PT92546B

PT92546B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo derivados de arilo heterociclicos para o tratamento de tumores malignos da mama

Info

Publication number: PT92546B
Application number: PT92546A
Authority: PT
Inventors: Blaik Phillip Halling; Debra Ann Witkowski
Original assignee: Fmc Corp
Priority date: 1988-12-12
Filing date: 1989-12-12
Publication date: 1995-09-12
Also published as: JP2545000B2; AU633537B2; IL92622A; LU87949A1; SE9101807D0; WO1990006748A2; KR910700046A; CA2004979A1; FI912784A0; OA09362A; GB2247404B; IE893925L; AU4822290A; JPH04501420A; EP0447491A1; DK110791A; GR890100817A; PT92546A; WO1990006748A3; CH681779A5

Description

A invenção refere-se ao processo para a preparação de uma composição farmacêutica apropriada para o tratamento de tumores malignos da mama mediante aniquilação de células de tumores da mama por exposição das citadas células à acção da luz em presença de um tetrapirrol activável pela luz. 0 mecanismo de actuação das referidas composições compreende o tratamento das mencionadas células com um composto que inibe a transformação enzimática de protoporfirinogénio em protoporfirina IX por prctoporfirinogénio oxidase nas citadas células, causando assim uma acumulação de protoporfirina IX nas referidas células. Também se refere a um processo para a produção de protoporfirina IX, o qual compreende o desenvolvimento de microalgas eucarióticas em presença de um inibidor de protoporfirinogénio oxidase.

Um primeiro aspecto desta invenção refere-se ao ratamento foto-dinâmico de células do tumor da mama, tal

cor.o o tratamento foto-dinâmico do cancro.

É agora bem conhecida a aplicação de um derivado da hematoporfirina ou de uma mistura de derivados de porfirinas (por exemplo, Photofrin II^P') às células do tumor da mama e depois a exposição das referidas células à acção da luz com um comprimento de onda apropriado, para se obter a destruição de tais células. Tal terapia foto-dinâmica é objecto de uma série de artigos que formam numa publicação especial da Photochemistry and Photobiology, volume 46,

1*2. 5, Novembro de 1987 (a partir daqui denominada ΡάΡ 46-5”)· lai como é apresentada em tais artigos, a citada terapia foto-dinâmica tem sido usada no tratamento de uma vasta variedade de cancros (incluindo cancro dos brônquios, da vesícula, esófago, pulmão, pele, cabeça e pescoço, cérebro, e cancros do colon, intraoculares e ginecológicos).

Foi determinado que os efeitos bioquímicos de tal foto-sensibilização da porfirina inclui a reticulação das proteínas da membrana, a peroxidação dos lípidos, a inibição de trans porte de alguns metabolitos essenciais, a lise das membranas lisossómicas e mitocôndricas, a inactivação de vários enzimas e o aumento da absorção celular de porfirinas (Pà? 46-5, Pag. 695). 0 composto porfirina é geralmente injectado (por exemplo, por via intravenosa ou intraperitoneal), sendo a dose típica de cerca de 2 mg de Photofrin II por kg de peso corporal.

composto de porfirina pode também ser incorporado num hipossoma e injectado (por exemplo, via peritoneal) tal como está descrito, por exemplo, em Spikes et al. Photodynamic Behavior of Porphyrins in llodel Cell, Tissue and Tumor Systems”, em Photodynamic Therapy of Tumors and Other Siseases (Edição de G. Jori e C.A. Perria); Pags. 45-53, libreria Progetto, pádua (1935), e as referências aqui citadas.

A literatura técnica indica cue a introdução de protoporfirina em células, tais como os eritrócitos humanos (Dubbelman et al., 3iochimica et Biophysica Acta 511 (1973) 141-151) ou células de leucemia murina (Kessel, Câncer Research 42, 1703-1706, Maio de 1932), possui um efeito fotosensitivo marcado. 0 artigo de Kessel declara que este

I era o agente foto-sensibilizador mais potente de entre os í testados. No entanto, quando Kessel e outros (por exemplo j Berenbaum et al., Br. J. Câncer (1932) 45. 571-531) injectaram protoporfirina nos tumores, obteve-se a indicação de que ! a protoporforina assim introduzida no organismo podia ser i ~ j rapidamente perdida na circulação.

\ â também muito conhecido o uso de derivados de ί· hematoporfirina e materiais similares para a detecção e localização de tumores, tais como o cancro da bexiga ou pulmões (?&P 46-5, Pag. 759, por exemplo).

Num aspecto da invenção, o agente para tratamento das células no citado tratamento fo‘o-dinâmico, ou nos métodos conhecidos para detecção e colocalização de tumores, não é uma porfirina, ou não é somente uma porfirina. Pelo contrário, ele compreende um agente inibidor de enzimas, i , o qual inibe a conversão enzimática do protoporfirinogénio em hema nas referidas células, originando assim uma produção de protoporfirinas IX endógenas nas referidas células. Nos averiguámos que agentes, tais como certos tipos de compostos herbicidas, que inibem a conversão enzimática do

I protoporfirogénio em clorofila em células vegetais, inibem j também a conversão enzimática do protoporfirinogénio em heme nas células dos mamíferos. Nos acreditamos que a inibição por parte de tais agentes afectem, provavelmente, a fase de conversão do protoporfirinogénio em protoporfirina IX por meio de uma enzima (protoporfirinogénio oxidase, ΐ BC 1.3·3.4), de forma que 0 protoporfirinogénio não pode orosseguir a conversão enzimática normal para protoporfirina fi

IX, mas, em vez disso, oxida-se na célula (por exemplo no plasma), todavia fora do processo enzimático normal (por exemplo fora da membrana do organito) e, portanto, o resultado é uma acumulação de protoporfirina IX em locais onde se torne indisponível para a conversão normal em hema, tendo como resultado o facto de que nas células, quando submetidas à luz, a protoporfirina IX acumulada possui um efeito destruidor de células semelhante ao exibido no tratamento foto-dinâmico acima referido.

Os agentes de inibição enzimáticos desta invenção são inibidores específicos do protoporfirinogénio oxidase, uma vez que estes não operam como venenos enzimáticos principais tais como os agentes desnaturantes ou de reticulação (por exemplo, reagentes sulfidrilo), de preferência não são produtos que afectam as condições de oxidação, tais como 03 aceitadores de electrões, logo, os agentes preferidos para esta invenção possuem potenciais redox mais negativos do que cerca de -500 mV, tais como mais negativos do que -300 mV (ao invés de se usar um processo convencional, mediu-se num dissolvente aprótico para este agente, como por voltametria cíclica ou polarograficamente). É também preferível que 0 agente não seja um tetrapirrole e que 0 seu Ι^θ para a protoporfirinogénio oxidase seja inferior a cerca de 1 jiií, tal como inferior a cerca de 0,3 h-V, pon exe nlo um valor de I_cr. de cerca de 0,1 ou 0,03 ou 0,01 ,ul· ou 50 inferior.

agente inibidor de enzima é preferencialmente um que possua elevada capacidade para romper a plasmalema de material vegetal. Um teste para esta capacidade é 0 da

Sfflux Xxperiment, descrito no artigo de Halling e Peters em Plant Physiology, 34, 1114-5 (1937). Veste teste (descrito com mais detalhe no Apêndice A abaixo referido) os agentes preferidos apresentam um efluxo de pelo menos 50g a uma

taxa de tratamento de 100 julí, de preferência a ama taxa de tratamento de 1 ou menos, tal como de 100 n’,í; materiais altamente activos, tais como l-(4-cioro-2-fluor-5-propargiloxi-fenil)-3-metil-4-àifluormetil-A -1, 2,4-triazolin-5-ona ou lactofeno (abaixo descrito) originam percentagens de efluxo total superiores a 90;4 a uma concentração de 100 ni’.

