SE505938C2 - Protoporfyrinogen inhibitorer och användning därav i kompositioner för att detektera och behandla tumörer - Google Patents
Protoporfyrinogen inhibitorer och användning därav i kompositioner för att detektera och behandla tumörerInfo
- Publication number
- SE505938C2 SE505938C2 SE9101807A SE9101807A SE505938C2 SE 505938 C2 SE505938 C2 SE 505938C2 SE 9101807 A SE9101807 A SE 9101807A SE 9101807 A SE9101807 A SE 9101807A SE 505938 C2 SE505938 C2 SE 505938C2
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- inhibitor
- protoporphyrinogen
- compound
- protoporphyrin
- protoporphyrinogen oxidase
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
- A61K31/235—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids having an aromatic ring attached to a carboxyl group
- A61K31/24—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids having an aromatic ring attached to a carboxyl group having an amino or nitro group
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
5505 958 ceras (t.ex. intraperitonealt) såsom anges i exempelvis Spikes et al., "Photodynamic Behavior of Porphyrins in Model Cell, Tissue and Tumor Systems“; i Photodynamic Therapy of Tumors and other Diseases (utgiven av Jori och C.A. Perria); sid. 45-53; Libreria Progetto, Padua (1985) och referenserna anförda däri.
Den tekniska litteraturen indikerar att införandet av proto- porfyrin i cellerna såsom humanerytrocyter (Dubbelman et al, Biochimica et Biophysica Acta, Sll (l978) 141-l5l) eller murinleukemiceller (Kessel, Cancer Research 42, 1703-1706, maj 1982) har en markerad fotosensibiliserande effekt. Artikeln av Kessel anger att detta var det mest potenta fotosensibili- serande medlet av de testade. När Kessel och andra (t.ex.
Berenbaum et al, Br. J. Cancer (1982) 45, 571-581) injicerade protoporfyrin i djur fann de inget detekterbart protoporfyrin i tumörerna vilket indikerade att protoporfyrin introducerad som sådant i kroppen lätt kan förloras i cirkulationen.
Det är även välkänt att använda hematoporfyrinderivat och lik- nande material för detektering och lokalisering av tumörer, såsom cancrar i blåsan eller lungorna (P&P 46-5, exempelvis sidan 759).
Enligt en aspekt av föreliggande uppfinning är medlet för behandling av cellerna i sådan fotodynamisk behandling eller i de kända metoderna för detektering och lokalisering av tumö- rer inte ett porfyrin eller inte enbart ett porfyrin. Det inne- fattar i stället ett enzym-inhiberande medel som inhiberar den enzymatiska överföringen av protoporfyrinogen till hem i nämnda celler och orsakar därigenom en uppbyggnad av endogent proto- porfyrin IX i nämnda celler. Vi har konstaterat att medel så- som vissa typer av herbicida föreningar, som inhiberar den enzymatiska överföringen av protoporfyrinogen till klorofyll i växtceller även inhiberar den enzymatiska överföringen av protoporfyrinogen till hem i däqgdjursceller. Vi tror att inhiberingen genom sådana medel troligtvis påverkar stegen vid 505 938 överföring av protoporfyrinogen till protoporfyrin IX genom ett enzym (protoporfyrinogen-oxidas, EC l.3.3.4) så att proto- porfyrinogenet inte kan följa den normala enzymatiska vägen till protoporfyrin IX utan oxideras i stället i cellen (t.ex. i plasmat) men utanför den normala enzymatiska vägen (t.ex. utanför organellmembranet), och att resultaten är en ackumu- lering av protoporfyrin IX i lokaliseringar där det blir otill- gängligt för normal överföring till hem med resultatet att, när cellerna utsättes för ljus, detta ackumulerade protopor- fyrin IX har en cellförstörande effekt såsom den som utövas i den ovan beskrivna fotodynamiska behandlingen.
De enzyminhiberande medlen enligt föreliggande uppfinning är specifika inhibitorer för protoporfyrinogen-oxidas i det av- seendet att de inte arbetar som allmänt enzymgift såsom dena- turerings- eller tvärbindnings-medel (t.ex. sulfhydrylreagens), de är företrädesvis inte material som påverkar oxidationsbe- tingelserna såsom elektronacceptorer; de föredragna medlen en- ligt föreliggande uppfinning har således redoxpotentialer som är mer negativa än ungefär -500 mV, såsom mera negativa än -800 mV (mätt exempelvis på konventionellt sätt i ett ändamåls- enligt lösningsmedel för medlet, såsom genom cyklisk volta- metri eller polarografiskt). Man föredrar även att medlet inte är tetrapyrrol och att dess I50 för protoporfyrinogen-oxidas är mindre än ungefär l pm såsom mindre än ungefär 0,3 m, t.ex. ett I50 av ungefär 0,1 eller 0,03 eller 0,01 pm eller mindre.
Det enzyminhiberande medlet är företrädesvis ett som har en hög förmåga att bryta sönder plasmalemmat i växtmaterial. Ett test avseende denna kapacitet är Efflux-försöket som beskri- vits i artikeln av Halling och Peters i Plant Physiology, 84, lll4-5 (l987).I eüzsådant test (beskrivet i nämare detalj i Appendix A nedan) visar föredragna medel ett totalt utflöde av minst 50% vid en behandlingshastighet av 100 pm, företrädesvis vid en behandlingshastighet av l pm eller mindre, såsom 100 nM; högt aktiva material såsom 1-(4-kloro-2-fluor-5-propargyl- oxifenyl)-3-metyl-4-difluormetyl-A2-l,2,4-triazolin-5-on eller 505 958 laktofen (beskrivet nedan) ger en total utflödesprocent av över 90% vid en koncentration av 100 nM.
Ett annat test avseende materialets förmåga att spränga sönder plasmalemmat i växtmaterial är "Light-Induced Greening Inhibi- tion Testet" beskrivet närmare i Appendix B nedan. Detta test mäter förmågan att inhibera ljus-grön-färgning (light-greening) av mörkerblekt (dark-bleached) Chlamydomonas reinhardi mutant y-l (en typ av alg som när den växer i mörker inte tillverkar klorofyll så att algmassan blir blek beroende på närvaron av nya icke-gröna celler och som åter ger klorofyll när den expo- neras för ljus). Många av de föredragna föreningarna (medlen) som användes i föreliggande uppfinning har förmåga att inhibe- ra ljus-grön-färgning med minst 50% när föreningen användes vid en koncentration av l0_5M, mera föredraget vid en koncentration av l0_6M eller mindre, t.ex. l0_7M. Dessutom bör föreningen vara en som, när den användes vid nämnda koncentration i “Light- Greening Inhibition Testet" ger en supernatant som visar en ljusabsorptionstopp vid ungefär 405 nm vilket är högre än klorofylltoppen (toppen vid ungefär 668 nm i detta system), t.ex. supernatanten visar en 405 nm topp vars höjd är 2, 3 eller 4 gånger höjden av 668 nm toppen.
Bland de enzyminhiberande medlen som kan användas i praktiken enligt föreliggande uppfinning är herbicidala föreningar av följande klasser (A till D): A. arylheterocykliska herbicíder med den allmänna formeln Ph-NHet vari "Ph" är en substituerad fenyl, företrädesvis 2,4-di- substituerad fenyl, allra helst en 2,4,5-trisubstituerad fenyl och NHet är en 5- eller 6-ledad heterocyklisk ring med en till fyra ring-kväveatomer och följande formler Cfl QD U" \O 04 00 -N-C=0 eller -N-C_oH eller -N-C-C1 I/ |\\ |\\ Q Q-c-R Q-c-a vari Q betecknar resten av den heterocykliska ringen och R be- tecknar väte eller en substituentgrupp. Denna klass av förenin- gar innefattar sâdana material som de som angetts som “the cyclic imide class of herbicides" i en artikel av Wakabayashi et al., J. Pesticide Sci. ll, 635-460 (1986) som visar följan- de föreningar i fig. l: °Ü?šï* 3,? n ifrån? man Förening I är en aryloxadiazol-herbicid, nämligen 2-tert- butyl-4-(2,4-diklor-5-isopropoxifenyl)~Å2-l,3,4-oxadiazolin- s-on. Andra 2-alkyl-4-(2,4,5-trisubstituerad feny1)-A?-1,3,4- oxadiazolin-5-oner som kan användas i föreliggande uppfinning visas exempelvis i de amerikanska patenten 3 385 862, 3 836 539 och 3 876 413.
