, wie die, die eine p-Halogenyl- oder p-Nitrophenoxyphenylstruktur haben, wie die folgenden im Handel erhältlichen Materialien: 4

AT 400 520 B 5-(2-Chlor-4-(trifluormethyl) Methyl-5-(2,4-dichlorphenoxy) - phenoxy)^2-nitro-N-methansul- 2-nitrobenzoat (Bifenox) fonylbenzamid (Fomesafen)

σ

Natrium-5-(2-chlor-4-(trifluormethyl) phenoxy) -2-nitrobenzoat (Acifluorfen) 2-Chlor-l-(3-ethoxy-4-nitro-phenoxy)-4-trifluormethylbenzol (Oxyfluorfen)

Andere geeignete im Handel erhältliche Diphenyl-Herbizide sind

Lactophen: 1-(Carboethoxy)-ethyl-5-(2-chlor-4-trifluormethylphenoxy)-2-nitrobenzoat,

Fluoroglycofen: (Carboethoxy)-methyl-5-(2-chlor-4-trifluormethylphenoxy)-2-nitrobenzoat, Fromesofen: 5-(2-Chlor-4-(trifluormethyl)phenoxy)-N-methylsulfonyl-2-nitrobenzamid,

Chloronitrofen: 2,4,6-Trichlor-(4-nitrophenoxy)-benzol,

Fluorodifen: 2-Nitrol-1-(4-nitrophenoxy)-4-trifluormethylbenzol,

Nitrofen: 2,4-Dichlor-1-(4-nitrophenoxy)-benzol,

Chlomethoxifen: 4-(2,4-Dichlorphenoxy)-2-methoxy-1-nitrobenzol,

Ein weiteres geeignetes Diphenylether-Herbizid ist Methyl-5-(2-chlor-4-trifluormethylphenoxy)-2-nitroacetophenonoxim-O-acetat. D. Arylpyrazol-Herbizide, wie die in den US- 4 563 210A; 4 496 390A und 4 459 15QA und der DE 3 520 327 A1 geoffenbarten. E. Verbindungen der Formel 5

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10 worin Xb 0 oder S ist und "Ph" die oben beschriebene Bedeutung hat, wie Verbindungen, die in der EP 273 417A oder dem Derwent Abstract Nr. 87-040749 geoffenbart sind.

Die Behandlung mit den Mitteln der Erfindung kann durch intravenöse oder intraperitoneale Injektion bewirkt werden. Das Mittel kann als sterile Zusammensetzung verwendet werden, die das Mittel in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, z.B. einer wässrigen isotonischen Lösung wie wässriger Kochsalzlö-75 sung (z.B. 0,9 % NaCI) oder Dulbeccö’s phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit einer Konzentration von z.B. 2,5 mg ml-1 gelöst oder dispergiert enthält oder das Mittel in einem Liposomensystem enthält, wie einem, das mit einem Phospholipidvesikel in einer auf den Seiten 1659-1660 von Remington's Pharmaceuti-cal Sciences 1985 (l7.Ausgabe) veröffentlicht von Mack Publishing Company, beschriebenen Art, hergestellt wurde. Zum Beispiel können analog zu der bei Jori et al., Br. J. Cancer (1983), 48 auf Seite 307 20 beschriebenen Formulierung 51,4 mg Dipalmitoyldiphosphatidyl-cholin in 10 ml einer 1 mM Lösung des Mittels in Chloroform-Methanol (9:1, V/V) gelöst werden und nach sorgfältigem Mischen kann das Lösungsmittel unter Vakuum bei 30 °C entfernt werden, was einen Feststoff ergibt, der in 10 ml eines 0,01 M Phosphatpuffers, pH 7,4 enthaltend 150 mM NaCI resuspendiert werden kann und die trübe Lösung dann bei 50 * C 30 Minuten beschallt werden. 25 Die Enzymhemmstoffe, die bei der Durchführung der Erfindung angewendet werden, können an geeignete tumorspezifisehe monoklonale Antikörper (Mab’s) konjugiert oder gebunden sein unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Bindungstechnologie als Mittel, um den Enzymhemmstoff zu der speziellen Tumorstelle hinzusteuern.

Die Enzymhemmstoffe, die gemäß Erfindung verwendet werden, können auch durch einfache orale· . 30 Einnahme, vorzugsweise in verdünnter Form zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verwendet werden, z.B. indem sie der Nahrung beigegeben werden, wie in Beispiel 6, unten dargestellt.

Es kann wünschenswert sein, insbesondere für die orale Verabreichung, Enzymhemmstoffe zu verwenden, die wasserlösliche Salze sind oder die sauer sind und wasserlösliche Natrium- oder Kaliumsalze bilden, wie ein saures Sulfonamid der Art, wie sie in WO 87/03782A (z.B. Mittel 6c in Beispiel 6 unten) oder 35 WO 85/001939A und WO 87/037873A offenbart sind oder ein wasserlösliches Salz davon oder eine Carbonsäure oder ein wasserlösliches Salz davon, wie das als Acifluorfen bekannte Natriumsalz zu verwenden.

Die Enzymhemmstoffe, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, können in übliche pharmazeutische Formulierungen wie Tabletten (wie z.B. komprimierte Tabletten, die beschichtet sein 40 können, z.B. mit Zuckerpaste und/oder Syrup), Zäpfchen, Kapseln (z.B. Hartgelatinekapseln), Suspensionen, Lösungen, Pulver oder Ampullen eingebracht werden. In solchen Formulierungen kann das Mittel in Mischung mit einem pharmakologisch annehmbaren festen und/oder flüssigen Träger vorhanden sein, der, wenn gewünscht, ein Nahrungsmittel sein kann; z.B. kann er ein Feststoff sein wie Maisstärke oder ein flüssiges Verdünnungsmittel wie Wasser oder ein eßbares Öl oder Mineralöl oder ein Lösungsmittel z.B. 45 Dimethylsulfoxid. Mischungen der Enzymhemmstoffe können verwendet werden, z.B. eine Mischung von. Mittel 6c von Beispiel 6 unten und Acifluorfen, z.B. in annähernd gleichen Anteilen.