Um outro teste da capacidade de um material para romper a plasmalema do material vegetal é o de Light-Induced Greening Inhibition Test descrito mais abaixo, mais especificamente no Apêndice 3. Este teste mede a capacidade para inibir o esverdeamento induzido pela luz ou o branqueamento induzido pela ausência de luz em mutantes yl las Chlamydomonas reinhardi (um tipo de alga que, quando cresce em ausência de luz, não produz clorofila, de forma que a massa da alga se torna esbranquiçada devido à presença de novas células não-verdes, e que produzem clorofila novamente quando expostas à luz).

Lluitos dos compostos preferidos (agentes) usados nesta invenção possuem a capacidade de inibir o esverdeamento induzido pela luz em pelo menos 50(5 quando o composto e usado a uma concentração de 10~^i', de preferência a uma concentração igual a 10 Έ1 ou inferior, por exemplo, 10 ií. Adicionalmente, o composto deve ser um que, quando usado à concentração referida no leste de inibição de esverdeamento induzido pela luz, origina um sobrenadante que apresenta um pico de absorção de luz a cerca de 405 nm o qual é mais elevado do que o pico da clorofila (o pico a cerca de 663 nm neste sistema), por exemplo o sobrenadante apresenta um pico a 450 nm cuja, altura é 2,3 ou 4 vezes a altura do pico oS8 nm.

Entre os agentes inibidores de enzimas que podem ser usados na prática desta invenção, destacam-se os com-

postos herbicidas das seguintes classes (A a D):

A. Herbicidas arilo heterocíolicos de fórmula geral

Ph-MHet na qual ?h é um radical fenilo substituído, de preferência um radical fenilo disubstituído nas posiçoes 2,4-, mais pre! ferivelmente um radical fenilo 2,4,5-trisubstituído, e

MHet é um anel heterocíclico ramificado nas posições 5- ou • 6-, que possui um a 4 átomos de azoto e que possui a fórmula í

-U-C=O ou -H-C-OH ou -H-C-Cl

11 n

Q' Q-C-R Q —C—R em que

Q representa o equilíbrio do anel heterocíclico e

R representa hidrogénio ou um grupo substituinte. Ssta classe de compostos incluem compostos tais como os designados como imidas cíclicas da classe dos herbicidas'' no artigo de Wakabayashi et al., J. Resticide Sei. 11, 635-660 (1936) que apresenta os compostos seguintes na sua Rigura 1:

composto I é un herbicida arilo oxadiazole, noi meadamente o 2-terc-butil-4-(2,4-dicloro-5-isopropoxifen.il)s -zy-1,3,4-oxadiazolin-5-ona. Outras 2-alquilo-4-(2,4,5í fenilo tri-substituído)-ZS-l,3,4-oxadiazolin-5-onas que po[ dem ser usadas na presente invenção são desvendadas, por exemplo, nas Patentes Americanas 3 335 362; 3 336 539 e q 3 376 413;í 0 composto II é um herbicida arilo tetra-hidroi!

indazole, nomeadamente 3-cloro-2-(4-cloro-2-fluor-5-isoI propoxifenil)-4,5,5,7-tetra-hidro-2H-indazole. Outros 3i -substituídos-2-(fenilo 2,4,5-trissubstituído)tetra-hidroí indazoles, que podem ser usados na presente invenção, são > desvendados, por exemplo, na Patente Americana 4 670 043.

! Os compostos III, IV e 7 são herbicidas arilo te: í trahidroftalimidas. Outros arilo tetrahidroftalimidas, que ί

I podem ser usadas na presente invenção, sao desvendadas, por exemplo, nas Patentes Americanas 4 431 322, 4 670 04°;

J- 670 042, e 4 439 229 e no Pedido de Depósito Internacional publicado (PCI) 70 37/07062. As duas últimas publicações

mencionadas também desvendam outros anéis IJHet que podem ser usados, sendo tais anéis ilustrados por exemplo na coluna 4 linha 25 até à coluna 5 linha 20 da latente Americana 4 439 229 e nas páginas 12 a 14 da '»70 37/07602.

Outros herbicidas adequados do tipo ?H-HHet são: arilo triazolinonas, tais como as desvendadas nas Patentes Americanas 4 313 731, 4 393 943, 4 404 019, 4 702 945,

705 557, 4 702 763, 4 761 174 e Pedidos de Depósito Inter; nacional (PCT) WO 85/01637, WO 85/04307, WO 87/00730,

I WO 87/03782, WO 86/04431, e WO 83/01133; arilo tetrazolij nonas, tais como as desvendadas na Patente Americana 4 734 124 s Pedidos de Depósito Internacional (PCT) WO

35/01939 e WO 37/03373;

] i

j arilo triazinodionas, tais como as desvendadas nas Patentes - Americanas 4 755 217 e 4 766 233 e Pedido de Depósito Internacional (PCT) WO 36/00072;

arilo hidantoínas, tais como as desvendadas na Patente Americana 4 427 438, arilo urazóis, tais como as desvendadas na Patente Americana 4 452 981; e :! arilo hexahidropiridazinas, tais como as desvendadas na í| íj Patente Americana 4 619 687t!

I B. Arilo heterociclico uretanos, tais como os desí vendados na Patente Americana 4 521 242.

!

i C. Herbicidas fenil eter, tais como os que possuem ! uma estrutura p-halogéneo ou p-nitro fenoxi-fenilo, tais i como os seguintes materiais comercialmente disponíveis:

5-(2-cloro-4-(triformetil) fenoxi)-2-nitro-M-metano-sulfonilbenzamida (fomesafen)

5-(2-cloro-4-(trifluorometil)fenoxi)-2-nitrobenzoato (acifluorfen) de sódio

metil 5-(2,4-diclorofenoxi)

2-nitrobenzoato (bifenoxi)

2-cloro-l-(3-etoxi-4-nitro -fenoxi)-4-trifluormetilbenzeno (oxifluorfen)

' Outros herbicidas éter difenílicos comercialmente : ί ! disponíveis e adequados são:

j lactophen: l-(carboetoxi)etil 5-(2-cloro-4-trifluormetilfenoxi)-2-nitrobenzoato, fluorglycofen: (carboetoxi)metil 5-(2-cloro-4-trifluormetilfenoxi)-2-nitrobenzoato,

fromesofen: 5-(2-cloro-4-(trifluormetil)fenoxi-U-metilsulf onil-2-nitro-benzamida;

chloronitrofen: -2,4, 6-trichloro-(4-nitrofenoxi)benzeno;

fluorodifen: -2-nitro-l-(4-nitrofenoxi)-4-trifluormetil-benzeno;

nitrofen: -2,4-dicloro-l-(4-nitrofenoxi)benzeno;

Chlomethoxyfen: -4-(2,4-dicloro-fenoxi)-2-metoxii -1-nitrobenzeno.

I

Um outro herbicida adequado de éter difenílico é o 5-(2-clor0-4-trifluormetilfenoxi)-2-nitroacetofenona , oxima-Q-acetato de metiio.

I

I D. herbicidas arilo pirazole, tais como as desj vendadas nas Patentes Americanas 4 553 210; 4 495 390, e

459 150 e no pedido de patente alemão publicado 3520327 Al.