Förening II är en aryltetrahydroindazolherbicid, nämligen 3-klor-2-(4-kloro-2-fluor-5-isopropoxifenyl)-4,5,6,7-tetra- hydro-2H-indazol. Andra 3-substituerade-2-(2,4,5-trisubsti- uxnade fenyl)tetrahydroindazoler som kan användas i föreliggan- de uppfinning anges exempelvis i U.S.-patentet 4 670 043. 505 958 Föreningarna III, IV och V är aryltetrahydroftalimidherbicider.
Andra aryltetrahydroftalimider som kan användas i föreliggande uppfinning anges exempelvis i U.S.-patenten 4 431 822, 4 670 046, 4 670 042 och 4 439 229 och den publicerade inter- nationella ansökningen (PCT) WO 87/07602. De tvâ senare ovan angivna hänvisningarna visar även andra NHet-ringar som kan användas och sådana ringar åskâdliggöres exempelvis i spalt 4 rad 25 till spalt 5 rad 20 i U.S. 4 439 299 och på sidan 12 till 14 i WO 87/07602.
Andra lämpliga herbicider av PH-NHet-typ är: aryltriazolinoner, såsom de som visas i U.S.-patenten 4 318 73l, 4 398 943, 4 404 019, 4 702 945, 4 705 557, 4 702 763, 4 761 174 och internationella ansökningarna (PCT) WO 85/01637, WO 85/04307, WO 87/00730, WO 87/03782, WO 86flM48l och WO 88/01133; aryltetrazolinoner, såsom de som visas i U.S.patentet 4 734 124 och internationalla ansökningarna (PCT) WO 85/01939 och WO 87/03873; aryltriazindioner, såsom de som visas i U.S.-patenten 4 755 217 och 4 766 233, internationella ansökningen (PCT) WO 86/00072; arylhydantioner, såsom de som visas i U.S.-patentet 4 427 438; arylurazoler, såsom de som visas i U.S.-patentet 4 452 981, och arylhexahydropyridaziner, såsom de som visas i U.S.-patentet 4 619 687.
B. Aryl-heterocykliska uretaner, såsom de som visas i U.S.- patentet 4 521 242.
C. Fenyleterherbicider, såsom de med en p-halo- eller p-nitro- 505 958 fenoxifenyl-struktur, såsom följande kommersiellt tillgäng- liga material: - (2-k1or-4- (trifluormetyi) ' metyl-s- (2 , 4-d1k1orfenoxi) - fenoxi)-2-nitro-N-metansul- 2-nitrobensoat (bifenox) fonylbensamid (fomesafen) FF F Cl °fi Pc1-13 f,~*°'° O bnatrium-5-(2-klor-4-(trifluor- 2-klor-l-(3-etoxi-4-nitro- metyl)fenoxi)-2-nitrobensoat fenoxi)-4-trifluormetyl- (acifluorfen) bensen (oxifluorfen) y F F Cl Qlw f” / 0 Andra lämpliga kommersiellt tillgängliga difenyleterherbicider är laktofen: 1-(karboetoxi)etyl-5-(2-klor-4-trifluormetylfenoxi)- 2-nitrobensoat, fluorglykofen: (karboetoxi)metyl-5-(2-klor-4-trifluormetyl- fenoxi)-2-nitrobensoat, .505 938 fromesofen: 5-(2-klor-4-(trifluormetyl)fenoxi)-N-metyl- sulfonyl-2-nitrobensamid, klornitrofen: 2,4,6-triklor-(4-nitrofenoxi)-bensen, fluordifen: 2-nitro-l-(4-nitrofenoxi)-4-trifluormetylbensen, nitrofen: 2,4-diklor-l-(4-nitrofenoxi)bensen, klormetoxifen: 4-(2,4-diklorfenoxi)-2-metoxi-l-nitrobensen. Ännu en annan lämplig difenyleterherbicid är metyl-5-(2-klor- 4-trifluormetylfenoxi)-2-nitroacetofenon-oxim-O-acetat.
D. Arylpyrazol-herbicider såsom de som visas i U.S.-patenten 4 563 210, 4 496 390 och 4 459 l50 och tyska offentliggörande- skriften 3530327 Al.
E. Föreningar med formeln H vari Xb är O eller S och "Ph" har ovan beskriven innebörd så- som föreningarna som framgâr av den publicerade europeiska patentansökningen 273417 eller Derwent Abstracts tillgänglig- hetsnummer 87-040749.
Behandling med medlen enligt föreliggande uppfinning kan åstad- kommas genom intravenös eller intraperitoneal injektion. Med- let kan användas som en steril komposition innefattande medlet upplöst eller dispergerat i en farmaceutísk godtagbar bärare såsom exempelvis en vattenhaltig isoton lösning såsom vatten- haltig saltlösning (t.ex. O,9% NaCl) eller Dulbecco's fosfat- buffrade saltlösning (PBS) vid en koncentration av exempelvis 505 938 wšïö ml-1 eller innefattande medlet i ett liposomalt system. såsom ett som framställts med en fosfolipidvesikel på så sätt som beskrivits på sidorna 1659-1660 i Remington's Pharmaceuti- scal Sciences, 1985, (l7:e upplagan), utgiven av Mack Publishing Company. Exempelvis analogt till den formulering som beskrivits av Jori et al., Br. J. Cancer, (1983), 48 på sid. 307, kan 51,4 mg dipalmitoyl-difosfatidyl-kolin upplösas i 10 ml av en l mM lösning av medlet i kloroform-metanol (9:l volym/ volym) och efter noggrann blandning kan lösningsmedlet av- lägsnas under vakuum vid 30°C och ge en fast substans som kan återsuspenderas i 10 ml 0,0lM fosfatbuffert vid pH 7,4 inne- hållande 150 mM NaCl och varefter den grumliga lösningen ljud- behandlas i 30 minuter vid 5o°c.
De enzym-inhiberande medlen som kan användas i praktiken en- 'ligt föreliggande uppfinning kan konjugeras eller bindas till ändamålsenliga tumörspecifika monoklonala antikroppar (MABs) med användning av bindningsteknologi känd inom tekniken såsom ett medel för att mâlinrikta det enzym-inhiberande medlet mot det särskilda tumörstället.
De enzym-inhiberande medlen som användes enligt föreliggande uppfinning kan även användas genom enkel oralt intag före- trädesvis i utspädd form tillsammans med en farmaceutisk god- tagbar bärare såsom genom att sätta dem till födan såsom åskådliggjorts i exempel 6 nedan.
Det kan vara önskvärt, speciellt för oral administration, att använda enzym-inhiberande medel som är vattenlösliga salter eller som är sura och bildar vattenlösliga natrium- eller kalium-salter såsom en sur sulfonamid av den typ som beskri- vits i de internationella ansökningarna (PCT) WO 87/03782 (t.ex. medel 6c i exempel 6 nedan) eller WO 85/001939 och WO 87/03873 eller ett vattenlösligt salt därav såsom en karboxylsyra eller ett vattenlösligt salt därav såsom natrium- saltet känt som acifluorfen. 505 958 De enzym-inhiberande medlen som kan användas enligt föreliggan- de uppfinning kan införlivas i konventionella farmaceutiska preparat såsom tabletter (t.ex. sammanpressade tabletter som kan belägqas såsom med sockerpasta och/eller sirap), supposi- torier, kapslar (t.ex. hårdgelatinkapslar), suspensioner, lösningar, pulver eller ampuller. I sådana preparat kan medlet finnas närvarande i blandning med en farmakologiskt godtagbar fast och/eller flytande bärare som om så önskas kan vara ett näringsmedel; det kan exempelvis vara en fast substans såsom majsstärkelse eller ett flytande utpädningsmedel såsom vatten eller en ätlig olja eller mineralolja eller ett lösningsmedel, t.ex. dimetylsulfoxid. Blandningar av de twin-hüübennfiermfiel som kan användas, t.ex. en blandning av medel 6c i exempel 6 nedan och acífluorfen i exempelvis ungefär lika proportioner.
Den dos som skall användas kan fastställas genom rutinförsök väl kända inom tekniken såsom försök av den typ som beskrivits för Photofrin II i artikeln av Dougherty avseende "Photo- dynamic Therapy (PDT) of Malignant Tumors" i CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology vol. 2 issue 2 (1984), sidorna 83-116.