Die Dosierung, die angewendet wird, kann durch Routineversuche, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, bestimmt werden, z.B. Versuche der Art, wie sie für Photofrin II in dem Artikel von Dougherty in "Photodynamic Therapy (PDT) of Malignant Tumors" in CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, Vol. so 2, Issue 2, (1984), S. 83-116 beschrieben sind.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1 55 HeLa-Zellen (eine menschliche Tumorzelllinie, die allgemein in der Tumorforschung angewendet wird und von der American Type Culture Collection erhalten wurde), die in der logarithmischen Wachstumsphase waren (die bei 37 ’C 5 Tage in 1 I-Falcon-Gewebekulturkolben kultiviert worden waren) wurden mit phosphatgepufferter Kochsalslosung (PBS) gewaschen. Eine 0,25% ige Lösung von Trypsin in PBS (2 ml) 6

AT 400 520 B wurde zugegeben und nach mehreren Minuten wurden die Zellen vorsichtig aus dem Kolben entfernt und in 110 ml einer 25 mM Lösung von Hepes in Minima Essential Medium (MEM), das mit 10 % V/V inaktiviertem Kälberserum, 1,1 ml einer 200 mM Lösung von Glutamin in 0,85 % Kochsalzlösung und 11.000 Einheiten Penicillin/11.000 mcg Streptomycin angereichert war, eingebracht.

Dann wurden 5,0 ml Aliquots der entstehenden resuspendierten Zellkultur jeweils in einen 50 ml Falcon Gewebekulturkolben gebracht und (mit Ausnahme der Kontrolle) mit dem Behandlungsmittel gemischt. Die Aliquots wurden dann in der Dunkelheit bei 37 °C drei Tage inkubiert. Die Zellen wurden dann entfernt und unter grünem Licht in der folgenden Weise extrahiert: Die Zellen wurden vom Boden des Kolbens durch Zugabe von 0,8 ml einer 0,25 %igen Lösung von Trypsin in PBS entfernt. Nach einer Stunde Inkubation im dunkeln wurden Zellen und Medium aus den Kolben entfernt, in Rundzentrifugenröhrchen gebracht und dann zwei Zyklen Einfrier-Auftau-Bedingungen unterworfen, um die Zellen aüfzubrechen und die Extraktion zu ermöglichen.

Die Untersuchung der Zellsuspensionen nach diesem Aufbrechsystem zeigte keine intakten Zeilen mehr. 10 ml basisches Aceton (90 % Aceton: 10 % 0,1 N NHL OH) wurden dann zu jedem Röhrchen zugegeben und die Röhrchen wurden zentrifugiert, um Protein und Zellbruchstücke zu entfernen. 5 ml Wasser wurden zü dem überstand zugegeben, anschließend 0,5 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von NaCI. Der pH wurde dann auf 6,8 eingestellt durch tropfenweise Zugabe von 2 Μ KH2PO4.. Der wässrige Acetonextrakt wurde dann auf eine C8-Baker-Prep-Säule geladen. Die Säulen wurden getrocknet und dann mit 2 ml Wasser gewaschen. Die Tetrapyrrole wurden mit 2 x 1,5 ml Volumen von 90/10 CH30H/H20 eluiert. Die Extrakte wurden dann in einem Spektrofluorometer quantitativ bestimmt.

Die Behandlungsmittel, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, waren: A. 5-Amino-laevulinsäure, die als Vorläufer von Tetrapyrrolen bekannt ist B. Acifluorfen-methyl mit der Formel:

C. ein Herbizid der Formel: D. ein Herbizid der Formel:

7

AT 400 520 B E. ein Herbizid der Formel: 5

CI

O

Das Mittel A wurde als filtersterilisierte 250. mM Lösung in Wasser, pH 6,5 angewendet. Die Mittel B, C, D io und E wurden als 50 mM Lösungen in Aceton geliefert.

Aceton wurde auch zu der Kontrolle zugegeben, um eine Konzentration von 0,2 % V/V darin zu liefern. Die zu den Zellkulturen zugegebenen Mengen der Mittel waren so, daß sich die in Tabelle 1 unten angegebenen Konzentrationen ergaben. Die Mengen des Tetrapyrrols Protoporphyrin IX ("Proto IX"), die produziert wurden, sind in dieser Tabelle gezeigt. 15

Tabelle 1

Tetrapyrrol-Akkumulierung in behandelten HeLa-Zellen Mittel Konzentration des Mittels (uM) Fluoreszenzemission cps(400/630) Menge an Proto IX (pMol) A 5000 41842 4.2 B 100 12921 1.3 C 100 33477 3.5 D 100 10551 1.1 E 100 8967 0.9 Kontrolle 2795 0.3 30

Beispiel 2

HeLa-Zellen in der logarithmiSchen Wachstumsphase, die sechs Tage in 6 1 I Falcon Gewebekulturkolben bei 37 “C gezogen worden waren, wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. 35 Eine 0,25 %ige Lösung von Trypsin in PBS wurde zugegeben und nach mehreren Minuten wurden die Zellen sanft entfernt und in 110 ml einer 25 mM Lösung von Hepes in Minimum Essential Medium (MEM), das mit 10 % V/V inaktiviertem Kälberserum, 1,1 ml einer 200 mM Lösung von Glutamin in 0,85 % Kochsalzlösung und 11.000 Einheiten Penicillin/11.000 mcg Streptomycin angereichert war, gebracht.