Compostos de formula:

ί X° é 0 ou 5 e Ph tem o significado já acima referido, tais como os compostos desvendados no Pedido de Patente Europeia | publicado 273417 ou em Derwent Abstracts accession ps .

i, 87-040749.

: 0 tratamento com os agentes denta invenção pode i ser realizad.o por injecção intravenosa ou via intra-peritoneal. 0 agente pode ser usado sob a forma de uma composi-

ção esteril que compreende o agente dissolvido ou disperso numa substância veicular farmaceuticarnente aceitável, por exemplo sob a forma de uma solução aquosa isotónica, tal como uma solução salina aquosa (exemplo, ITaCl 0,9/) ou uma solução salina fosfato tamponada Bulbecco's (?3S), a uma concentração de, digamos, 2,5 mg ml^_\ ou que compreende o agente num sistema lipossomico, tal como um preparado com ! uma vesícula fosfolípidica de uma forma como a descrita nas ' páginas 1S59-16SQ no Remington’s Pharmaceutical Sciences,

I --1935, (17- edição), publicada por Mack Publishing Company.

: Por exemplo, analogamente à formulação descrita por Jori ;í et al. , Br. J. Câncer 1933), 43 na página 307; 51,4 mg de dipalmitoil-difosfatidilcolina podem ser dissolvidos em i 10 ml de uma solução 1 mil do agente em clorofórmio-metanol ! (9:1, v/v) e após agitação o dissolvente pode ser removido j sob vácuo a 30°C,·originando um sólido, o qual pode ser ι ressuspenso em 10 ml de um tampão de fo3fato 0,011' a pH < 7,4, que contém 150 mP de líaCl, e a solução turva foi sonorizada durante 30 minutos a 50°0.

[ 0s agentes de inibição de enzimas, que podem ser j usados nesta invenção, podem ser conjugados ou ligados a ! anticorpos monoclonais adequados específicos para tumores ii íj (lIABs), usando uma tecnologia de ligaçao conhecida na tecniií ca, como um meio para marcar o agente inibidor de enzimas z -. . , i’ para zonas especmcas ao tumor.

Os agentes de inibição de enzimas usados nesta in!( venção podem também ser usados por simples ingestão oral, de preferência sob a forma diluída conjuntamente com uma i substância veicular farmaceuticarnente aceitável, como por J adição a um produto alimentar como é ilustrado no Exemplo H 6, mais abaixo.

í!

P_ode ser desejável, especialmente para administração oral, usar agentes de inibição de enzimas que são sais

solúveis em água ou que são ácidos e formam sais de potássic ou de sódio solúveis em água, tais como uma sulfonamida ácida do tipo desvendado no Pedido de Eepósito Internacional (PCI) WO 37/03732 (por exemplo, agente 5c no Exemplo 5 abaixo) ou WO 35/001939 e 7/0 37/037373 ou um seu sal solúvel em água, ou um ácido carboxílico ou um respectivo sal solúvel em água, tal como um sal de sódio conhecido como acifluorfeno.

Os agentes inibidores de enzimas, que podem ser usados nesta invenção, podem ser incorporados em preparações farmacêuticas convencionais, tais como comprimidos por exemplo, comprimidos prensados que podem ser revestidos com uma pasta de açúcar e/ou xarope), supositórios, cápsulas (por exemplo, cápsulas de gelatina dura), suspensões, soluções, pó ou ampolas. Em tais preparações o agente pode estar presente numa mistura íntima com um sólido farmaceuticamente aceitável e/ou uma substância veicular líquida, que pode, se se desejar, ser um nutriente; por exemplo pode ser um sólido tal como amido de milho ou um diluente líquido, tal como água ou um sólido comestível ou um óleo mineral ou um dissolvente, por exemplo, dimetil sulfóxido. Podem ser usadas misturas de agentes inibidores de enzimas, por exemplo, uma mistura co agente 5c do Exemplo 5, abaixo, e acifluorfeno em, por exemplo, proporções aproximadamente iguais. A dosagem a ser usada pode ser determinada por via experimental usual, bem conhecida na técnica, tais como as experiências do tipo descrito, para a Photofrin II, no artigo de Dougherty em Photodynamic lherapy (PDT) of òlalignant lumors em CRC Criticai B.eviews in Oncology/Hematology volume 2, edição 2 (1984), páginas 83-115.

Os Exemplos que se seguem são apresentados para ilustrar a invenção.

EXEMPLO 1

Células Hela (uma linha de células de tumor humano comumente usadas para pesquisa de tumores e obtidas através do American Type Culture Collection), em fase logaritmíca de crescimento (foram cultivadas a 37°C durante 5 dias em balões de cultura de Tecidos Ealcon de 1 litro), foram lavadas numa solução salina tamponada com fosfato (PBS). Uma solução a 0,25% de tripsina em PBS (2 ml) foi adicionada e, após vários minutos, as células foram suavemente removidas a partir do balão, e colocadas em 110 ml de uma solução de 25 mM de Hepes num Meio Mínimo Essencial (ΜΞΜ) suplementado com soro de bovino inactivado a 10% v/v, 1,1 ml de uma solução de glutamina 200 mM numa solução salina a 0,85%, e 11.000 unidades de penicilina/11.000 mcg de estreptomicina.

Então, aliquotas de 5,0 ml da cultura de células ressuspensas resultante foram, cada uma delas, colocadas em balões de 50 ml de culturas de tecidos Ealcon e (excepto para o controlo) misturadas com o agente de tratamento. As aliquotas foram então incubadas na ausência de luz, a 37°C, durante três dias. As células foram então removidas e extraídas sob luz verde, da seguinte maneira:

As células foram removidas a partir do fundo do balão com a adição de 0,3 ml de uma solução de tripsina a 0,25% em PBS. Uma hora depois da incubação sob ausência de luz, as células e o meio foram removidos dos balões, colocadas em tubos de centrifugação de fundo redondo, e então submetidos a dois cicios sob condições de congelamento-descongelamento para romper as células e permitir a extracção .

A examinação das suspensões de células, após este regime de ruptura, não revelou nenhumas células intactas.

Dez ml de acetona básica (90% acetona: 10% de ΝΗ,ΟΗ 0,1 N)

foram então adicionados a cada tubo, e os tubos foram centrifugados para remoção de fragmentos de proteínas e células. Adicionaram-se posteriormente 5 ml de água ao sobrenadante, seguindo-se a adição de 0,5 ml de uma solução aquo sa saturada de iTaCl. 0 pH foi então ajustado para 6,8 através da adição cuidadosa, gota a gota, de uma solução de KHgPO^ 2M. 0 extracto aquoso de acetona foi então carregado numa coluna C8 Baker Prep. As colunas foram secas e depois lavadas com 2 ml de água. Os tetrapirroles foram eluídos com volumes de 2 x 1,5 ml de CH^0H/E₂O 90/10. Os extractos foram então quantificados num espectrofluorómetro.

Os agentes de tratamento usados nesta experiência foram:

A. ácido 5-amino levulínico, que é um percursor conhecido de tetrapirroles.

B. Acifluorfen-metilo, que possui a fórmula:

Ci

0.