Följande exempel ges för att åskådliggöra föreliggande upp- finning ytterligare.
Exempel l HeLa-celler (en human tumörcellinje som vanligen användes för tumörforskning och erhålles från American Type Culture Collection) i den logaritmiska tillväxtfasen (har odlats vid 37°C i 5 dagar i en-liters Falcon vävnads-ordlingskolvar) tvättades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). En 0,25%-ig lös- ning av trypsin i PBS (2 ml) tillsattes och efter några minu- ter avlägsnades cellerna försiktigt från kolven och placera- des i 110 ml av en 25 mM lösning av Hepes i Minimum Essential Medium (MEM) supplementerad med 10%-ig v/v inaktiverat kalv- serum (1,1 ml av en 200 mM lösning av glutamin i 0,85% salt- lösning och ll.0O0 enheter penicillin/ll.0O0 mcg streptomycin. fn <3 m \o m oo ll Därefter placerades 5,0 ml prov av den erhållna omsuspenderade cellkulturen i en 50 ml Falcon vävnadsodlingskolv och (för- utom kontrollen) blandades med behandlingsmedlet. Proven inku- berades därefter i mörker vid 37°C i tre dagar. Cellerna av- lägsnades därefter och extraherades under grönt ljus på föl- jande sätt: Celler avlägsnades från botten av kolven genom tillsats av 0,8 ml av en 0,25%-ig lösning av trypsin i PBS. Efter l timmes inkubation i mörker avlägsnades celler och medium från kol- varna, placerades i centrifugrör med rund botten och ut- sattes därefter två omgångar för frysnings-upptinings- betingelser för att bryta upp cellerna och möjliggöra extrak- tion.
Undersökning av cellsuspensionerna efter denna uppbrytnings- omgång visade inte nâgra intakta celler. l0 ml basisk aceton (90% aceton:l0% 0,1 N NH4OH) tillsattes därefter till varje rör och rören centrifugerades för att avlägsna protein och celldebris. 5 ml vatten sattes till supernatanten följt av 0,5 ml av en mättad vattenlösning av NaCl. pH justerades därefter till 6,8 genom droppvis tillsats av 2 M KHZPO4. Det vattenhaltiga acetonextraktet fylldes därpå på en C8 Baker Prep kolonn. Kolonnerna torkades och tvättades därefter med 2 ml vatten. Tetrapyrrolerna eluerades med 2 x 1,5 ml 90/10 CH3OH/H20. Extrakten kvantifierades på en spektro- fluormeter.
De behandlande medlen som användes i detta försök var: A. 5-amino-levulin-syra, som är en känd prekursor för tetrapyrroler.
B. Acifluorfen-metyl med formeln: 505 938 7 F F Cl O/ C. En herbicid med formeln: F Q F F Cl GHz 0 \,cna Cfla D. En herbicid med formeln: 0D* 0 CEEH E. En herbicid med formeln: Medel A tillhandahölls som en filter-steriliserad 250 mM lös- ning i vatten, pH 6,5. Medlen B, C, D och E tillhandahölls som 50 mM lösningar i aceton. Aceton sattes även till kontrollen för att ge en koncentration av O,2% v/v däri. De mängder av medlen som satts till cellkulturerna var sådana att de gav 505 938 13 de koncentrationer som anges i tabell 1 nedan. De mängder tetrapyrrolprotoporfyrin IX ("Proto IX") som alstrades visas i denna tabell.
TABELL l Tetrapyrrol-ackumulering i behandlade HeLa-celler Fluorescenc- Mängd Koncentration emission Proto IX Medel av medel /um/ cps 400/630 (pmolL__ A 5000 41842 4,2 B 100 12921 1,3 C 100 33477 3,5 'b 100 10551 1,1 E 100 8967 0,9 kontroll 2795 0,3 Exempel 2 HeLa-celler i logaritmisk tillväxtfas som odlats i 6 dagar i sex en-liters Falcon-vävnadsodlingskolvar vid 37°C tvätta- des i fosfatbuffrad saltlake (PBS). En 0,25%-ig lösning av trypsin i PBS tillsattes och efter flera minuter avlägsnades cellerna försiktigt och placerades i 110 ml av en 25 mM lösning av Hepes i Minimum Essential Medium (MEM), supplementerad med % v/v inaktiverat kalvserum, 1,1 ml av en 200 mM lösning av glutamin i 0,85% saltlösning och 11.000 enheter penicillin/ 11.000 mcg streptomycin.
Prov (5,0 ml vardera) av den omsuspenderade cellkulturen placerades i 50 ml Falcon-vävnadsodlingskolvar med eller utan herbicid och inkuberades i mörker vid 37°C i 4 dagar, varvid herbiciden tillsattes i utspädd acetonlösning såsom i exempel 1. Aceton sattes även till kontrollerna för att ge en kon- centration av aceton av 0,2% v/v däri. Mängden herbicid var 505 938 14 Sådan att den gav de koncentrationer som anges i tabell 2 nedan.
De behandlande medlen var: B. som i exempel l C. som i exempel l F. en herbicid med formeln: Extraktion: Mediumet från var och en av kolvarna placerades i glasrör med rund botten under det att cellerna som vidhäftade till botten av kolvarna lossades genom tillsats av 0,5 ml av en 0,25%-ig lösning av trypsin i PBS och tvättades därefter efter några minuter vid 37°C ur kolvarna och âterkombinerades med deras medium.
Prov om 100 pl avlägsnades därefter från varje cellsuspen- sion för att fastställa celldensitet. De kvarvarande 5,4 ml cellsuspension ljudbehandlades därefter i 30 minuter för att bryta upp cellerna. ml basisk aceton (90% aceton:l0% 0,1 N NH4OH) sattes där- efter till varje rör och rören centrifugerades för att av- lägsna protein och celldebris. 5 ml vatten sattes till super- natanten följt av 0,5 ml av en mättad vattenlösning av NaCl. pH justerades därefter till 6,8 genom droppvis tillsats av 2 M KH2PO4. Det vattenhaltiga acetonextraktet påfördes där- efter på en C8 Baker Prep kolonn. Kolonnerna torkades och tvättades därefter med 2 ml vatten. Tetrapyrrolerna eluerades 505 958 med 3 ml 90/10 CH3OH/H20. Såsom i exempel 1 genomfördes samt- liga dessa extraktionsförfaranden väsentligen enbart under icke-protoporfrin IX-exciterande ljus (t.ex. grönt ljus) eller i mörker (t.ex. i opaka täckta behållare). Extraktens fluorescens fastställdes därefter på en SPEX spektrofluoro- meter. Protoporfyrin IX ("Proto IX") ackumulering kvantifiera- des med användning av förbestämda extinktionskoefficienter.
Resultaten framgår av tabell 2 nedan.
TABELL 2 Medeltillväxtinhibering och Proto IX ackumulation Mängd V Koncentration % tillväxt- Proto IX Relativ % Medel av medel (pm) inhibering (pmol)** Proto IX*** B 100 99 5,20 2364 100 106 2,71 1232 C 100 52 4,41 2005 C 10 -15* 0,57 259 C l -26* 0,19 86 * Negativa värden för “tillväxtinhibering" indikerar att tillväxt skedde.
** Medelmängd per 106 celler.
*** Procent kontroll.
En annan aspekt av föreliggande uppfinning hänför sig till framställningen av protoporfyrin IX (nedan "Proto IX"). Enligt denna aspekt växer eukarvota mikroalger heterotrofiskt i mörker (eller under non-Proto IX-exciterande ljus) i ett medium innehållande ett medel (beskrivet ovan) som inhiberar den enzymatiska överföringen av protoporfyrinogen till Proto IX. Mediumet eller algerna eller båda behandlas därefter för att extrahera Proto IX och separera detta från klorofyll, karotenoid och celldebris, etc. Separation kan ske på vilket som helst lämpligt sätt såsom genom flytande faskromatografi 505 938 16 innefattande omvänd fasvätskekromatografi eller genom lös- ningsmedelsextraktion eller genom utfällning av Proto IX genom kelatinering, som med en metall såsom Fe, Zn eller Mg, med avlägsnande av den erhållna kelatföreningen och, om så önskas, regenerering av Proto IX som genom känd behandling av kelatet med utspädd syra.