Aliquots (jeweils 5,0 ml) der resuspendierten Zellkultur wurden in 50 ml Falcon Gewebekulturkolben 40 gebracht, mit oder ohne Herbizid und im dunkeln 4 Tage bei 37 *C inkubiert, wobei das Herbizid in verdünnter Acetonlösung wie in Beispiel 1 zugegeben wurde. Aceton wurde auch zu den Kontrollen zugegeben, was eine Konzentration an Aceton von 0,2 % V/V darin lieferte. Die Menge an Herbizid war so, daß die in Tabelle 2 unten angegebenen Konzentrationen erreicht wurden.

Die Behandlungsmittei waren: 45 B. wie in Beispiel 1 C. wie in Beispiel 1 F. ein Herbizid der Formel: 50

CI Q 55 O /\pu 0¾ CH3 ^3 8

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Extraktion:

Die Medien aus jedem der Kolben wurden in Glasrundbodenröhrchen gebracht, während die Zellen, die an den Böden der Kolben hafteten, durch Zugabe von 0,5 ml einer 0,25 %igen Lösung von Trypsin in PBS gelockert wurden und nach mehreren Minuten bei 37 °C dann aus den Kolben gewaschen und mit ihren Medien wiedervereinigt wurden. Aliquots von 100 ul wurden dann aus jeder Zellsuspension entfernt, um die Zeildichte zu bestimmen. Die verbleibenden 5,4 mi Zellsuspension wurden dann 30 Minuten beschallt, um die Zellen zu aufzubrechen. 10 ml basisches Aceton (90 % Aceton: 10% 0,1 N NH4.OH) wurden dann zu jedem Röhrchen Zugegeben und die Röhrchen wurden zentrifugiert, um Protein und Zellbruchstücke zu entfernen. 5 ml Wasser wurden zu dem Überstand zugegeben, anschließend 0,5 ml einer gesättigten, wässrigen Lösung von NaCI. Der pH wurde dann auf 6,8 eingestellt durch tropfenweise Zugabe von 2 Μ KH2PO4. Der wässrige Acetonextrakt wurde dann auf C8-Baker-Prep-Säulen geladen. Die Säulen wurden getrocknet und dann mit 2 ml Wasser gewaschen. Die Tetrapyrrole wurden mit 3 ml 90/10 CH3OH/H2O eluiert. Wie in Beispiel 1 wurden alle diese Extraktionsverfahren im wesentlichen vollständig unter Protoporphyrin IX nicht anregendem Licht (z.B. Grünlicht) oder im dunkeln (z.B. in lichtundurchlässig beschichteten Behältern) durchgeführt. Die Fluoreszenz der Extrakte wurde dann bestimmt an einem SPEX-Spektralfluorometer. Die Protoporphyrin IX-("Proto IX”)-AkkumuIation wurde quantitativ bestimmt unter Verwendung vorbestimmter Extinktionskoeffizienten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten angegeben.

Tabelle 2

Durchschnittliche Wachstumshemmung und Proto IX-Akkumulation Mittel Konzentration des Mittels (uM) % Wachstumshemmung Menge an Proto IX (pMol) rel. % Proto IX B 100 99 5.20 2364 F 100 106 2.71 1232 C 100 52 4.41 2005 C 10 -15* 0.57 259 c 1 -26* 0.19 86 ' negative Werte für "Wachstumshemmung'' zeigen an, daß Wachstum auftrat, "durchschnittliche Menge pro 106 Zellen *** % Kontrolle

Beispiel 3

Bestimmung von I50

Protoporphyrinogen IX ("Protogen IX")

Proto IX wurde von Porphyrin Products, Logan UT. erworben und wie bei T.P. Fuesler et al., Plant Physiol., 67, 246-249 (1981) ausgeführt, gereinigt. Protogen IX wurde frisch hergestellt durch Reduktion von Proto IX mit Na/Hg-Amalgam, wie bei N.J. Jacobs und J.M. Jacobs, Enzyme, 28, 206-219 (1982) beschrieben, unter Verwendung des gereinigten Proto IX bei einer Konzentration von 300 uM.

Pflanzenmaterial

Gurke (Cucumis sativus L, cultivar 'Wisconsin SMR 18') wurde in einer dunklen Wachstumskammer gezogen auf Vermiculit, der mit einem handelsüblichen (9-45-15) Dünger berieselt worden war. Die Keimlinge wurden bei 25'C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 80-90 % gezogen. Zwischenzeitliche Belichtung, 1 Minute Licht pro 60-Minuten-Zyklus mit einer gemessenen Intensität von 25 u.E/m-2sec-1 (PAR) wurde durch eine General Electric "Bright Stick"- Vorrichtung, die durch eine elektronische Zeitschaltuhr kontrolliert wurde, geliefert. Dies lieferte Gewebe, das zu einer schnellen Chlorophyllsynthese fähig war, wobei die Stärkereserven und Anfangschlorophyllgehalte minimal waren.

Chloroplast-Isolierung

Sich entwickelnde Chloropiasten wurden isoliert, wie von T.P. Fuesler et al., Plant Physiol., 75, 662-664 (1984) beschrieben, mit der Ausnahme, daß im Endreinigungsschritt die Plastide durch ein 40 % statt 45 % (V/V) Percoll Kissen zentrifugiert wurden. Die Chloroplasten wurden in einem Testpuffer, der 0,5 M Mannit, 9

AT 400 520 B 20 mM TES, 10 mM Hepes, pH 7,7, 1 mM EDTA, 1mM MgCk, 1 % (G/V) Rinderserumalbumin und 1 mM Dithioerythritoi enthielt, auf eine Endkonzentration von 2 mg Protein pro ml resuspendiert.