C. Um herbicida de fórmula:

E. Um herbicida de formula:

G agente A foi fornecido sob a forma de uma solução em água esterilizada em filtro 250 mK, pH 6,5- Os agentes 3, 0, 0 e E foram fornecidos sob a forma de soluções 50 nilf em acetona. Acetona foi também adicionada ao controlo para desenvolver uma concentração de 0,2$ v/v. Às quantidades dos agentes adicionados às culturas de células foram as apresentadas especificamente na Tabela 1, abaixo. As quantidades do tetrapirrole protoporfirina IX (Proto IX”) produzidas são auresentadas na Tabela 1.

I

ΤΑ3ΖΙΑ 1

Acumulação Tetrapirrole na.s células He Ia tratadas

		Emissão de	Quantidade
	Concentração	fluorescência	Proto IX
Agente	do Agente	cps 400/530	(pmoles)
A	5000	41342	4.2
3	100	12921	1.3
C	100	33477	3.5
D	100	10551	1.1
E	100	3957	0.9
controlo		2795	0.3

de

ΕΧΕΙ,ΖΡΙΟ 2

Células Hela, em fase logarítmica de crescimento, que foram cultivadas durante 5 dias num balão de cultura de tecidos Falcon de 1 litro, a 37°C, foram lavadas numa solução salina de fosfato tamponado (P33). Uma solução a 0,25/ de tripsina em PBS foi adicionada e, após vários minutos, as células foram cuidadosamente removidas e colocadas em 110 ml de uma solução de Zíepes 25 mLZ num Meio Mínimo Essencial (MEM), suplementado com soro de bovino inactivado a 10/ v/v, 1,1 ml de uma solução de glutamina 200 mli numa solução salina a 0,35/ s 11.000 unidades de penicilina/ /11.000 mcg de estreptomicina.

Alíquotas (5,0 ml cada) de uma cultura de células ressuspensas foram colocadas em balões de culturas de tecidos Falcon de 50 ml, com ou sem herbicida, e incubadas sob ausência de luz, a 37°C, durante 4 dias, sendo o herbicida adicionado numa solução de acetona diluída, como no Exemplo 1. A acetona foi também adicionada aos ensaios controlo, para desenvolver uma concentração de acetona de 0,2/ v/v. A quantidade do herbicida foi a necessária para se obte rem as concentrações especificadas abaixo na Tabela 2. Os agentes de tratamento foram:

B. Os do Exemplo 1

C. Os do Exemplo 1

F. Um herbicida de fórmula:

i i

ι Extracção: 0 meio de cada um dos balões foi colocado em tubos de ensaio de vidro de fundo redondo, enquanto [ que as células, que aderiram ao fundo do balão, foram soltas pela adição de 0,5 ml de uma solução a 0,25% de tripsina em BBS, e após vários minutos a 37°C, foram lavadas para fora dos balões e recombinadas com os seus meios. Alíquotas de 100 ul foram então removidas de cada suspensão de células, para determinar a densidade celular. Os 5,4 ml restantes da suspensão de células foram então sonorizados durante j 30 minutos, para romper as células.

ii Dez ml de acetona básica (90% de acetona: 10% de NH^OH 0,IN) foram então adicionados a cada tubo, e os tubos foram centrifugados para remover fragmentos de proteíI nas e células. Cinco ml de água foram adicionados ao sobreίί _ nadante, seguidos por 0,5 ml de uma solução aquosa saturaí da de NaCl. 0 pH foi então ajustado para 6,8 ml através de uma adição gota a gota de K^PO^ 2M. 0 extracto aquoso de acetona foi então carregado numa coluna 08 Baker Prep. As colunas foram secas e então lavadas com 2 ml de água. Os tetrapirroles foram eluídos com 3 ml de CH^OH/^O 90/10.

Como no Exemplo 1, toda3 estas técnicas de extracção foram realizadas substancial e inteiramente sob uma luz que não i

excita a protoporfina IX (por exemplo, luz verde) ou em ausência de luz (por exemplo, contentores opacos cobertos).

A fluorescência dos extractos foi então determinada num ! espectroflúormetro SPEX. A acumulação de Protoporfirina IX (Proto IX”) foi quantificada, usando para tal coeficientes de extinção pré-determinados. Os resultados são apresenta! dos abaixo na Tabela 2.

I

Inibição do Crescimento Médio e Acumulação de Proto IX

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-P ri ra ri o* *

*M*Percentcigem do controlo.

Um outro aspecto da invenção refere-se à produção de protoporfirina IX (a partir daqui citada como Proto IX) Neste aspecto, microalgas eucarióticas cresceram heterotróficamente na escuridão (ou sob condições de luz não excitante da Proto IX) num meio que compreende um agente (abaixo descrito) que inibe a conversão enzimática do protoporfirinogénio em Proto IX. 0 meio, ou as algas, ou ambos são então tratados para extrair a Proto IX e para separá-la da clorofila, carotenóides e fragmentos celulares, etc.. A separação pode ser levada a cabo de qualquer¹ forma conveniente, tal como por cromatografia em fase líquida, incluindo cromatogra fia em fase líquida inversa, ou por extracção do dissolvente, ou por precipitação de Proto IX por quelação, tal como com um metal como Pe, Zn ou Líg, removendo o composto quelato resultante e, se desejado, regenerando a Proto IX, através de um tratamento conhecido do quelato com ácido diluído.

As fases de separação são realizadas sob luz não excitante da Proto IX (tal como a luz verde descrita no Apêndice A sob o cabeçalho Escuridão) ou na ausência de luz. C quelato de ferro não é tão sensível à luz, lego tal exposição à luz é mais permissível, quando se processa este material.

As microalgas são de preferência cultivadas sob a forma de uma suspensão de células, a uma temperatura comO o preendida no intervalo entre cerca de 15 a 30 C. A concen_ç traçao do agente inibidor pode ser cerca de 10 ⁷ a 10 ' ii, por exemplo. Exemplos de microalgas que podem ser usada3 são: Scenedesmus sp., Chlamydomonas reinhardi, Euglena sp. e Eumillerlopsis filiformis.

LO 3

Culturas de Chlamydomonas reinhardi em fase logaritmíca de crescimento (tipo selvagem) são sub-cuitivadas

numa tina ds aço inoxidável (por exemplo, 300 1 usando o meio de cultura abaixo descrito, uma solução de acetona de l-(carbetoxi)etilo 5-(2-cloro-4-tri£luormetiifenoxi)-2-nitro-benzoato (lactofen, um herbicida comercial de fenil éter) foi adicionado para desenvolver uma concentração de —- U —

M e uma concentração final de acetona de 0,1%. Esta mistura é deixada em repouso para crescimento no escuro a 25°C, durante um período de tempo compreendido entre 4 a 7 dias, com agitação suave e/ou arejamento. Enquanto se mantém sob ausência de luz, o conteúdo da tina é filtrado e o filtrado resultante é tratado para recuperar a protoporfirina IX.

Um processo de tratamento para recuperar a protoporfirina IX é filtrar o conteúdo da tina reaccional (enquan to 3e mantém a escuridão) e adicionar acetona ao filtrado. Esta mistura é extraída com éter ds petróleo. A mistura ceténica aquosa é então extraída com éter dietílico, sendo este posteriormente removido por evaporação, para deixar um resíduo. Este resíduo é dissolvido em metanol e submetido a cromatografia em fase inversa, para se obter a protoporfirina IX. Os métodos de recuperação descritos nos Exemplos 1 e 2, podem também ser usados.