Separationsstegen genomföres under icke-Proto IX-exciterande ljus (såsom det gröna ljus som beskrivits i Appendix A under rubriken "mörker") eller i mörker. Järnkelatet är inte så ljuskänsligt så att exponering för ljus är mera tillåtlig när man hanterar detta material.
Mikroalgerna odlas företrädesvis som en cellsuspension vid en temperatur i området från ungefär 15 till 30OC. Kon- centrationen av det inhiberande medlet kan exempelvis vara ungefär 10-5 till 10-7 M. Exempel på mikroalger som kan an- vändas är Scenedesmus sp., Chlamydomonas reinhardi, Euglena sp. och Bumilleriopsis filiformis.
Exempel 3 Logfaskulturer av Chlamydomonas reinhardi (vildtyp) subodlas i kar av rostfritt stål (t.ex. 300 l) med användning av det nedan beskrivna odlingsmediumet. En acetonlösning av l-(karb- etoxi)etyl-5-(2-k1or-4-trifluormetylfenoxi)-2-nitrobensoat (laktofen, en kommersiell fenyleterherbicid) tillsättes för att ge en koncentration av 10-5 M och en slutkoncentration av aceton av O,l%. Denna blandning får växa i mörker vid 25OC i fyra till sju dagar under mild omröring och/eller luftning.
Under upprätthållande av mörker filtrerades innehållet i karet och filtratet behandlas för att återvinna protopor- fyrinet IX däri.
Ett behandlingssätt för att återvinna protoporfrin IX är att filtrera innehållet i reaktionskaret (under upprätthållande av mörker) och sätta aceton till filtratet. Denna blandning 505 95 17 extraheras med petroleumeter. Den vattenhaltiga acetonbland- ningen extraheras därefter med dietyleter och dietyletern av- lägsnas genom indunstning och ger en rest. Denna rest upplöses i metanol och underkastas omvänd faskromatografi för att ge protoporfrin IX. Även de âtervinningsmetoder som beskrivits i exemplen l och 2 kan användas.
Sammansättning av medium Salter Molaritet Förråd ml förråd/l Na citrat-enzo 1.7 X 10'3M 10% 5 spârmetaller som nedan som nedan 10 Fec13-euzo 0,37 X 10'3M 1% 1 cac12-2H2o 0,36 X 10'3M s,3% 1 mgso4-vnzo 1,2 X 10::M 10% 3 NH4No3 3,7 X 10 M 10% 3 xn2Po4 2,2 X 10'3M 10% 3 K2HPo4 1,7 X 10'3M 10% 3 cH3co2Na 7,5 X 10'3M 10% 10 Förråd av spårmetallblandning H3BO3 100 mg/l ZnSO4-7H2O 100 mg/l MnSO4-4H2O 40 mg/l CoCl2-6H2O 20 mg/l NaMo04-2H2O 20 mg/l CuSO4 4 mg/l Ett alternativ till användning av Chlamydomonas reinhardi är att använda Scendesmus sp. odlad på det ovan angivna mediumet och att ersätta natriumacetat med glukos.
Exempel 4 Detta exempel är samma som eáempel 3 förutom att den herbicida föreningen l-(4-klor-2-fluor-5-propargyloxifenyl)-3-metyl-4- 505 958 18 - 2 . . u . N N difluormetyl-A.-l,2,4-triazolin-5-on anvandes 1 stallet for laktofen.
Exemgel 5 Bestämning av I50 Protoporfyrinogen IX ("Protogen IX"). Proto IX såld från Porphyrin Products, Logan, UT och renad som angetts av T. P.
Fuesler et al., Plant Physiol., 67, 246-249 (1981). Protogen IX nyframställdes genom reduktion av Proto IX med ett Na/Hg- amalgam som beskrivits av N. J. Jacobs och J. M. Jacobs, Enzyme, 28, 206-219 (1982), med användning av renat Proto IX vid en koncentration av 300 pm.
Växtmaterial. Gurka (Cucumis sativus L. cultivar "Wisconsin SMRl8') odlades i en mörk tillväxtkammare på vermikulit be- vattnad med ett kommersiellt (9-45-15) gödningsmedel. Grod- derna växte vid 25°c och en teietiv fuktighet av sn till 90%.
Intermittent belysning, en minuts ljus per 60 minuters cykel med en mätt intensitet av 25 pE/m_2 sek-1 (PAR) tillhandahölls genom en General Electric "Bright Stick" kontrollerad med en elektronisk timer. Detta gav vävnad med förmåga till snabb klorofyllsyntes under det att stärkelsereserver och initial- klorofyllnivåer minimerades.
Kloroplastisolering. Utvecklande kloroplaster isolerades så- som beskrivits av T. P. Fuesler et al., Plant Physiol., 75, 662-664 (1984), förutom att i det slutliga reningssteget centrifugerades plastider genom en 40% snarare än 45% (vo1ym/ volym) Percoll-kudde. Kloroplasterna återsuspenderades i en analysbuffert innehållande 0,5 M mannitol, 20 mM TES, 10 mM HEPES, pH 7,7, 1 mM EDTA, l'mM MgCl2, 1% (vikt/volym) bovin- serumalbumin och l mM ditioerytritol till en slutkoncentra- tion av 2 mg protein/ml. 505 938 19 Analys av protoporfyrinocen-oxidas. Analyser genomfördes såsom angivits av J. M. Jacobs och N. J. Jacobs, Arch. Biochem.
Biophys., 229, 312-319 (1984). Prov (0,2 ml) av kloroplast- suspensionen preinkuberades i mörker i l5 minuter med olika koncentrationer acefluorfen-metyl ("AFM") eller med 0,2% (volym/volym) aceton (såsom "kontroll“). Därefter tillsattes 50 ul nyframställd protogen (ungefär 15 nM) till suspensionen för att initiera reaktionen. Analyser upphörde genom tillsats av 2,75 ml av det fluorometriska mediumet av N. J. Jacobs och J. M. Jacobs, Enzyme, 28, 206-219 (l982) bestående av 1% (volym/volym) Tween-20 (polyoxietylensorbitanmonolaurat), 50 mM tris-HCl, pH 8,5, l mM EDTA; l mM ditioerytritol er- sattes med 5 mM glutatjon. Suspensionerna avlästes därefter direkt på en SPEX Fluorolog-2 spektrofluorometer utrustad med "frontface" fluorescens-option för grumliga biologiska prov.
Mängden Proto IX som alstrades kvantifierades från en standard- kurva (en mängd Proto IX mot emission vid 630 nm, vid excitering vid 400 nm) alstrad av renat Proto IX i fluoro- metriskt medium.
För att fastställa mängden icke-enzymatisk oxidation till Proto IX i den ovan angivna analysen, genomfördes samma analys förutom att i stället för suspensionen av aktiva kloroplaster användes en suspension vari kloroplasterna hade inaktiverats genom upphettning i 15 minuter vid 85°C. Om man subtraherade mängden Proto IX som sålunda framställts från den mängd som framställts i närvaro av de aktiva kloroplasterna erhölls mängden Proto IX som bildats enzymatiskt. Resultaten visas grafiskt i figur 1 (vari LSD indikerar minsta signifikanta skillnad, som är konventionell). Figur 1 visar att Iso-värdet (koncentrationen som ger 50% inhibering) är mindre än 0,1 pm, d.v.s. ungefär 0,03 pm.
Analys av effekten av 10 um AFM på enzymatisk överföring av Proto IX till magnesium Proto IX i kloroplastsuspensionen (i närvaro av ATP) visade att AFM inte hade någon inhiberande effekt på denna överföring. 505 958 Exempel 6 I detta exempel sattes de enzym-inhiberande medlen till föda hos tumörbärande möss; för vissa av mössen, som användes som kontroll, sattes inget medel till födan. Mössen avlivades där- efter och deras njurar, inälvor, binjurar, lever och tumör avlägsnades och analyserades med avseende på deras halt av Proto IX. Följande enzym-inhiberande medel användes: Ga 505 938 21 Mera detaljerat var mössen DBA/2 Ha-möss som injicerats med SMT-F subkutana tumörer dag 0 i högra skuldran. Mössen, som förvarades individuellt fick obehandlad Purina Rodent Chow 5001 Mash dag l, därefter fick mössen från dag 2 till 10 samma Mash behandlad med 2000 ppm av det inhiberande medlet som testades (eller för kontrollerna samma obehandlade Mash). Be- handlingen av Mash âstadkoms genom att man blandade detta med en liten mängd av en acetonlösning av medlet som skulle testas.