Test auf Protoporphyrinogen-Oxidase (E.C. 1.3.3.4) Tests wurden durchgeführt, wie von J.M. Jacobs und N.J. Jacobs, Arch. Biochem. Biophys. 229, 312-319 (1984) ausgeführt. Proben (0,2 ml) der Chioropla-5 stensuspension wurden 15 Minuten im dunkeln vorinkubiert mit verschiedenen Konzentrationen von Aciflu-orfenmethyl ("AFM") oder mit 0,2 % (VA/) Aceton (als "Kontrolle”). Dann wurden 50 ul frisch hergestelltes Protogen (etwa 15 nM) zu der Suspension zugegeben, um die Reaktion zu initiieren. Die Tests wurden durch die Zugabe von 2,75 ml des fluorimetrischen Mediums von N.J. Jacobs und J.M. Jacobs, Enzyme, 28, 206-219 (1982) beendet, das aus 1 % (V/V) Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), 50 mM Tris το HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA bestand; 1 mM Dithioerythritoi ersetzte 5 mM Glutathion. Die Suspensionen wurden dann direkt an einem SPEX-Fluorolog-2-Spektralfluorometer, das mit einem Frontfluoreszenzzusatz für trübe biologische Proben ausgestattet war, abgelesen. Die Menge an produziertem Proto IX wurde aus einer Standardkurve quantitativ bestimmt (Menge an Proto IX gegen Emission bei 630 nm, bei Anregung mit 400 nm), die mit gereinigtem Proto IX in fluorometrischem Medium erstellt wurde.

75 Um die Menge der nichtenzymatischen Oxidation zu Proto IX im obigen Test zu bestimmen, wurde derselbe Test durchgeführt mit der Ausnahme, daß statt der Suspension aktiver Chloroplasten eine Suspension verwendet wurde, in der die Chloroplasten durch 15-minütige Erhitzung auf 85'C inaktiviert worden waren. Das Subtrahieren der Menge an so produziertem Proto IX von der Menge, die in Gegenwart der aktiven Chloroplasten produziert wurde, ergab die Menge an enzymatisch gebildetem Proto IX. Die 20 Ergebnisse sind graphisch in Figur 1 gezeigt (worin LSD die geringstwertige Differenz angibt, wie es üblich ist). Figur 1 zeigt, daß der Iso-Wert (die Konzentration, die 50 % Hemmung liefert) geringer ist, als 0,1 U.M, d.h. etwa 0,03 UM

Tests der Wirkung von 10 U.M AFM auf die enzymatische Umwandlung von Proto IX zu Magnesium-Proto IX in der Chloroplastensuspension (in Gegenwart von ATP) zeigten, daß AFM keine Hemmwirkung auf 25 die Umwandlung hatte.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wurden die Enzymhemmstoffe dem Futter für tumortragende Mäuse beigegeben; 30 bei einigen der Mäuse, die als Kontrolle verwendet wurden, wurde dem Futter kein Mittel zugegeben. Die Mäuse werden dann getötet und ihre Nieren, Darm, Nebennieren, Leber und Tumor wurden entfernt und auf ihren Gehalt an Proto IX analysiert. Die folgenden Enzymhemmstoffe wurden angewendet: 35 40 45 50 10 55

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Im einzelnen waren die Mäuse DBA/2 Ha-Mäuse, denen SMT-F-subkutane Tumoren am Tag 0 in die rechte Schulter injiziert worden waren. Die Mäuse, die einzeln untergebracht waren, erhielten unbehandeltes Purina 55 Nagetierfutter 5001-{Purina Rodent Chow 5001 )-Brei am Tag 1, danach vom Tag 2 bis 10 erhielten die Mäuse denselben Brei, der mit 2.000 ppm des zu testenden Hemmstoffes (oder bei den Kontrollen desselben unbehandelten Breis) behandelt war. Die Behandlung des Breis wurde bewirkt, indem er mit einer geringen Menge einer Acetonlösung des zu untersuchenden Stoffes gemischt wurde. Die Mäuse 11

AT 400 520 B wurden dann am Tag 10 getötet, mit Ausnahme der mit dem als 6j bezeichneten Mittel behandelten Maus; letztere wurde am Tag 7 getötet. Die Gewebe wurden über Nacht bei 4'C gekühlt, dann trocken-geblottet und das Frischgewicht jeder Gewebeprobe wurde aufgezeichnet. Die Gewebe wurden dann in 5 ml oder 10 ml, im Fall des Darms und der Leber, Aceton-0,1 N NH*OH (9:1, V/V) homogenisiert. Die Homogenate wurden dann bei 1.500 g zentrifugiert und die Oberstände wurden auf einem SPEX-FA 112 Spektraifluoro-meter analysiert; Anregung 400 nm, Emission 630 nm Wellenlänge, die Optima für Proto IX. Die Proto IX-Akkumulation wurde bestimmt als cps (Fluoreszenzzählimpulse pro Sekunde emittiert) pro Gramm Gewebe. Die Ergebnisse sind unten aufgeiistet (die Ergebnisse sind Durchschnittswerte für zwei Mäuse pro Behandlung mit Ausnahme der Behandlungen mit den Mitteln 6f, 6h, 6i und 6j, bei denen nur eine Maus behandelt wurde):

Proto IX Durchschnitts cps pro Gramm x 103* Mittel Tumor Leber Nieren Nebennieren Darm Masse Tumor masse wie excidiert (mg) 6a 1203 4291 10817 6572 5870** 143 6b 1520 1261 2441 2529 5577“ 90 6c 14336 2739 16186 13790 9937“ 157 6d 2006 1581 12865 443 5565“ 294 6e 837 876 915 1331 2069“ 165 6f 449 1170 661 5611 1157 69 6g 166 803 606 1984 466 250 6h 298 914 585 2259 584 192 6i 932 1510 4014 36940 3454 20 6j 1251 538 315 491 572 11 Kontrolle 239 536 494 1504 233 424“ 200 * Die Zahlen in der Tabelle sind gleich den Originaldaten mal 10-3 " Messungen wurden gemacht mit Proben, die verdünnt waren mit 3 Teilen basischem Aceton zu einem Teil Probe

Diese Zahlen entsprechen den folgenden Konzentrationen an Proto IX in den jeweiligen Geweben, ausgedrückt als ug Proto IX pro Gramm Gewebe:

Mittel Tumor Leber Nieren Nebennieren Darm 6a 11 39 99 60 54 6b 14 12 22 23 51 6c 131 25 148 126 91 6d 18 14 117 4 51 6e 8 8 8 12 19 6f 4 11 6 51 11 6g 2 7 6 18 4 6h 3 8 5 21 5 6i 9 14 37 337 32 6j 11 5 3 4 5 Kontrolle 2 5 5 14 2 4

Der oben zitierte Artikel von Dougherty gibt eine Zahl von 3,6 ug/g für die Konzentration des Porphyrins bei derselben Art (SMT-F) Tumor nach Injektion von 10 mg/kg Hämatopörphyrinderivat in dieselbe Art (DBA'2 Ha) Maus an. Andere technische Literatur (Moan et al. P&P 46-5, Seiten 713-721; beachte Figur 2 auf Seite 716) deuten an, daß eine Konzentration von etwa 12 ug/g des Porphyrins in Tumoren erreicht wird (C3H.Tif Mammakarzinom) in DBA/H2-Mäusen nach intraperitonealer Injektion von 25 mg/kg Photofrin II, dem weitverbreiteten Sensibilisierungsmittel für photodynamische Behandlung und Nachweis von Krebs. 12

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Die Gesamtmassen der von den Mäusen verbrauchten, das Mittel enthaltenden Nahrung waren wie folgt: 6a, 22 und 35 g: 6b 37 und 35 g; 6c 25 und 22 g; 6d 41 und 32 g; 6e 40 und 44 g; 6f 27 g; 6g 33 und 40 g; 6h 36 g; 6i 10 g; 6j 20 g.

Bei der Vorbereitung der in diesem Beispiel 6 beschriebenen Untersuchungen wurden die folgenden 5 Routineschritte durchgeführt, unter Verwendung (wenn nicht anders angegeben) des Mittels, das in diesem Beispiel als 6c bezeichnet wird bei nicht tumortragenden Tieren: a. Die LDso des Mittels wurde bestimmt als über 2.600 mg/kg liegend (d.h. mg des Mittels pro kg Körpermasse) für Ratten (bestimmt während eines 14-tägigen Zeitraumes anschließend an eine einzelne orale Dosis, die Maisöl enthaltend 15 % des Mittels umfaßte) und mehr als 700 mg/kg für Mäuse 70 (bestimmt während eines 14-tägigen Zeitraumes folgend auf eine einzelne orale Dosis, die Maisöl und 5 % des Mittels umfaßte). b. Bei Tests für die Trägermittel für die intraperitoneale Injektion, ohne das Mittel, wurde bestimmt, daß die Mäuse eine Injektion einer 0,5 ml Dosis einer Mischung von gleichen Teilen DMSO (Dimethylsulfoxid) und Wasser tolerieren konnten. 75 c. In Tests des in einer Mischung von 60 % Maisöl und 40' % DMSO intraperitoneal injizierten Mittels wurde bestimmt, daß die Mäuse eine Dosis von 100 mg/kg tolerieren konnten, d. Die folgenden Versuche wurden mit Mäusen durchgeführt: i) tägliche orale Gabe von 50 mg/kg (unter Verwendung einer 1 %igen Lösung des Mittels in Aceton) 8 Tage lang 20 ii) tägliche i.p.-lnjektion von 50 mg/kg (unter Verwendung einer 1 %igen Dispersion des Mittels in

Mineralöl, hergestellt durch Auflösen des Mittels in einem Tropfen DMSO und Mischen der entstehenden Lösung mit dem Mineralöl) 8 Tage lang; iii) tägliche topische Anwendung auf die Haut mit 50 mg/kg (unter Verwendung einer 1 %igen Lösung in DMSO) 8 Tage lang; 25 iv) Füttern 8 Tage lang mit einer Standardnahrung, in die 2.000 ppm des Mittels, bezogen auf das

Gewicht der Nahrung eingebracht worden waren; v) tägliche i.v.-lnjektion von 50 mg/kg (unter Verwendung einer 2 %igen Lösung in DMSO) 4 Tage lang.

Die in diesen Versuchen verwendeten Mäuse wurden dann getötet und ihre Gewebe auf Proto IX ·-30 Akkumulation untersucht.

In einem anderen Test wurde eine männliche Fisher 344 - Ratte 27 Tage mit einem Futter, das 5.000 ppm des Mittels 6c enthielt, gefüttert und dann getötet. Die Gewebe dieser Ratte zeigten erhöhte Gehalte an Proto IX verglichen mit einer Kontrolle, mit deutlichen Anstiegen der Gehalte in der Niere, dem Darm, dem Magen und dem Gehirn und nur einem geringen Anstieg des Gehalts in Muskelgewebe. 35 In den vorhergehenden Tests mit Ratten und Mäusen wurden die Tiere in einem Standard-12-Stunden-Dunkel-12-Stunden- Licht-Zyklus gehalten.

Beispiel 5 40 In einer Reihe von Versuchen gemäß den Beispielen 1 und 2 wurden Kulturen von HeLa-Zellen in Gegenwart von 100 μ,Μ verschiedener unten aufgeführter Behandlungsmittei inkubiert. Die aufgeführten %-Angaben neben jedem Behandlungsmittel zeigen das Ansteigen der Menge an Proto IX, das in Gegenwart dieses Behandlungsmittels produziert wurde, bezogen auf die von den Kontrollen im selben Experiment produzierten Mengen. 45 . In Beispiel 4 verwendete Mittel: 6a) 337 %; 6b) 366 %; 6c) 297 %; 6d) 1200 %; 6e) 1210 %; 6f) 280 %; 6g) 326 %; 6h) 431 %; 6i) 544 %; 6j) 469 %.

Andere Mittel: 50 13 55

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Beispiel 6

In diesem Beispiel wurde der Enzymhemmstoff 6c von Beispiel 4 an Ratten verfüttert, Tumore wurden in Ratten implantiert und die tumortragende Zone wurde mit Licht bestrahlt, was eine Regression des Tumors bewirkte.