Composição do meio

Sais

Citrato de sódio·5H₂O Vestígios de metais 7eCl₃-6H₂0 CaCl₂·2H₂0 MgS0₄·7H₂0 xh₂?o

X₂KP0₄CH^COjNa ί1 StockA molaridade

Stock

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como abaixo	como abaixo	10
C.37	X	10“ ³ l:	1%	1
0.35	X	io“³m	5.3%	1
1.2	X	io“³m	10%	3
3-7	X	io“³m	10%	3
2.2	X	10“ ³ M	10%	3
1.7	X	10“ ³m	10%	3
7.5	X	10“ ³ M	10%	10

Stock da Mistura de Metais em Vestígios

^H3^BO3	100	mg/L
ZnSOy 7H₂0	ICO	mg/L
MnSOy 4H₂0	40	mg/L
COCly 6H₂0	20	mg/L
NaMoOy 2H₂0	20	mg/L
CuSO^	4	mg/L·

Uma alternativa para o uso de Chlamydomonas ! reinhardl é o uso de Scendesmus sp. cultivadas no meio anterior, substituindo o acetato de sódio por glucose.

EXEMPLO 4

Este exemplo e igual ao Exemplo 3, excepto em que o composto herbicida é 1-(4-cloro-2-fluor-5-propargiloxifenii )-3-metil-4-difluormetil--4. -1,2,4-triazolin-5-ona, em vez do lactofen.

EXEMPLO 5

Beterminação do

Protoporfirinogénio IX (Protogen IX”). A Proto IX foi obtida através da Porphyrin Products, Logan, UI e purificada como descrito por Ϊ.Ρ. Euesler ef al., PIant Physiol. 67, 245-249 (1931). 0 Protogen IX foi preparado de fresco através da redução da Proto IX com uma amálgama de Ua/Hg tal como descrito por U. J. Jacobs and J. M. Jacobs, Enzyme, 23, 205-219 (1932), usando a Proto IX purificada a uma concentração de 300 ;uií.

ι

Material Vegetal. Pepino (Cucumis sativus I. cultura Wisconsin SMR13') foi plantado numa câmara de crescimento às escuras em vermiculite irrigado com um fertilizante comercial (9- 45-15). As sementes desenvolveram-se a 25°C

e a uma humidade relativa compreendida entre 30 a 90/. Uma iluminação intermitente, em ciclos de um minuto de luz em cada 60 minutos com uma intensidade medida de 25 uE/m “ í sec·'· (PAR), foi-lhes fornecida pela General Electric I Bright Stick, controlada por um temporizador electrónico.

Isto originou um tecido capaz de uma rápida síntese de cloí rofila, enquanto se minimizam as reservas de amido e os níveis iniciais de clorofila.

Isolamento de Cloroplastos. Os cloroplastos desenvolvidos foram isolados como descrito por T. P. Euesler et.

al., Plant Physiol., 75, 662-664 (1934), excepto em que,

J na fase de purificação final, os plastídeos foram centrifugados através de um amortecedor Percoll a 40/ de preferência a 45/. Os cloroplastos foram ressuspensos num ensaiotampão que continha manitol a 0,5 M, TES 20 mM, HEPES a 10 mM, pH 7, 7, EBTA 1 mM MgC^ 1 mM, albumina de soro de bovino 1/ (ρ/v) e ditioeritritol 1 mM para uma concentração final de 2 mg proteina/ml.

j Ensaios de Protoporfirinogénio Oxidase. Os ensaios ! foram conduzidos como delineado por J. M. Jacobs e U. J.

Jacobs, Arch. Blochem. Biophys., 229, 312-319 (1934) Amosí tras (0,2 ml) de uma suspensão de cloroplastos foram pré! -incubadas no escuro, durante 15 minutos, a várias concentrações de acifluorfen-metilo (AFM) ou com acetona a

0,2/ (v/v) (como um controlo). Adicionaram-se então à suspensão 50 /ul de Protogen recentemente preparado (cerca de 15 nM) para se iniciar a reacção. Os ensaios foram ter) minados com a adição de 2,75 ml do meio fluormétrico de

U. J. Jacobs e J. M. Jacobs, Snzyme, 23, 206-219 (1932) j que compreende Tween 20 1/ (v/v) (monolaurato de polioxi-etileno sorbitano), Tris-HOl 50 mM, pH 3,5, EBTA 1 mM; o ditioeritritol 1 mM foi substituído por glutationa 5 mM.

As suspensões foram então lidas directamente num espectroflúormetro SPEX ?luorolog-2, equipado com uma opção de

fluorescência na face frontal para amostras biológicas turvas. A quantidade de Proto IX produzida foi registada em termos quantitativos a partir da curva padrão (de quantidai de da Proto IX em função da emissão a S30 nm, com excitação | de 400 nm) produzida a partir da Proto IX purificada num : meio fluormétrico.

j Para determinar a quantidade de oxidação não-enzimática para a Proto IX no teste anterior, o mesmo ensaio foi realizado, excepto em que, no lugar da suspensão de cloroplastos activos, foi usada uma suspensão, na qual os

I j cloroplastos foram inactivados por meio de aquecimento duj rante 15 minutos, a 35°C. A subtracção da quantidade da

Proto IX assim produzida, da quantidade produzida em prej sença dos cloroplastos activos, deu a quantidade da Proto ί IX formada enzimaticamente. Os resultados são apresentados [ graficamente na Figura I (na qual I5D indica a menor difei rença significativa, como é convencional). A Pigura I mostra que o valor (concentração que desenvolve 50% de inibição) é inferior a 0,1 um, isto é, cerca de 0,03 ui'.

Ensaios sobre o efeito de 10 um de APi' sobre a conversão enzimática da Proto IX em magnésio Proto IX na i

suspensão de cloroplastos (em presença de AIP) mostrou que o APil nao possui efeito de inibição nesta conversão.

; SXEEPLC o

I í

I

Xeste exemplo os agentes inibidores de enzimas foram adicionados para alimentarem ratos portadores de tu-

mores; para alguns	dos rates usados	como contr	olo, não foi
adiciorado agente	aos alimentos. 0s	ratos fora	m então sacri
ficados e os seus	rins, intestinos,	glândulas	supra-renais
fígados e tumores	foram removidos e	analisados	em termos de
teor da Proto IX.	0s agentes inibido	res de enz	iriicis que 3 6

seguem foram os usados:

0' á · _ liais especif icamente, os ratos usados foram os ratos D3A/2 Ha que foram injectados com tumores subcutâneos 31ÍT-F no dia 0 no ombro direito. Os ratos, alojados individualmente, receberam Purina P.odent Chovz 5001 líash não tratada no Dia 1, posteriormente nos Dias 2 até 10 os ratos re; ceberam a mesma líash tratada com 2000 rpm do agente inibidor | a ser ensaiado (ou, para os controlos, receberam a mesma líash não tratada). 0 tratamento da líash foi realizado misturando-a com uma pequena quantidade de uma solução acetónica do agente a ser ensaiado. Os ratos foram então sacrifij cados no Dia 10, excepto o rato tratado com o agente designa do por 6j; este último foi sacrificado no Dia 7. Os tecidos ί foram refrigerados a 4^C durante a noite, e então manchados a seco, e o peso fresco de cada amostra de tecido foi registado. Os tecidos foram então homogeneizados em 5 ml ou 10 ml nos casos de intestinos e fígado, de acetona - HH^OH 0,1 N (5:1, v/v). Os produtos homogeneizados foram então centrifugados a 1500 g e os sobrenadantes foram analisados num espectrofluorómetro SPEX FA112; excitação 400 nm, emissão o30 nm de comprimento de onda, as óptimas para a Proto IX.