Mössen avlivades därefter dag 10 förutom den mus 'som behandlats med det medel som angivits som 6j; den senare avlivades dag 7.
Vävnaden kyldes vid 4°C över natten, torkades därefter torr och den färska vikten hos varje vävnadsprov noterades. Vävna- derna homogeniserades därefter i 5 ml, eller 10 ml i fallet med inälvor och lever, av aceton-0,1 N NH4OH (9:l, volym/volym).
Homogenaten centrifugerades därefter vid 1500 g och superna- tanterna analyserades på en SPEX FAll2 spektrofluorometer; excitering 400 nm, emission 630 nm våglängd, optimum för Proto IX. Proto IX ackumulation fastställdes som CPS (fluor- escenspulser emitterade per sekund) per gram vävnad. Resulta- ten anges nedan (resultaten-är medel för tvâ möss för varje behandling, utom för behandlingarna med medlen 6f, 6h, 6i och 505 958 22 6j där i var och en endast en mus behand1ades): Proto IX medel Cps per gram x 103* Tumörvikt Medel Tumör Lever Njure Binjurar Inälvor som exciderad (mg) 6a 1203 4291 10817 6572 5870** 143 6b 1520 1261 2441 2529 5577** 90 6c 14336 2739 16186 13790 9937** 157 6d 2006 1581 12865 443 4465** 294 6e 837 876 915 1331 2069** 165 6f 449 1170 661 5611 1157 69 6g 166 803 606 1984 466 250 6h 298 914 585 2259 584 192 6i 932 1510 4014 36940 3454 20 6j 1251 538 315 491 572 11 Kontr. 239 536 494 1504 233 200 424** * Siffrorna i tabellen motsvarar rådata x 10- 3 ** Mätningarna gjordes på prov spädda med 3 delar basisk aceton till en del prov.
Dessa siffror motsvarar följande koncentrationer av Proto IX i respektive vävnad, uttryckt som pg Proto IX per gram vävnad: 505 958 23 gedel Égmër Egyer Njurar Binjurar Inälvor 6a ll 39 99 60 54 6b 14 12 22 23 51 6c 131 25 148 126 91 6d 18 14 117 4 51 6e 8 8 8 12 19 6f 4 ll 6 51 11 6g 2 6 18 4 6h 3 5 21 5 6i 9 14 37 337 32 6j 11 4 5 Kontroll 2 14 Artikeln av Dougherty anförd ovan ger en siffra av 3,6 pg/g gför koncentrationen av porfyrin i samma typ (SMT-F) av tumör efter injektion av 10 mg/kg hematoporfyrinderivat i samma typ (DBA/2 Ha) av mus. Annan teknisk litteratur (Moan et al P&P 46-5, sid. 713-721; jmf. fig. 2 på sidan 716) indikerar att en koncentration av ungefär 12 gg/g av porfyriner uppnåtts i tumörerna (C3H/Tif mammarkarcinoma), i DBA(H2 möss efter intra- peritoneal injektion av 25 mg/kg Photofrin II, det allmänt använda sensibiliseringsmedlet för fotodynamisk behandling och detektion av cancer.
De totala mängderna av föda innehållande medel som konsume- rats av mössen var följande: 6a, 22 och 35 g; 6b, 37 och g; 6c, 25 och 22 g; 6d, 41 och 32 g; 6e, 40 och 44 g; 6f,27 g; 6g, 33 och 40 g; 6h, 36 9; 6i, 10 g; 6j, 20 g.
Vid framställning förförsöken beskrivna i detta exempel 6 genomfördes följande rutinsteg med användning (om icke annat anges) av medlet som benämnts 6c i detta exempel med icke- tumörbärande djur: a. LDSO för medlet fastställdes vara över 2600 mg/kg (d.v.s. mg medel per kg kroppsvikt) för råttor (bestämd under en 14-dagars period efter en enkel oral dos innefattande majs- 505 938 24 Olja innehållande 15% av medlet) och över 700 mg/kg för mus (bestämd under en 14-dagars period efter en enkel oral dos innefattande majsolja och 5% av medlet). b. I test av vehiklar för injektion intraperitonealt, utan medel, fastställdes det att mössen kunde tolerera injektioner av en 0,5 ml dos av en blandning av lika delar DMSO (dimetyl- sulfoxid) och vatten. c. I test av medlet injicerat intraperitonealt i en blandning av 60% majsolja och 40% DMSO fastställdes det att mössen kunde tolerera en dos av 100 mg/kg. d. Följande försök genomfördes med mus: i. daglig oral tillförsel av 50 mg/kg (med användning av en 1%-ig lösning av medlet i aceton) i 8 dagar; ii. daglig I.P. injektion av 50 mg/kg (med användning av en l%-ig dispersion av medlet i mineralolja, tillverkad genom upplösning av medlet i en droppe DMSO och blandning av den erhållna lösningen med mineralolja) i 8 dagar; iii. daglig topisk applikation till huden av 50 mg/kg (med användning av en 1%-ig lösning i DMSO) i 8 dagar; iv. utfodring i 8 dagar av ett standardfoder i vilket 2000 ppm av medlet införlivats, baserat på vikten av fodermedlet; v. daglig I.V. injektion av 50 mg/kg (med användning av en 2%-ig lösning i DMSO) i 4 dagar.
Mössen som användes i dessa försök dödades därefter och deras vävnad undersöktes avseende Proto IX ackumulering.
I ett annat test matades Fisher 344 råttor av hankön i 27 dagar med fodermedel innehållande 5000 ppm av medel 6c och dödades därefter. Vävnaderna hos denna råtta visade ökade nivåer av Proto IX i jämförelse med en kontroll med en marke- rad ökning i nivån i njurarna, inälvorna, magen och hjärnan och endast en liten ökning i muskelvävnadsnivån.
I föregående test av råttor och möss hölls djuren vid en standard 12 timmar mörker-12 timmar ljus-cykel.
Exempel 7 I en serie försök enligt uppgifterna i exemplen l och 2 inku- berades kulturer av HeLa-celler i närvaro av 100 um av olika behandlingsmedel som uppräknas nedan, De givna procentupp- gifterna, bredvid varje behandlingsmedel, indikerar ökningen i mängden alstrad Proto IX i närvaro av detta behandlings- medel i förhållande till den mängd som produceras av kontrol- len i nämnda försök.
Medel använda i exempel 6: 6a, 337%; 6b, 366%; 6c, 297%; 6d, l200%; 6e, l2l0%; 6f, 280%; 6g, 326%; 6h, 431%; 6i, 544%; 6j, 469%. Övriga medel: ; Fia» *än ”àïkï ms F CEECH 3 O " ZÉZ 0 \ 136% .
CHa 7! . va. F O 1- F: F blå/ggr: F F F å-Kc-cn 'ä æz nsz 505 958 26 “Ha soaz 9"” Exempel 8 I detta exempel utfodrades det enzym-inhiberande medlet 6c i exempel 6 till råttor, tumörer implanterades i råttorna och den tumörbärande zonen exponerades för ljus och medförde regression av tumörerna.
Specifikt placerades tre Sprague-Dawley-råttor med en medel- vikt av 120 g på en diet av fodermedel innehållande 2000 ppm av medlet under en period av 6 dagar. Dag 3 implanterades kondrosarcoma i den högre bakre extremiteten hos varje råtta genom injektion av 0,3 ml av en suspension av tumörcellerna (en miljon tumörceller). Dag 6 rakades den högre bakre extre- miteten hos varje råtta och depilerades varvid storleken av varje tumör mättes och tumörarean och omgivande hud utsattes därefter för icke-termala doser av 630 nm ljus vid totalt 270 J/cm2. Nästa dag befanns tvâ av râttorna vara uppenbarligen 505 938 27 fria från tumörer (d.v.s. ingen palperbar tumörmassa) och den tredje råttan visade nästan fullständig regression av sin tumör. Den omgivande hud- och muskel-vävnaden hos råttorna var något blanka och visade en viss svällning, signifikant mindre än den som uppkommer med Photofrin II-medierad foto- dynamisk terapi.