Genauer wurden 3 Sprague-Dawley Ratten mit Durchschnittsmasse 120 g 6 Tage auf eine Diät mit einer Nahrung, die 2.000 ppm des Mittels enthielt, gesetzt. Am Tag 3 wurden Chondrosarkoma in den rechten hinteren Schenkel jeder Ratte implantiert, indem 0,3 ml einer Suspension der Tumorzelien (1 Million Tumorzellen) injiziert wurden. Am Tag 6 wurde der rechte hintere Schenkel jeder Ratte rasiert und enthaart, die Größe jedes Tumors gemessen und die Tumorfläche und die umgebende Haut wurden dann mit nicht- 14

AT 400 520 B thermischen Dosen von 630 nm Licht mit insgesamt 270 J/cm2 bestrahlt. Am nächsten Tag wurde gefunden, daB zwei Ratten offensichtlich frei von Tumoren waren (d.h. keine tastbare Tumormasse) und die dritte Ratte zeigte eine fast vollständige Regression des Tumors. Die umgebende Haut und das Muskelgewebe der Ratten waren leicht gebleicht und zeigten eine geringe Schwellung, deutlich weniger als mit der 5 Photofrin II vermittelten photodynamischen Therapie einhergeht.

Appendix A 10 % Efflux-Test

Der % Efflux-Test verwendet Kotyledonen, die von etio-75 lierten Gurkenkeimlingen geernet wurden. In einem

Anfangsschritt wird eine Masse von Kotyledonen im dunkeln mit einer wässrigen gepufferten Lösung, die einen radioaktiv markierten Zucker enthält, behandelt. Die 25 30 35 40 45 50 15 55

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Menge des von den Kotyledonen aufgenommenen Zuckers wird dann genessen (durch Auszählen, wie unten beschrieben). Die Kotyledonenmasse wird dann in zwei Teile geteilt; ein Teil der Kotyledonen wird im dunkeln mit einer wässrigen gepufferten Lösung, die die zu testende Verbindung enthält, behandelt, während der andere Teil auf dieselbe Weise im dunkeln behandelt wird, mit einer ansonsten identischen Lösung, ohne die Testverbindung, als Kontrolle. Die Kotyledonen im Kontakt -mit der wässrigen Lösungen werden dann 16 Stunden mit Licht bestrahlt und dann aus den wässrigen Lösungen getrennt; letztere werden dann gemessen (durch Zählen), um ihre Gehalte an radioaktiv markiertem Material zu bestimmen. Die Ergebnisse werden als % Eff lux ausgedrückt, der wie folgt berechnet wird, worin S die Zählung des radioaktiv markierten Materials (pro Kotyledone), das durch die Kotyledonen in der. Anfangsbehandlung aufgenommen wird, ist, ST die Zählung des radioaktiv markierten Materials (pro Kotyledone) in der wässrigen Lösung, die die zu testende Verbindung enthält, nach Bestrahlung mit Licht und Sc die Zählung des radioaktiv markierten Materials (pro Kotyledone) in der wässrigen Lösung der Kontrolle nach Bestrahlung mit Licht ist; ST - Sc % Efflux = -

S

Genauer werden die folgenden Materialien und Bedingungen in dem % Efflux-test angewendet:

Pflanzenmaterial:

Gurkensaat (Cucumis sativus L. cultivar 'Wisconsin SMR 18') wurde gekeimt und in Vermiculit, der mit einem üblichen (9-45-15) Dünger berieselt worden war, gezüchtet. Die Keimlinge wurden bei 25’C und 80-90 % relativer Luftfeuchtigkeit in einer dunklen Inkubationskammer 16

AT 400 520 B gezogen. Die Kotyledonen wurden von den etiolierten Keimlingen 5 Tage nach Pflanzen geerntet und in 1,0 mM CaCl2 gespült, alles unter grünem Licht.

Gepufferte Lösung: 1 mH KCl, 1 mH CaCl2 und 2,0 mH Kaliumphosphat, eingestellt auf pH 6,5 (z.B. mit NaOH)

Radioaktiv markierter Zucker: 3-0-Hethyl-3-[U-14C]~ gLucose der spezifischen Aktivität 10,9 GBq/mmol (Amersham Corp., Arlington Heights IL).

Anfangsbehandlung:

Gewaschene Kotyledonen (180 - 230) werden in einen 250 ml Weithals-Erlenmeyerkolben mit Schaumstoff stopfen, der 50 ml der gepufferten Lösung enthält, gegeben und der radioaktiv markierte Zucker wird in einer Menge zugegeben, die eine Konzentration von 600 nM in der Lösung ergibt. Der Kolben wird 24 Stunden mit 125 UpM auf einem Kreisschüttler im dunkeln geschüttelt. Die Kotyledonen werden dann auf einem Nylonnetz gewonnen und dreimal mit 20 ml Volumina 1 mM CaCl2 gespült. Die Aufnahme des radioaktiv markierten Zuckers wird gemessen, indem 3 Proben von 5 Kotyledonen jeweils in NCS Gewebesolubilisierungsmittel (Amersham Corp.) aufgeschlossen werden und das entstehende Mazerat in einem Flüssigszintillationsspektrometer gezählt wird. (Die Ergebnisse dieser Aufschlüsse erwiesen sich als äquivalent mit derselben Bestimmung, die gemacht wurde, indem Probekotyledonen in einer Autooxidationsvorrichtung verbrannt wurden).