À acumulação da Proto IX foi determinada como 0P3 (contagem de fluorescência emitida por segundo por cada grama de tecido. Os resultados foram tabelados como abaixo se apresenta [ (os resultados são valores médios para dois ratos para cada tratamento, excepto para os tratamentos com os agentes 6f,

Sh, Si e ój, em cada um dos quais apenas foi tratado um rato):

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Proto IX Ledio Cps per grania

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nos tecidos ama de tecido	respec
Proto IX	por gr
Agente	Tumor	Fígado	Rins	Adrenai	Intest;
Sa	11	39	99	60	54
6b	14	12	22	23	51
6c	131	25	143	125	91
6d	13	14	117	4	51
5e	8	3	8	12	19
6f	4	11	5	51	11
og	2	n ι	5	13	4
oh	3	o	5	21	5
51	9	14	37	337	32
Sj	11	5	3	4	5
Controlo	2	5	5	14	2

seguiu4 artigo de Dougherty acima citado apresenta una figura de 3,5 xig/g para a concentração da porfirina no mesmo tipo de tumor (SMI-F) após a injecção de 10 mg/kg do derivado de hematoporfirina no mesmo tipo de ratos (DBA/2 Ha). Outra literatura técnica (Moan et al P1P 45-5, págs. 713-721; nota figura 2 na pág. 715) indica que uma concentração de cerca de 12 /jg/g de porfirina é obtida em tumores (C-^H/ /Tif carcinoma da mama) em ratos D3A/H2 após injecção intraperitoneal de 25 mg/kg de Photofrin II, o sensibilizador mais vastamente usado para tratamento foto-dinâmico e detect ção do cancro.

li

As quantidades totais do alimento que contém o agente consumidas pelos ratos foram as seguintes: 5a - 22 e 35 g; 5b - 37 e 35 g; 5c - 25 e 22 g, 5d - 41 e 32 g;

5e - 40 e 44 g; óf - 27 g; 5g - 33 e 40 g; 6h - 35 g;

5i - 10 g; 6j - 20 g.

Nas preparações para as experiências descritas neste exemplo 6, foram realizadas as seguintes fases de rotina, usando (a não ser que de outra forma se indique) o agente que está designado como 6c neste Exemplo, em animais que não possuíam tumores.

a. 0 do agente foi determinado como sendo acima de 2600 mg/kg (isto é mg do agente por kg de peso corporal) para ratos grandes (determinado durante um período de 14 dias, seguindo-se uma dose oral única, contendo óleo de milho, que contém 15% do agente) e acima de 70C mg Ag por ratos pequenos (determinada durante um periodo de 14 dias, seguindo-se uma dose oral única, que compreende óleo de milho e 5% do agente).

b. Nos ensaios de substâncias veiculares para injecção intraperitoneal, sem o agente, foi determinado que os ratos pequenos poderiam tolerar uma injecção de 0,5 ml dose de uma mistura de partes iguais de DI1S0 (dimetilsulfóxido) e água.

c. Nos testes o agente injectado via intra-peritoneal numa mistura de 60% de óleo de milho e 40% DLZ30 foi determinado que os ratos pequenos poderiam tolerar uma dose de 100 mgAg·

d. Realizaram-se os seguintes estudos sobre os ratos:

i. dosagem, oral diária de 50 mgAg (usando uma solução a 1% do agente em acetona) durante oito dias, ii. injecção I.P. diária de 50 mgAg (usando uma dispersão 1% do agente em óleo mineral, realizada dissolvendo o agente numa gota de DNSO e misturando a solução resultante com o óleo mineral) durante 3 dias.

iv. alimentação durante 3 dias com um aiimento-padrão, no qual foram incorporadas 2000 ppm do agente, ba-

seado no peso dc alimento.

v. injecção diária I.V. de 50 mgAã (usando uma solução 2% em LIÚ30) durante 4 dias.

Os ratos pequenos usados foram então sacrificados , e os seus tecidos analisados em termos de acumulação da ^; Froto IX.

[

J Num outro ensaio, um rato grande, macho Fisher 344 foi alimentado durante 27 dias com um alimento que compreendia 5000 ppm do agente Sc e foi então sacrificado. Os tecidos deste rato grande apresentavam níveis elevados da Froto IX em comparação com o controlo, com aumento marcado nos níveis nos rins, intestino, estomago e cérebro e apenas um pequeno aumento ao nível dos tecidos musculares.

Nos testes que se seguem de ratos e ratazanas, os animais foram mantidos num ciclo-padrão de 12 horas de luz, 12 horas de escuridão.

EXENFLO 7

Numa serie de experiências ao longo das linhas dos Exemplos 1 e 2, culturas de células Nela foram, incubadas em presença de 100 /uV de vários agentes de tratamento, abaixo tabelados. A percentagem dada, ao pé do agente de tratamento, indica o aumento la quantidade ia Proto IX produzida em presença do agente de tratamento relativo ao aumento produzido pelo controlo na mesma experiência.

Os agentes usados no Exemplo S: Sa - 337%, 5b - 355%; Sc - 297%; Sd - 1200%; Se

- 326%; Sh - 431%; oi - 544%: Sj

1210%; Sf - 230%; Sg S9%. Outros agentes:

115%

303%

31-Α

Exemplo 8

Neste exemplo, o agente inibidor da enzima 60 do Exem pio 6 foi dada na alimentação dos ratos; nos citados ratos implantaram-se tumores e a zona portadora do tumor foi expos ta à luz, causando a regressão dos tumores.

Especificamente, três ratos de Sprague-Dawley com o peso médio de 120 g foram alimentados numa dieta contendo 2000 ppm do agente durante 6 dias. No 3^e dia, um condrossarcoma foi implantado no membro posterior direito de cada rato mediante a injecção de 0,3 ml de uma suspensão com células do tumor (um milhão de células do tumor).

No 6^Q dia, o membro posterior direito de cada rato foi depilado.,' mediu-rse o tamanho do tumor e a área do tumor e a pele circundante foram depois expostas a doses não tér— ! micas de 630 nm de luz para um total de 270J /cm . No dia seguinte, verificou-se que dois dos ratos já estavam aparentemente livres dos seus tumores (ou seja, nenhuma massa palpável de tumor) e o terceiro rato tinha quase uma compleΪ ta regressão do seu tumor. A pele circundante e o tecido muscular dos ratos estavam ligeiramente esbranquiçados e apresentavam um certo inchaço, mas significativamente menor do que o que fora constatado no caso da terapia fotodinâmica, em conjunto com Photofrin II.

ζ;

Apêndice Α

Ensaio de Percentagem de Efiuxo ensaio de percentagem de efiuxo usa cotilédones colhidos de sementes de pepinos etioladas. uma fase inicial uma massa de cotilédones é tratada no escuro com uma solução aquosa tamponada que contém um açúcar radio-etiquetado. A quantidade de açúcar absorvida pelos cotilédones é então medida (por contagem, tal como abaixo se descreve). A massa dos cotilédones é então dividida em duas porções; uma parte dos cotilédones é tratada com uma solução aquosa tamponada, que contém o composto a ser ensaiado, enquanto que a outra porção é tratada da mesma forma, na escuridão, com uma solução idêntica sem o composto de ensaio, como controlo. Os cotilédones, em contacto com as soluções aquosas, são então expostos à luz durante 15 horas, e enrão separados das soluções aquosas, a última é então medida (por contagem) para determinar o seu conteúdo de material radio-etiquetado. Os resultados foram expressos como percentagem de efiuxo, que e calculada como se segue, na qual 3 é o valor contado de material radio-etiquetado (por cotilédone) obtido pelos cotilédones uo seu tratamento inicial, S^é o valor contado de material radio-etiquetado (por cotilédone) em solução aquosa, que contém o composto a ser ensaiado após a exposição à luz, e S é o valor de material radio-etiquetado (por cotilédone) na solução aquosa de controlo, após exposição ã luz.