Appendix A Procent utflödestest Procenten utflödestest använde kotyledoner skördade från etiolerade gurkgroddar. I ett initialsteg behandlades en kotyledonmassa i mörker med en vattenhaltig buffrad lösning innehållande ett radiomärkt socker. Mängden socker som upp- togs av kotyledonerna mättes därefter (genom pulsräkning såsom beskrivits nedan). Massan av kotyledoner uppdelas därefter i två portioner; en portion av kotyledonerna behand- las i mörker med en vattenhaltig buffrad lösning innehållande föreningen som skall testas under det att den andra portionen behandlades på samma sätt, i mörker med en i övrigt identisk lösning utan testföreningen som kontroll. Kotyledonerna, i kontakt med vattenlösningarna, exponerades därefter för ljus i 16 timmar och avskiljdes därefter från vattenlösningarna; de senare mättes därefter (genom pulsräkning) för att fast- ställa deras halt av radiomärkt material. Resultaten uttrycks som procent utflöde som beräknas enligt följande vari S är det antal (the count) radiomärkt material (per kotyledon) som tas upp av kotyledonerna vid deras initialbehandling, ST är antalet radiomärkt material (per kotyledon) i vattenlösningen innehållande föreningen som skall testas efter exponering för ljus och SC är antalet radiomärkt material (per kotyledon) i vattenlösningen av kontrollen efter exponering för ljud: ST minus SC Procent utflöde = S 505 958 28 Mera specifikt användes följande material och betingelser i procentutflödestestet: Växtmaterial: Gurkfrön (Cucumis sativus L. cultivar 'Wisconsin SMR ll8') groddades och växte i vermikulit bevatt- nad med ett kommersiellt (9-45-15) gödningsmedel. Groddarna växte vid 25oC och 80-90% relativ fuktighet i mörka inkuba- tionskamrar. Kotyledonerna skördades från de etiolerade groddarna fem dagar efter planteringen och sköljdes i 1,0 mM CaCl2 allt under grönt ljus.
Buffrad lösning: l mM KCl, l mM CaCl2 och 2,0 mM kalium- fosfat, justerat till pH 6,5 (såsom med NaOH).
Radiomärkt socker: 3-O-metyl-3-/U-l4C/glukos med specifik aktivitet 10,9 GBg/mmol (Amersham Corp., Arlington Heights IL).
Initialbehandling: tvättade kotyledoner (180 till 230) sattes till en 250 ml vidhalsad skum-stoppad Erlenmeyer-kolv inne- hållande 50 ml av den buffrade lösningen och det radiomärkta sockret tillsattes i en mängd som gav en koncentration av 600 nM därav i lösningen. Kolven skadades i 24 timmar vid 125 varv per minut på en roterande skakare i mörker. Kotyledo- nerna âtervanns därefter på ett nylonnät och sköljdes tre gånger i 20 ml volymer av l mM CaCl2. Upptagningen av det radiomärkta sockret mättes genom digestering av tre prov av fem kotyledoner vardera i NCS-vävnadssolubiliseringsmedel (Amersham Corp.) och räkning av det resulterande maceratet i en vätskescintillationsspektrometer. (Resultaten från dessa digesteringar befanns vara ekvivalenta till samma bestämning gjord genom förbränning av kotyledonprov i en autooxiderings- anordning.) Behandling med föreningen som skall testas (och kontroll- behandling): Fem av kotyledonerna får flyta (abaxiala sidan upp, på 3 ml 505 938 29 av den buffrade lösningen i en 35 mm diameter täckt plast- petriskâl. Testföreningen tillsättes därefter (som en lösning därav av aceton) i en sådan mängd så att man fick en förbe- stämd koncentration (diskuterad nedan) av testföreningen i den buffrade lösningen; acetonkoncentrationen i den buffrade lösningen är då 0,l% (volym/volym) i kontrollen liksom i lös- ningen innehâllande testföreningen. De flytande kotyledonerna omröres därefter genom skakning av skålarna vid 90 varv per minut på ytan av en roterande skakanordning i 16 timmar.
Exponering för ljus: Skålarna innehållande kotyledonerna som flöt i lösningarna exponerades i 16 timmar för belysning tillhandahållen genom fyra GE F20Tl2-CW fluorescens-lampor vid en mätt intensitet av 150 uE m_2 sek_l i den fotosyntetiskt aktiva regionen av spektrumet (PAR) (mätt vid ytan av koty- ledonerna) under det att skålarna skakades.
Mätning av mängden radiomärkt material i vätskan: Samtliga vätskor separeras från kotyledonerna och räknas därefter i en flytande scintillationsspektrometer.
Mörker: All behandling innan illumineringsstegen genomföres i mörker eller under grönt fluorescerande ljus (d.v.s. ljus filtrerat genom ett grönt plastavskärningsfilter som passerar ljus av 450-600 nm). 505 938 Appendix B Odlinqsmedium Medium g Salter Molaritet Förråd ml förråd/l Na citrat-snzo 1,7 X 10'3M 10% 5 spårmetaller enl. nedan enl. nedan 10 Fec13-eazo 0,37 X 10'3M 1% 1 cac12-2H2o 0,36 X 10"3M 5,3% 1 Mqso4-vnzo 1,2 X 1o'3M 10% 3 101141105 3,7 X 10'3M 10% 3 KHZPO4 2,2 X 1o'3M 10% 3 KZHPQ4 1,7 X 1o"3M 10% 3 Förråd av soårmetallblandning H3BO3 100 mg/1 ZnSO4-7H2O 100 mg/l MnSO2-4H2O 40 mg/l CoCl2-6H2O 20 mg/l NaMoO4-2H20 20 mg/l CuSO4 4 mg/l Kulturmedium A framställdes genom tillsats av 10 ml/l av en vattenhaltig 10%-ig natriumacetatlösning (7,5 x l0_3M) till medium M.
Komponenterna sättes till destillerat vatten i den order som uppräknas nedan och autoklaveras vid 15 psi i 15 minuter.
Förrådskulturer odlade i närvaro av ljus Förrâdskulturer av y-l-celler hålles axenikalt i vätske- kulturer på medium A eller M, företrädesvis på medium M, i en 14/l0 timmar ljus/mörker-cykel vid 25OC i Erlenmeyer- 505 958 31 kolvar vilka är förslutna med polyuretankroppar. Förråds- kulturerna inkuberas utan supplementär syresättning på rota- tionsskakare vid l25 varv per minut. Ljusintensiteten vid odlingsnivân är l20 “E m-2 sek_l (PAR). Under dessa betingel- ser är kulturerna i semi-synkron tillväxtfas tills de nått en stationär fas av 2-4 x 106 celler/ml.
Kulturer växta utan ljus (mörker-växtkultur) Celler från den stationära fasen av förrådskulturerna växta i närvaro av ljus (7,5 ml) överföres till 750 ml medium A i en Erlenmeyer-kolv. Cellerna inkuberas i mörker under syre- sättning genom ett nedsänkt syresättningsrör vid 25°C i tre till fyra dagar. Under denna period underkastas denna kultur av y-l-celler sju till åtta celldelningar och för- lorar all synlig klorofyll och koncentrationen bör vara 2-3 x 106 celler/mi.
Preparation av celler för användning i analys Celler skördades från en nyframställd kultur som växt i mörker (750 ml) genom lâghastighetscentrifugering, d.v.s. ungefär 2000 varv per minut, i ungefär 5 minuter vid ungefär 20°C.
Cellerna âtersuspenderas försiktigt i 50 ml av medium A. Ett prov av denna suspension (ungefär 0,25 ml) skall undersökas med avseende på motilitet och, efter fixering med en vatten- haltig, 1%-ig glutaraldehydlösning, gjordes en cellräkning för att fastställa antalet celler/ml. En normal cellräkning är ungefär 5 x 107 celler/ml. Prov av l ml (107 celler/ml) placeras i testkärlen (t.ex. Falco 24-brunnarsvävnads- kulturplattor). Vid denna tidpunkt är cellerna väldigt rörliga och gulfärgade.
Testföreningen upplöses i ett lösningsmedel (aceton, etanol, dimetylsulfoxid eller vatten, företrädesvis aceton) för att ge en koncentration som är 1000 gånger slutkoncentrationen.
Ett pl av denna testlösning sättes till var och en av tvâ 0505 938 32 brunnar med en 5 eller 10 gl mikrospruta.
