JPH04501420A - ポルフィリンの製造とその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ボルフ　１ンの　゛　の　゛ 本発明の一面はガンの光力学的治療のような哺乳動物腫瘍細胞の光力学的治療に 関する。

ヘマトポルフィン誘導体またはそれから誘導されたポルフィリン（たとえばホト フリン■）を哺乳動物腫瘍細胞に供給してこのような細胞に適当な波長の光を当 てて細胞破壊を行なうことは今や周知のことである。このような光力学的治療は Ｐｈｏｔｏｃｈｅｅｉｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ ｕｍｅ　４６．　Ｎｏ、５　、　１９８７年１１月の特定組織を作る一連の文献 （以下“Ｐ＆Ｐ　４６−５”）の主題である。これらの文献に示されているよう に、このような光力学的治療は広範囲の種類のガン（気管支、膀胱、食道、肺、 皮膚、頭と首、脳、結腸、眼球内、および婦人科のガン類を包含する）の治療に 使用された。このようなポルフィリン感光性の生物化学的効果は膜タンパクの交 差結合、脂質の過酸化、若干の本質的な代謝物の搬送の阻止、リソソマルおよび ミトコンドリア膜の分解、若干の酸素の不活性化、およびポルフィリンの増大し た細胞吸収を包含することが記載されている（Ｐ＆Ｐ　４Ｂ−５、ｐａｇｅ　６ ９５）、ポルフィリン物質は一般に注射（たとえば静膜内注射または腹膜内注射 ）され、代表的な調剤量は体重１ｋｇ当り約２Ｂのホトフリン■である。

たとえば５ｐｉｋｅｓらのｒＰｈｏｔｏｄｙｎａｓｉｃ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ　ｏ ｆ　Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓｉｎ　Ｍｏｄｅｌ　Ｃａ１ｌ、　Ｔｉｒｓｕｅ　ａｎ ｄ　Ｔｕｍｏｕｒ　ＳｙｓｔｅｍｓＪに記載されているように、ポルフィリン物 質はりボゾームにくみ入れて注射（たとえば腹膜内注射）することができる、な お、上記の５ｐｉｋｅｓらの報文はＰｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ　ＴｈｅｒａｐＹ 　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒｓ　ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　（Ｇ。

ＪｏｒｉおよびＣ９＾、　Ｐｅｒｒｉａ共著）第４５〜５．３頁、Ｌｉｂｒｅｒ ｉａＰｒｏｇｅｔｔｏ、　Ｐａｄｎａ　（１９８５）に記載されている。

技術文献はヒトーエリスロサイト（Ｂｕｂｂｌｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ。

Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　５１１　（ １９７８）　１４１−１５１　）またはムリン・ルーケミア細胞（Ｋｅｓｓｅｌ 、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４２．１７０３−１７０６、　Ｍａｙ　 １９１！２）のような細胞へのプロトポルフィリンの導入は注目すべき感光性効 果をもっことを示している。上記のＫｅｓｓｅｌの報文は試験したものが最も有 力な感光剤であったと述べている。

然しながら、　Ｋｅｓｓｅｌおよびその他（たと＾ばＢｅｒｅｎｂａｕ＋ｓら、 Ｂｒ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　（１９１１２）　４５．５７１−５δｌ）がプロドロポル フィンを動物に注射したとき、彼らは腫瘍中に検知しつるプロトポルフィンを見 出さなかった。このことは体内に導入したプロトポルフィリンは循環中に容易に 失われうるものであることを示している。

膀胱ガンまたは肺ガンのような腫瘍の検出と局在化のためにヘマトポルフィン誘 導体および類似物質を使用することも周知である（たとえばＰ＆Ｐ４６−５、ｐ ａｇｅ７５９参照）。

本発明の一面において、このような光力学的治療における、または腫瘍の検出と 局在化の周知方法における、細胞の治療剤はポルフィリンではないか、あるいは ポルフィリンのみではない、その代りに本発明は酵素阻害剤を含み、これが細胞 中でのプロトポルフィリノーゲンからヘムへの酵素的転化を阻止し、それによっ て細胞中の外因性プロトポリフリンエｘの蓄積を生ぜしめる。

我々は植物細胞中のプロトポルフィリノーゲンをクロロフィルに酵素的に転化さ せるある種の除草剤化合物のような試剤が哺乳動゛　物細胞中でのプロトポルフ ィリノーゲンをヘムに酵素的に転化させることも阻止することを確かめた。我々 はこのような試剤による阻止が恐らく酵素（プロトポルフィリノーゲン・オキシ ダーゼ、ＥＣ１，２，３，４）によるプロトポルフィリノーゲンのプロトポルフ ィリンＩＸへの転化の工程に影響を及ぼしてプロトポルフィリノーゲンがプロト ポルフィリンＩＸへの通常の酵素経路に従いえなくて通常の酵素経路の外側（た とえば細胞器管外側）で酸化され、その結果としてヘムへの通常の転化に利用で きない場所でプロトポリフィリンＩＸの蓄積をもたらし、そのために、細胞が光 を受けるとき、この蓄積されたプロトポリフィリンエＸは、上記の光力学的治療 に示されるような細胞破壊効果をもつ、と信じている。

本発明の酵素阻害剤は次の点でプロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼの特異 な阻害剤である。すなわちそれらは変性剤もしくは交差結合剤（たとλばスルフ ヒトシール試剤）のような一般的な酵素量として働かず、好ましくはそれらは電 子受容体のような酸化条件に影響を及ぼす物質ではないからである。従って本発 明の好ましい試剤は約−５００ｍＶより大きい負のレドックス電ｔｈたとえば一 ８００ｍＶより大きい負のレドックス電位をもつ。