>5 Ei-luxo

Mais especificamente, são usados os seguintes materiais e condições no ensaio sobre percentagem de Efiuxo.

Material Vegetal: Sementes de pepino (Cucumis sa-

tivus I. cultivar Wisconsin SU?. 13) germinaram e cresceram em vermiculite irrigada com um fertilizante comercial (9-45-15). As sementes cresceram a 25°C e HR de 30-90;=, numa câmara de incubação escura. Os cotilédones foram colhidos das sementes etioladas, cinco dias após serem plantadas e foram lavadas com CaCl₂ 1,0 mòí, todas sob luz verd

Solução Tamponada: KC1 1 mH, CaCl₂ 1 mH e fosfato de potássio 2,0 mil, pH ajustado para 5,5 (como com NaOH).

Açúcar Radio-etiquetado: 3-O-metil-3-/U-140.7glucose de actividade específica 10,9 G3q/mmol (A.mersham Corp Arlington Heights II).

Tratamento Inicial: Cotilédones lavados (180 a 230) são colocados num balão de Irlenmeyer, de boca larga, de 50 ml, tapado com espuma, que continha 50 ml da solução tamponada, e o açúcar radio-etiquetado é adicionado numa quantidade tal que origine uma concentração de 500 n'.í dest na solução. 0 balão é agitado durante 24 b a 125 rpm, numa misturadora giratória, no escuro. Os cotilédones são então cobertos com uma malha de nylon e lavados três vezes em vo lumes de 20 ml de CaCl₂ 1 mH. A toma removida de açúcar radio-etiquetado é medida pela digestão de 3 amostras de 5 cotilédones cada, num solubilizador de tecidos HCS (Amersham Corp.) e contendo o macerato resultante num espectrometro de cintilação líquida. (Qs resultados lesta digestão mostraram-se equivalentes à mesma determinação feit por combustão das amostras de cotilédones num auto-oxidizador).

Tratamento oom o comoosto a ser ensaiado (e tramer.to controlo):

Cinco dos cotilédones são suspensos, lado abaxial para cima, em 3 ml da solução tamponada numa placa de petr de plástico, coberta, com 35 mm de diâmetro. 0 composto do ensaio é então adicionado (como uma sua solução em acetona

numa quantidade tal que origine uma concentração pré-determinada (discutida abaixo) do composto de ensaio na solução tamponada; a concentração de acetona na solução tamponada é então de 0,1% (v/v) no controlo, bem como na solução que contém o composto de ensaio. Os cotilédones em suspensão são então rodopiados por agitação das placas a 90 rmp na superfície de uma agitadora durante 15 horas.

Exposição à luz: As placas que contêm os cotilédo nes em suspensão são expostas durante 15 horas a iluminação

I produzida por quatro lâmpadas fluorescentes GE F20PI2-CÍ7, cor;

_2 —1 .¹ uma intensidade medida de 150 ,uS m seg. na região fotoj [ sinteticamente activa do espectro (PAR) (medida na superfície 1 dos cotilédones), enquanto as placas são agitadas.

j Medição da quantidade de material radio-etiquetado i no líquido: Podo o líquido é separado dos cotilédones e enj tão contado num espectrómetro de fase líquida de cintilação.

Escuridão: Podos os tratamentos anteriores à fase de iluminação foram realizados às escuras ou sob luz fluores cente verde (isto é, luz filtrada através de um filtro cortado em plástico verde, pelo qual passa luz de comprimento de onda compreendido entre 450 nm a 500 nm).

Meios de cultura

Apêndice B

meio

Sais

Citrato de sódio*δΗ^Ο Vestígios de metais FeCly on^O CaCl₂* 2η₂0

Molaridade

1.7 x 10 ³M como abaixo

0.37 x 10~³M 0.3o x 10~³M

Stock

10/ como abaixo 1/ ml Stock/L·

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x 10“³M	10/	3

Stock da Mistura de	Metais eo	ι Vestígios
±i -j 30 -> J j	100	mg/L
ZnSO,* 7H,0 4 z	100	mg/L
MnSO^*4H₂0	40	mg/L
C0Cl_?*5H₉0	20	mg /L
MaMoO,* 2H_OC	20	mg Λ
CuSC .	4 ik	mg A
Meie de Cultura A é	preparado	adicionando

ml/l de uma solução aquosa de acetato le sódio 10/ (7,5 x 10~³H) par ?a o

..eio r>e íU. .J o ordem abaixo listada, e sao submetidos à acçao de autoclave a 15 psi, durante 15 minutos.

Crescimento de Culturas Stock em presença de Luz

Culturas SLock de células y-1 forasi mantidas axeni calmente numa cultura líquida, no Meio A ou M, de preferência no Meio M, num ciclo de 14/10 h de 1 la 2 f θ θ o mx o j a 0 j em balões Srlenmeyer, que são tapados com espuma de poliure

tano. As culturas stock são incubadas sem arejamento suplementar, em agitadores rotativos a 125 rpm. A intensidade luminosa ao nível da cultura é de 120/uE m^ s^-^ (PAR). Sob estas condições, as culturas são mantidas num modo de crescimento semi-simultâneo até que atinjam um estado estacior nário de 2 - 4 x 10° células/ml.

Crescimento de Culturas sem luz (Crescimento de Culturas - às escuras):

Células da fase estacionária de crescimento de cul turas stock em presença le luz (7,5 ml) são transferidas para 750 ml do Peio A, num balão Erlenmeyer. As células são incubadas às escuras, com arejamento através de um tubo de arejamento submerso, a 25°C, durante 3 a 4 dias. Durante este período de tempo estas culturas de células y-1 desenvolverão sete a oito divisões celulares, perdendo toda a clorofila visível, e a concentração deverá estar compreendida no intervalo entre 2 x 10 células/ml e 3 x 10° células /ml.

Preparação das células a usar no Ensaio

As células sao colhidas a partir de uma cultura de crescimento às escuras, preparadas recentemente (750 ml) por centrifugação a baixa velocidade, isto é, cerca de 200 rpm, durante aproximadamente 5 minutos, a 20°C. As células foram ressuspensas suavemente em. 50 ml do Peio A. Uma amostra desta suspensão (aproximalamente 0,25 ml) deverá ser examinada segundo a mobilidade e, após fixação com uma solução aquosa de gluteraldeído a 1/, deverá ser feita uma contagem para determinar o número de células/ml. Uma contagem normal de células e de cerca de 5 ,7 x 10' células/ml. Alíquoas de 1 ml (10* células/ml) são colocadas em tinas de ensaio (por exemplo, Ealcon placas de cultura de tecidos - 24). Peste ponto, as células são- muito móveis e apresen• _

(fa' tam cor amarela.

composto do ensaio s dissolvido num dissolvente (acetona, etanol, dimetilsulfóxido ou água, de preferência em acetona) para desenvolver uma concentração que seja igua a 1000 x a concentração final. Um ,ul desta solução de ensaio é adicionada a cada duas placas com uma microseringa de 5 ou 10 ,ΛΐΙ.