Fyra kontrollbrunnar per vävnadskulturplatta prepareras på ovan beskrivet sätt utan närvarande testförening. Vävnads- kulturplattorna täckes med ett transparent plastöverdrag och placeras i en tillväxtkammare med en ljusintensitet av 70 - 90 ns m'2 sek'l i 13-16 timmer vid 25°c. om innehållet i test- brunnarna förefaller gult extraheras de såsom beskrivits i utvärdering av resultatsektionen nedan. Om innehållet i test- brunnarna förefaller transparent eller är ljusgrönfärgad placeras de på en roterande skakare vid ungefär 125 varv per minut och bestrålas i två timmar med en ljusintensitet av ungefär 600 pE m_2 sek_l innan de extraheras.
Utvärdering av resultat En vattenhaltig, 10%-ig natriumdodecylsulfatlösning (250 pl) och metanol (1 ml) sättes till varje testbrunn och blandas noggrant. Blandningen får stå i mörker i 3 till 4 timmar. Väv- nadsodlingsplattorna centrifugeras vid rumstemperatur vid låg hastighet (ca. 2000 varv per minut) i 5 minuter. Supernatan- terna avlägsnas och analyseras i en spektrofotometer av Beckman modell 35 med 350 nm och 500 nm med avseende på när- varon av protoporfrin IX vid 668 nm som är absorptionstoppen av klorofyll i detta lösningsmedelssystem och vid 720 nm till användning som en grumlig bakgrundsavläsning.
Analvs av data För varje brunn erhålles ett grönhetsvärde genom att man subtraherar 720 nm avläsningen från 668 nm avläsningen. Dessa värden är medeltalet för varje koncentration av förening som skall testas och för kontrollen. Procenten inhibering är 100 X (1 _ medelgrönhetsvärdet för den speciella koncentrationeuä medelgrönhetsvärdet för kontrollen
Claims (16)
1. l. Farmaceutisk komposition till användning vid fotodynamisk behandling eller detektion av tumörer, vilken komposition k ä n n e t e c k n a s av en förening, som är en specifik inhibitor av den enzymatiska överföringen av protoporfyrinogen till protoporfyrin IX genom protoporfyrinogenoxidas, vilken förening har ett 150 för protoporfyrinogenoxidas av mindre än l pM och att nämnda komposition även innefattar en farmaceu- tiskt godtagbar vehikel.
2. Farmaceutisk komposition till användning vid fotodynamisk behandling eller detektion av tumörer, vilken komposition .k-ä n n e t e c k n a s av en förening, som är en specifik inhibitor av den enzymatiska överföringen av protoporfyrinogen till protoporfyrin IX genom protoporfyrinogenoxidas, att föreningen inte är en tetrapyrrol och har en redoxpotential som är mer negativ än -S00 mV, och att kompositionen även innefattar en farmaceutiskt godtagbar vehikel.
3. Inhibitor av den enzymatiska överföringen av protoporfyri- nogen till protoporfyrin IX genom protoporfyrinogenoxidas, vilken inhibitor är en specifik inhibitor med ett Iso för protoporfyrinogenoxidas av mindre än l pM,för terapeutisk användning.
4. Inhibitor av den enzymatiska överföringen av protoporfy- rinogen till protoporfyrin IX genom protoporfyrinogenoxidas, vilken inhibitor är en specifik inhibitor och har ett 150 för protoporfyrinogenoxidas av mindre än l pM,till användning vid fotodynamisk behandling av tumörer. 505 958
5. Inhibitor av den enzymatiska överföringen av protoporfyri- nogen till protoporfyrin IX genom protoporfyrinogenoxidas, vilken inhibitor är en specifik inhibitor och inte en tetra- pyrrol och har en redoxpotential mer negativ än -500 mV,för terapeutisk användning.
6. Inhibitor av den enzymatiska överföringen av protoporfyri- nogen till protoporfyrin IX genom protoporfyrinogenoxidas, vilken inhibitor är en specifik inhibitor och inte är en tetrapyrrol och har en redoxpotential mer negativ än -500 mV, till användning vid den fotodynamiska behandlingen av tumörer.
7. Inhibitor enligt nágot av patentkraven 3-6, vilken utgör 1- (4-klor-2-fluor-5-propargyloxifenyl)-3-metyl-4-difluormetyl- A2-1,2,4-triazolin-5-on.
8. Inhibitor enligt patentkravet 4 eller 6, bestående av en aryltriazolinon, en aryltetrazolinon, en aryltriazindion, en aryloxadiazol, en aryltetrahydroindazol, en aryltetrahydro- ftalimid, en arylhydantoin, en arylurazol, en arylhexahydro- pyridazin, en arylheterocyklisk uretan, en fenoxifenylföre- ning, en arylpyrazol eller en förening med formeln ph_ Ph eller b o vari Xb är 0 eller S och "Ph" är en substituerad fenyl.
9. Inhibitor enligt patentkravet 8, i vilken arylgruppen har en substituent, som är en sur sulfonamidgrupp eller ett vat- tenlösligt salt därav. “fïïï 505 958
10. Inhibitor enligt patentkravet 9, bestående av en aryltria- zolinon.
11. ll. Inhibitor enligt patentkravet 10 med formeln _01 Q F 01 k få
12. Inhibitor enligt patentkravet 8 i en oralt godtagbar vehikel. _
13. Inhibitor enligt patentkravet 8 i sterilt tillstànd.
14. Inhibitor enligt patentkravet 8 till användning genom oral administration, vid den fotodynamiska behandlingen av tumörer, vilken inhibitor utgör ett vattenlösligt salt eller en sur förening, som bildar ett vattenlösligt natrium- eller kalium- salt.
15. Användning av en förening som är en specifik inhibitor av den enzymatiska överföringen av protoporfyrinogen till pro- toporfyrin IX genom protoporfyrinogenoxidas, vilken förening har ett 150 för protoporfyrinogenoxidas av mindre än l pM för framställning av en farmaceutisk komposition för fotodynamisk behandling eller detektion av tumörer.