Behandlung mit der zu testenden Verbindung (und Kontrollbehandlung^: 5 Kotyledonen werden mit der abaxialen Seite nach oben auf 3 ml der gepufferten Lösung in einer zugedeckten Kunststoff-Petrischale mit 35 mm Durchmesser schwimmen 17

AT 400 520 B gelassen. Die Testverbindung wird dann zugegeben (als Lösung in Aceton) in einer solchen Menge, daß sich eine 5 vorbestimmte Konzentration (unten diskutiert) der Test verbindung in der gepufferten Lösung ergibt; die Acetonkonzentration in der gepufferten Lösung ist dann 0,1 % 70 (V/V), in der Kontrolle ebenso wie in der Lösung, die die Testverbindung enthält. Die schwimmenden Kotyledonen werden dann herumgewirbelt durch Schütteln der Schalen 16 Stunden lang bei 90 UpM auf der Oberfläche eines 15 Kreisschüttlers.

Bestrahlung mit Licht: 2o Die Schalen, die die Kotyledonen, die auf den Lösungen schwimmen, enthalten, werden 16 Stunden einer Beleuchtung ausgesetzt, die durch 4 GE F20Tl2-CW-Fluoreszenz-lampen geliefert wird, mit einer gemessenen Intensität 25 von 150 μΕ m_a sec-1 in der photosynthetisch aktiven Region des Spektrums (PAR) (gemessen an der Oberfläche der Kotyledonen), während die Schalen geschüttelt wer-30 den.

Messung der Menge an radioaktiv markiertem Material in 35 der Flüssigkeit:

Die gesamte Flüssigkeit wird von den Kotyledonen ge trennt und dann in einem Flüssigszintillationsspektrometer ausgezählt. 40

Dunkelheit:

Alle Behandlungen vor dem Beleuchtungsschritt werden im 45 dunkeln oder unter grün fluoreszierendem Licht (d.h.

Licht, das durch ein grünes Kunststoff-Kantenfilter gefiltert wird, das Licht von 450 - 600 nm durchläßt) durchgeführt. 18 55

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Appendix B

Kulturmedien

Medium M

Salze Molarität Stammlösung ml Stamro-lösung/1 a Citrat ·6H20 1.7 x 10-¾ 10% 5 Spurenmetalle wie unten wie unten 10 FeCl3·6H20 0.37 x 10‘3M 1% . 1 CaCl2·2H20 0.36 x 10'3M 5.3% 1 MgS04-7H20 1.2 x 10-¾ 10% 3 NH4NO3 3.7 x 10-¾ 10% 3 KH2P04 2.2 X 10-¾ 10% 3 k2hpo4 1.7 x 10-¾ 10% 3

Staromlösuna der Spurenmetallmischuna

H3BO3 100 mg/L. ZnS04·7H20 100 mg/L MnS04♦4H20 40 mg/L C0C12 * 6H20 20 mg/lL NaMo04*2H20 20 mg/L CuS04 4 mg/L

Kulturmedium A wird hergestellt, indem 10 ml pro 1 einer wässrigen 10 %igen Natriumacetatlösung (7,5 x 10*s M) zu Medium M zugegeben werden. 19

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Die Komponenten werden zu destilliertem Wasser in der oben angegebenen Reihenfolge zugegeben und bei 15 psi 15 Minuten autoklaviert.

Stammkulturen gezüchtet in Gegenwart von Licht Stammkulturen von y-l-Zellen werden axenisch in Flüssigkultur aus Medium A oder M, vorzugsweise Medium M mit einem 14/10 Stunden Licht/Dunkel-Zyklus bei 25*C in Erlenmeyerkolben, die mit Polyurethanstopfen versehen sind, gehalten. Die Stammkulturen werden ohne zusätzliche Belüftung auf rotierenden Schüttlern mit 125 UpM inkubiert. Die Lichtintensität am Kulturlevel ist 120 μΕ m-a sec-1 (PAR). Unter diesen Bedingungen werden die Kulturen in einer halbsynchronen Wachstumsart gezogen, bis sie die stationäre Phase von 2 - 4 x 106 Zellen/ml erreichen.

Kulturen, die ohne Licht gewachsen sind (im dunkeln gewachsene Kulturen1

Zellen der stationären Phase aus den Stammkulturen, die in Gegenwart von Licht gewachsen sind (7,5 ml) werden in 750 ml Medium A in einen Erlenmeyerkolben transferiert.

Die Zellen werden 3-4 Tage bei 25*C im dunkeln inkubiert, unter Belüftung mit einem submersen Belüftungsrohr. Während dieses Zeitraumes durchläuft diese Kultur von y-1-Zellen 7-8 Zellteilungen, wobei sie alles sichtbare Chlorophyll verliert und die Konzentration sollte 2-3 x 10* Zellen pro ml sein.

Herstellung von Zellen zur Verwendung im Test Zellen werden von einer frisch hergestellten, im dunkeln gewachsenen Kultur (750 ml) durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit, d.h. etwa 2.000 UpM,ungefähr 5 Minuten bei etwa 20 *C geerntet. Die Zellen werden leicht resuspendiert in 50 ml Medium A. Eine Probe dieser 20

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Suspension (ungefähr 0,25 ml) sollte auf Motilität getestet werden, und nach Fixierung mit einer wässrigen 1 %igen Glutaraldehydlösung sollte eine Zellzählung gemacht werden, um die Anzahl der Zellen pro ml zu bestimmen. Eine normale Zellzählung ist etwa 5 x 107 Zellen pro ml. Aliquots von 1 ml (io7 Zellen pro ml) werden in die Testgefäße gebracht (z.B. Falcon® 24-Napf-Gewebekulturplatten). An diesem Punkt sind die Zellen sehr motil und haben eine gelbe Farbe.