Quatro placas-controlo por cada placa de cultura de tecidos são preparadas da maneira acima descrita, sem o composto de ensaio presente. As placas de culturas de tecidos são cobertas com uma tampa de plástico transparente e são colocadas numa câmara de crescimento, com uma intensidade de luz de 70 a 9o /uE m s ^χ, durante um intervalo de tempo de 13 a 16 noras, a 25°C. Se o conteúdo das placas de ensaio se apresentar amarelo, são extraídos de forma descrita na secção ''Avaliação de Resultados, abaixo. Se o conteúdo se mostrar transparente ou com uma coloração verde-pálida, são colocadas numa misturadora rotativa a aproximadamente 125 rpm, e são irradiadas durante 2 horas, com uma — —2 —1 intensidade luminosa de cerca de 500 ,,ur m s antes de serem extraídas.

Avaliação de Resultados

Uma solução aquosa de dodecil sulfato de sódio a 10/ (250 /il) e metanol (1 ml) é adicionada a cada placa de ensaio e ó prontamente misturada. Rermite-se o repouso de mistura na escuridão, durante 3 a 4 horas. As placas de culturas de tecidos são centrifugadas à temperatura ambiente e a baixa velocidade (2000 rpm) durante 5 minutos. Os sobrenadantes sãc emovidos e analisados num esuectrofotometro Eeckman model 35 entre 350 nm e 500 nm, para se verificar a presença de prctoforfirina IX, a 663 nm, cus é o pico de absorção de clorofila neste sistema dissolvente, e

o ao.

Analise de Dados:

Para cada placa um valor de esverdeamento é obtido subtraindo-se a leitura a 720 nm à leitura a 553 nm. Estes valores são médios para cada concentração do composto a ser ensaiado e para controlo. A percentagem de inibição é:

V_alor de esverdeamento médio para a concentração 100 x (1 - _específica_

Valor de esverdeamento médio para o controlo

Claims

REIVINDICAÇÕES

1§. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica contendo derivados de arilo heterocíclicos para o tratamento de tumores malignos da mama mediante um processo de aniquilação das células de tumores da mama por exposição das referidas células à luz na presença de um tetrapirrol activável pela luz, caracterizado pelo facto j de se misturar um composto que é um inibidor específico da transformação enzimática de protoporfirogénio em protoporj firina IX por meio de protoporfirogénio oxidase nas citadas j células, provocando assim a acumulação da protoporfirina IX nas referidas células, tendo 0 citado composto uma concentração de inibição de 50% (I^g) P^a^a a protoporfirinogénio oxidase inferior a 1 «lí com uma substância veicular farma| ceuticamente aceitável, de preferência compreendida dentro do intervalo de cerca de 0,1 partes em peso até 95 partes em peso de ingrediente activo para 99,9 a 5 partes em peso de substância ou substâncias veiculares.
2ã. - Processo para a preparação de composições j farmacêuticas para uso num processo de aniquilação de célu| las de tumores malignos da mama por meio da exposição das ' citadas células à luz, na presença de um tetrapirrol actii vável por acção da luz, caracterizado pelo facto de incluir um composto que é um inibidor específico da transformação | enzimática da protoporfirinogénio com obtenção de protoporfirina IX por acção de protoporfirinogénio oxidase nas rej¹ feridas células, causando assim a formação da protoporf irina il IX nas mencionadas células, não sendo 0 citado composto um j tetrapirrol e tendo um potencial de redox mais negativo do í que -500 mV e a referida composição compreender também uma ! substância veicular farmaceuticamente aceitável.
3- . - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se empregar um inibidor específico da transformação enzimática do protoporfirinogénio em protoporfirina IX por meio da protoporfirinogénio oxidase nas células do tumor da mama, causando assim a formação de protoporfirina IX nas referidas células, o qual possui uma CI_5Q para a protoporf irinogénio oxidase inferior a 1 aiM, e se destinar a uso terapêutico.
4- · - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de se empregar um inibidor específico da transformação enzimática do protoporf irinogénio em protoporf irina IX por meio da prot.oporfirinogénio oxidase nas células do tumor da mama, provocando dessa maneira a formação de protoporfirina IX nas referidas células, o qual tem uma CI^q para a protoporfirinogénio oxidase inferior a 1 ;uM, e se destinar à utilização no tratamento fotodinâmico de tumores.
5- . - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se empregar um inibidor específico da transformação enzimática de protoporfirinogénio em protoporfirina IX por meio da protoporfirinogénio oxidase nas células do tumor da mama, causando assim a formação da protoporfirina IX nas citadas células, não sendo um tetrapirrol e tendo um potencial de redox mais negativo do que -500 mV, para uso terapêutico.
6^. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 e 5 caracterizado pelo facto de se empregar um inibidor específico da transformação enzimática de protoporf irinogénio em protoporfirina IX por meio de protoporfirinogénio-oxidase nas células do tumor da mama, provocando assim a formação de protoporfirina IX nas referidas células, sendo diferente de um tetrapirrol e tendo um potencial de redox mais negativo do que -500 mV, para uso no tratamento fotodinâmico de tumores.
7^ã· - Processo para a aniquilação de células de tumores da mama por meio da exposição das citadas células à luz na presença de um tetrapirrol activável pela luz, caracterizado pelo facto de se tratar as mencionadas células com nm composto que é um inibidor específico da transformação enzimática de protoporfirogénio em protoporfirina IX por meio da protoporfirogénio-oxidase nas citadas células, provocando assim a formação da protoporfirina IX nas citadas células, empregando-se uma quantidade tal que, de preferência, origine uma concentração de agente inibidor da enzima local inferior a 50 ^uK, nomeadamente, inferior a 1 yuM ou menor, tal como 100 nM.
8&. - Processo para aumentar o teor de protoporfirina IX nas células do tumor da mama, caracterizado pelo facto de se tratarem as mencionadas células ou um organismo contendo as citadas células com um composto que é um inibidor específico da transformação enzimática do protoporfirinogénio em protoporfirina IX por acção da protoporfirinogénio-oxidase nas referidas células, causando assim uma formação de protoporfirina IX nas mencionadas células, numa quantidade de acordo com a reivindicação 7.
9§. - Processo para se detectar ou localizar as células de tumores da mama por meio do aumento do teor de porfirina das citadas células e do exame dos tecidos da mama sob uma luz estimuladora da porfirina e da observação da fluorescência proveniente do tumor caracterizado pelo facto de se tratar um organismo, que compreende as referidas células, com um composto que é um inibidor específico da tran£ formação enzimática do protoporfirinogénio em protoporfirina

IX por meio da protoporfirinogénio-oxidase nas citadas células, provocando assim a formação de protoporfirina IX nas mencionadas células.
10§. - Processo para a produção de protoporfirina

IX caracterizado pelo facto de se realizar a cultura de i „ microalgas eucarioticas no escuro ou sob uma luz que não excita a protoporfirina IX, na presença de uma quantidade ί eficaz de uma aril-triazolinona, uma aril-tetrazolinona ou | uma aril-triazinodiona, que é um inibidor da enzima proto!| porf irogénio-oxidase.

i i

⁽ 115. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de as microalgas serem do género ! das Chlamydononas.

J

125. - Processo de acordo com a reivindicação 10, • caracterizado pelo facto de o referido inibidor ser l-(4í -cloro-2-fluor-5-propargiloxi-fenil)-3-metil-4-difluormeS til-Á^-l,2,4-triazolin-5-ona.