16. Användning enligt patentkravet l5 av en förening som är en förening, som är en specifik inhibitor av den enzymatiska överföringen av protoporfyrinogen till protoporfyrin IX genom protoporfyrinogenoxidas, varvid föreningen inte är en tetra- pyrrol och har en redoxpotential som är mer negativ än -500 mV.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US28515188A | 1988-12-12 | 1988-12-12 | |
US33500789A | 1989-04-07 | 1989-04-07 | |
US35133189A | 1989-05-03 | 1989-05-03 | |
PCT/US1989/005599 WO1990006748A2 (en) | 1988-12-12 | 1989-12-08 | Use of certain herbicides in cancer treatment and production of protoporphyrin ix |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE9101807D0 SE9101807D0 (sv) | 1991-06-12 |
SE9101807L SE9101807L (sv) | 1991-06-12 |
SE505938C2 true SE505938C2 (sv) | 1997-10-27 |
Family
ID=27403508
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE9101807A SE505938C2 (sv) | 1988-12-12 | 1991-06-12 | Protoporfyrinogen inhibitorer och användning därav i kompositioner för att detektera och behandla tumörer |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0447491B1 (sv) |
JP (1) | JP2545000B2 (sv) |
KR (1) | KR930003116B1 (sv) |
AR (1) | AR243605A1 (sv) |
AT (1) | AT400520B (sv) |
AU (1) | AU633537B2 (sv) |
BR (1) | BR8907817A (sv) |
CA (1) | CA2004979A1 (sv) |
CH (1) | CH681779A5 (sv) |
DE (2) | DE3991484C2 (sv) |
DK (1) | DK110791A (sv) |
EG (1) | EG18822A (sv) |
ES (1) | ES2051675T3 (sv) |
FI (1) | FI912784A0 (sv) |
GB (1) | GB2247404B (sv) |
GR (1) | GR1000609B (sv) |
HU (1) | HUT58202A (sv) |
IE (1) | IE62621B1 (sv) |
IL (1) | IL92622A (sv) |
LU (1) | LU87949A1 (sv) |
LV (1) | LV10303B (sv) |
MC (1) | MC2171A1 (sv) |
NO (1) | NO912228D0 (sv) |
NZ (1) | NZ231658A (sv) |
OA (1) | OA09362A (sv) |
PT (1) | PT92546B (sv) |
SE (1) | SE505938C2 (sv) |
WO (1) | WO1990006748A2 (sv) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5298502A (en) * | 1988-12-12 | 1994-03-29 | Fmc Corporation | Method and composition for photodynamic treatment and detection of tumors |
US5132101A (en) * | 1990-05-04 | 1992-07-21 | Cytopharm, Inc. | Acetylene-cumulene porphycene compounds for photodynamic therapy |
US5244671A (en) * | 1991-01-29 | 1993-09-14 | Cytopharm, Inc. | Derivatives of porphycene for photodynamic therapy of cancer |
US5179120A (en) * | 1991-06-28 | 1993-01-12 | Cytopharm, Inc. | Porphycene compounds for photodynamic therapy |
TW492975B (en) * | 1993-07-26 | 2002-07-01 | Novartis Ag | Tryptase inhibitor |
GB9318841D0 (en) * | 1993-09-10 | 1993-10-27 | Res Foundation Of The Norwegia | Composition |
US6023012A (en) * | 1996-02-28 | 2000-02-08 | Novartis Finance Corporation | DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase |
US5767373A (en) | 1994-06-16 | 1998-06-16 | Novartis Finance Corporation | Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms |
US5939602A (en) * | 1995-06-06 | 1999-08-17 | Novartis Finance Corporation | DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof |
US6084155A (en) * | 1995-06-06 | 2000-07-04 | Novartis Ag | Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes |
BR9707783A (pt) * | 1996-02-28 | 1999-07-27 | Novartis Ag | Promotores provenientes de genes para protoporfirnogênio oxidase em vegetais |
JPH10330359A (ja) * | 1997-03-31 | 1998-12-15 | Nippon Bayeragrochem Kk | フエニルアセチレン誘導体及び除草剤 |
DE102005017152B4 (de) * | 2005-04-13 | 2007-02-08 | Lindauer Dornier Gmbh | Verfahren zum Trocknen von vorzugsweise plattenförmigen Produkten und Durchlauftrockner in Mehretagenbauweise |
SI2443102T1 (sl) | 2009-06-19 | 2013-08-30 | Basf Se | Herbicidni benzoksazinoni |
EP2496573B1 (en) * | 2009-11-02 | 2015-07-01 | Basf Se | Herbicidal tetrahydrophthalimides |
CN103221409B (zh) * | 2010-10-01 | 2016-03-09 | 巴斯夫欧洲公司 | 除草的苯并*嗪酮类 |
EP2651226B1 (en) | 2010-12-15 | 2016-11-23 | Basf Se | Herbicidal compositions |
CN102875569A (zh) * | 2012-09-27 | 2013-01-16 | 南开大学 | 具有除草活性和抗肝癌活性的异噁唑并嘧啶酮(或三嗪酮)类化合物 |
US11185075B2 (en) * | 2016-12-16 | 2021-11-30 | Basf Se | Herbicidal phenyltriazolinones |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4393071A (en) * | 1975-03-17 | 1983-07-12 | Naoharu Fujii | Method of treating gastric, mammary, lung and uterus tumors |
US4404019A (en) * | 1980-12-24 | 1983-09-13 | Sumitomo Chemical Company, Limited | 3-Chloro-1-phenyl-1,2,4-triazolin-5-ones and their use as herbicides |
CH651029A5 (de) * | 1980-12-25 | 1985-08-30 | Nihon Nohyaku Co Ltd | Triazolin-derivate, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende herbizide mittel. |
JPS60190711A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-28 | Tokyo Tanabe Co Ltd | プロトポルフイリン類注射用製剤 |
US4755217A (en) * | 1987-01-15 | 1988-07-05 | Fmc Corporation | Triazinedione herbicides |
US4761174A (en) * | 1987-04-14 | 1988-08-02 | Fmc Corporation | Triazolin-5-one herbicides |
-
1989
- 1989-12-06 NZ NZ231658A patent/NZ231658A/en unknown
- 1989-12-07 IE IE392589A patent/IE62621B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-12-08 MC MC89@@D patent/MC2171A1/xx unknown
- 1989-12-08 BR BR898907817A patent/BR8907817A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-12-08 ES ES90901350T patent/ES2051675T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-08 KR KR1019900701747A patent/KR930003116B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-12-08 JP JP2501659A patent/JP2545000B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-08 DE DE3991484A patent/DE3991484C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-08 CH CH2658/90A patent/CH681779A5/de unknown
- 1989-12-08 HU HU901144A patent/HUT58202A/hu unknown
- 1989-12-08 DE DE19893991484 patent/DE3991484T/de active Pending
- 1989-12-08 CA CA002004979A patent/CA2004979A1/en not_active Abandoned
- 1989-12-08 EP EP90901350A patent/EP0447491B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-08 AT AT0903489A patent/AT400520B/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-08 AU AU48222/90A patent/AU633537B2/en not_active Ceased
- 1989-12-08 WO PCT/US1989/005599 patent/WO1990006748A2/en active Application Filing
- 1989-12-10 IL IL9262289A patent/IL92622A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-12-11 AR AR89315638A patent/AR243605A1/es active
- 1989-12-12 GR GR890100817A patent/GR1000609B/el unknown
- 1989-12-12 PT PT92546A patent/PT92546B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-12-21 EG EG60989A patent/EG18822A/xx active
-
1991
- 1991-05-15 GB GB9110472A patent/GB2247404B/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-06-10 FI FI912784A patent/FI912784A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-06-11 NO NO912228A patent/NO912228D0/no unknown
- 1991-06-11 DK DK110791A patent/DK110791A/da unknown
- 1991-06-12 OA OA60016A patent/OA09362A/xx unknown
- 1991-06-12 SE SE9101807A patent/SE505938C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1991-06-12 LU LU87949A patent/LU87949A1/fr unknown
-
1993
- 1993-09-09 LV LVP-93-1060A patent/LV10303B/lv unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SE505938C2 (sv) | Protoporfyrinogen inhibitorer och användning därav i kompositioner för att detektera och behandla tumörer | |
US5407808A (en) | Method and composition for photodynamic treatment and detection of tumors | |
US5298502A (en) | Method and composition for photodynamic treatment and detection of tumors | |
Subash et al. | Morin a flavonoid exerts antioxidant potential in chronic hyperammonemic rats: a biochemical and histopathological study | |
KR20010020611A (ko) | 항산화제에 의한 과증식질병 치료의 향상 | |
US4898878A (en) | Antioxidant thiohistidine compounds | |
Thakar et al. | Effect of antitumor diarylsulfonylureas on in vivo and in vitro mitochondrial structure and functions | |
Sancho et al. | Effects of sublethal exposure to a pesticide on levels of energetic compounds in Anguilla anguilla. | |
CS176291A3 (en) | Pharmaceutical | |
AP76A (en) | Porphyric Insecticides | |
Mengel et al. | Biochemical and morphologic changes in a mast-cell neoplasm during treatment with cyclophosphamide | |
RU2074719C1 (ru) | Способ разрушения опухолевых клеток млекопитающих и фармацевтическая композиция для разрушения опухолевых клеток млекопитающих | |
HRP930762A2 (en) | Preparation and use of porphyrin | |
Kennedy Jr | Acute toxicity studies with oxamyl | |
LT3997B (en) | Process for preparing protoporphyrins and use thereof | |
Aneja et al. | Modulatory influence of tin-protoporphyrin on gossypol-induced alterations of heme oxygenase activity in male wistar rats | |
Derrick | An investigation into the mode of action of the herbicide M&B 39279. | |
Olorunsogo et al. | Inhibition of mitochondrial respiration by chalepin, a naturally occurring furocoumarin | |
EP2863907A1 (de) | Pharmazeutische zusammensetzung mit synergistischer wirkung von direkten katalaseinhibitoren und zur katalasezerstörung führenden modulatoren des no-stoffwechsels oder der extrazellulären superoxidanionenproduktion | |
Matsunaka | History and early investigation of mode of action of peroxidizing herbicides | |
Varior | Biochemical and Histopathological effects of aflatoxin on Oreochromis mossambicus (Peters) | |
Hallahan | The mode of action of nitrodiphenyl ether and related herbicides | |
Fauve | Symposiurn on free radicaIs | |
Suchithra et al. | Biochemical and Histopathological Effects of Aflatoxin on Oreochromis mossambicus (Peters) | |
Cvunonowsrr et al. | Serotonin-Immunoreactive Neurons in the Cerebral Complex of Acheta domesicus. Experimental Study in Normal and Drug Treated Insects |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 9101807-7 Format of ref document f/p: F |