Die Testverbindung wird in einem Lösungsmittel (Aceton, Ethanol, Dimethylsulfoxid oder Wasser, vorzugsweise Aceton) gelöst, um eine Konzentration zu schaffen, die dem 1.000 fachen der Endkonzentration entspricht. 1 μΐ dieser Testlösung wird zu jedem von 2 Näpfen mit einer 5 oder 10 μΐ Mikrospritze zugegeben. 4 Kontrollnäpfe pro Gewebekulturplatte werden auf die oben beschriebene Weise hergestellt, ohne daß die Testverbindung vorhanden ist. Die Gewebekulturplatten werden mit einem transparenten Kunststoffdeckel bedeckt und in eine Wachstumskammer mit einer Lichtintensität von 70-90 μΕ nra sec-1 13 bis 16 Stunden bei 25°C gebracht. Wenn der Inhalt der Testnäpfe gelb erscheint, werden sie extrahiert, wie in der Sektion für die.Auswertung der Ergebnisse unten beschrieben. Wenn der Inhalt der Testnäpfe transparent erscheint oder eine fahlgrüne Farbe hat, werden sie in einen Rotationsschüttler mit ungefähr 125 UpM gebracht und 2 Stunden mit einer Lichtintensität von etwa 600 μΕ irr2 sec-1 bestrahlt, bevor sie extrahiert werden.

Auswertung der Ergebnisse

Eine wässrige, 10 %ige Natriumdodecylsulfatlösung (250 μΐ) und Methanol (1ml) werden zu jedem Testnapf zugegeben und sorgfältig gemischt. Die Mischungen werden im dunkeln 3-4 Stunden stehen gelassen. Die Gewebekulturplatten werden bei Raumtemperatur mit niedriger 21

Claims

AT 400 520 B Geschwindigkeit (ca. 2.000 UpM) 5 Minuten zentrifugiert. Die Überstände werden entfernt und in einem Beckinan s Spektralphotometer Modell 35 zwischen 350 nm und 500 nm auf die Anwesenheit von Protoporphyrin IX, bei 668 nm, dem Absorptionspeak von Chlorophyll in diesem Lösungs-70 mittelsystem und bei 720 nm, um einen Hintergrundtrübungswert zu verwenden, analysiert. Analyse der Daten Für jeden Napf wird ein Grünwert erhalten, indem der 720 nm-Wert von dem 668 nm-Wert abgezogen wird. Diese Werte werden für jede Konzentration der zu testenden Verbindung und für die Kontrolle im Durchschnitt gebildet. Die % Hemmung ist Durchschnitts-Grünwert für die jeweilige Konz* 100x(l----- ) Durchschnitts-Grünwert für die Kontrolle 30 Patentansprüche 1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der photodynamischen Behandlung oder 35 Auffindung von Tumoren, welche Zusammensetzung gekennzeichnet ist durch eine Verbindung, die ein spezifischer Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu .Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase (E.C. 1.3.3.4.) ist und einen I50 für Protoporphyrinogen-Oxidase von weniger als 1 U.M gemäß dem im Beschriebungstext dargelegten Test aufweist, wobei die Zusammensetzung auch einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt. 40
2. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der photodynamischen Behandlung oder Auffindung von Tumoren, welche Zusammensetzung gekennzeichnet ist durch eine Verbindung, die ein spezifischer Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin iX durch Protoporphyrinogen-Oxidase (E.C. 1.3.3.4.) ist, welche Verbindung kein Tetrapyrrol ist und ein 45 Redoxpotential aufweist, das negativer als -500 mV ist, wobei die Zusammensetzung auch einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
3. Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin iX durch Protoporphyrinogen-Oxidase (E.C. 1.3.3.4), wobei der Inhibitor ein spezifischer Inhibitor ist und einen I50 für 50 Protoporphyrinogen-Oxidase von weniger als 1 UM aufweist, zur therapeutischen Verwendung.
4. Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase (E.C. 1.3.3.4), wobei der Inhibitor ein spezifischer Inhibitor ist und einen I50 für Protoporphyrinogen-Oxidase von weniger ais 1 U.M aufweist, zur Verwendung in der photodynamischen 55 Behandlung von Tumoren.
5. Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase (E.C. 1.3.3.4), wobei der Inhibitor ein spezifischer Inhibitor und kein Tetrapyrrol 22 AT 400 520 B ist und ein Redoxpotential aufweist, das negativer als -500 mV ist, zur therapeutischen Verwendung.
6. Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch Proto-porphyrinogen-Oxidase, (E.C. 1.3.3.4), wobei der Inhibitor ein spezifischer Inhibitor und kein Tetrapyrrol ist und ein Redoxpotential aufweist, das negativer als -500 mV ist, zur Verwendung in der photodynamischen Behandlung von Tumoren.
7. Inhibitor nach einem der Ansprüche 3 bis 6, nämlich 1-(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloxyphenyl)-3-methyl-4-difluormethyl-A2-1,2,4-triazolin-5-on.
8. Inhibitor nach Anspruch 4 oder 6, welcher ein Aryitetrazoiinon, ein Aryltriazindion, ein Aryloxadiazol, ein Aryltetrahydroindazol, ein Aryltetrahydrophthalimid, ein Arylhydantoin, ein Arylurazol, ein Arylhexah-ydropyridazin, ein heterozyklisches Arylurethan, eine Phenoxyphenylverbindung, ein Arylpyrazol oder eine Verbindung der Formei

ist, worin Xb die Bedeutung O oder S aufweist und "Ph" ein substituiertes Phenyl ist.
9. Inhibitor nach Anspruch 8, wobei die Arylgruppe einen Substituenten aufweist, der eine saure Sulfonamidgruppe ist, oder ein wasserlösliches Salz hievon.
10. Inhibitor nach Anspruch 9, welcher ein Aryltriazolinon ist.
11. Inhibitor nach Anspruch 10 mit der Formel
12. Inhibitor nach Anspruch 8 in einem oral annehmbaren Träger.
13. Inhibitor nach Anspruch 8 in sterilen Zubereitung.
14. Inhibitor nach Anspruch 8 zur Verwendung, durch orale Verabreichung, in der photodynamischen Behandlung von Tumoren, welcher Inhibitor ein wasserlösliches Salz oder eine Säureverbindung ist, weiche ein wasserlösliches Natrium- oder Kaliumsalz bildet. 23 AT 400 520 B Hiezu 1 Blatt Zeichnungen 24