（ｉｆｆ位の測定はサイクル電圧計によって又はポーラログラフ的に行なわれる ように、たとえば試剤の非プロトン性溶媒中で通常の方法で行なわれる）９試剤 がテトラビロールではなＩいこと及びプロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ の工、。が約ｉｐ、Ｍ未満たとえば約０．３μＭ未満であること、【たとえばＩ Ｉ・が約０．　１あるいは０．０３あるいは０．Ｏ１μＭ１μであること）も好 ましい。

酵素阻害剤は好ましくは植物材料のプラズマレマを中断する高い性能をもつもの である。この性能の１つの試験法はＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、　８４． １１１４−５　（１９ｇ７）のＨａｉｌｉｎｇおよびＰｅｔｅｒｓの報文中に記 載の流出（ａｆｆｌｕｘ）実験である。このような試験（下記の付表へに更に記 載されている）において、１００μＭの処理速度において、好ましくはＩＪＡＭ 未満の処理速度において少なくとも５０％の合計流出を示す、非常に活性な物質 、たと＾ば１−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシフェニル ）−３−メチル−４−ジフルオロメチル−６Ｍ−１，２，４−トリアゾリンー５ −オンまたはラクトフェン（下記）はｌ１００ｎ濃度において９０％以上の合計 流出百分率を与える。

植物のプラズマレマの中断の物質の能力の別の試験は光誘発緑化阻止試験（下記 の付表Ｂに更に具体的に説明する）である、この試験は暗−漂白タラミトモサス ・リインハルディ突然変異体Ｙ−１の光による線化な阻止する能力を測定する。

上記の突然変異体Ｙ−１は藻の一種であって、暗色で生育するときはクロロフィ ルを作らず、藻の集塊は新しい非緑色細胞の存在により漂白され、光に露出させ ると再びクロロフィルを作る０本発明に使用する好ましい化合物（試剤）の多く は、該化合物を１０−＠Ｍの濃度、更に好ましくは１０−”Ｍ以下（たとえば１ ０−’Ｍ）の濃度で使用するとき、光による緑化を少なくとも５０％だけ阻止す る能力をもつ、また、この化合物は、光線化阻止試験に右いて上記濃度で使用し たとき、クロロフィルのピーク（この系における約６６８ｎｍのピーク）よりも 高い約４０５ｎｍで光吸収ピークを示す上澄液を与える。すなわち上澄液はピー クの高さが６６８ｎｍピークの最高値の２．３、または４倍である４０５ｎｍピ ークを示す。

本発明の実施に使用しつる酵素阻害剤の中には下記のクラス（Ａ−Ｄ）の除草剤 化合物がある。

Ａ、　一般式Ｐｈ−ＮＨａｔのアリール複素環除草剤；ただし式中のｐｈは置換 フェニル、好ましくは２．４−ジ置換フェニル、更に好ましくは２．４．５−ト リ置換フェニルであり、Ｎ　Ｈｅ　ｔは１〜４個の環窒素原子をもつ次式の５員 または６貝の複素環である。

ただし、Ｑは複素環の残余部分を表わし、Ｒは水素または置換基を表わす、この 種の化合物としてＪ、　ｉ’ｅｓｔｉｃｉｄｅ　Ｓｃｉ、　１１．６３５−４６ ０　＋１９８６）の吉村らのｒｔｈｅ　ｃｙｃｌｆｃ　ｉｒｍｉｄｅ　ｃｌａｓ ｓ　ｏｆｈｅｒｂｆｃｉｄｅｓＪに命名されているような物質があげられ、この 報文中には具体的な化合物として次のものが示されている。

化合物Ｉはアリールオキサジアゾール除草剤すなわち２−ｔ・ブチル−４−（２ ，４−ジクロロ−５−インプロポキシフェニル）−Δ２−１．３．４−オキサジ アゾリン−５−オンである。

本発明において使用しつる他の２−アルキル−４−（２，４，５−トリ置換フェ ニル）−Δ２−１．３．４−オキサシリンー５−オンはたとえば米国特許第３． ３８５，８６２号、同第３，８３６．５３９号および同第３．８７６．４１３号 に記載されている。

化合物■はアリールテトラヒドロインダゾール除草剤すなわち３−クロロ−２− （４−クロロ−２−フルオロ−５−イソプロポキシフェニル）−４，５，６，７ −テトラヒドロ−２Ｈ−インタゾールである０本発明に使用しつる他の３−置換 −２−（２゜４．５−トリ置換フェニル）テトラヒドロインダゾールはたとえば 米国特許第４，６７０，０４３号に記載されている。

化合物■、■およびＶはアリールテトラヒドロフタルイミド除草剤である０本発 明に使用しつる他のアリールテトラヒドロフタルイミドはたとえば米国特許第４ ，４３１，８２２号、同第４゜６７０．０４６号、同第４．６７０，０４２号、 同第４．４３９．２２９号、ならびに国際出願（ＰＣＴ）刊行物ＷＯ３７１０７ ６０２に記載されている。後の２者の刊行物にはまた使用しつる他のＮＨａｔ環 も記載されており、このような環はたとえば米国特許第４，４３９．２２９号の 第４欄２５行〜第５欄２０行、およびＷＯ８７１０７６０２の第１２〜１４頁に 記載されている。

Ｐｈ−ＮＨａｔ型の他の好適な除草剤は次のとおりである。

アリールトリアプリノン類；たとえば米国特許第４．３１８゜７３１号、同第４ ．３９８，９４３号、同第４，４０４，０１９号、同第４，７０２，９４５号、 同第４，７０５．５５７号、同第４，７０２，７６３号、同第４．７８１．１７ ４号、ならびに国際出願（ＰＣＴ）ＷＯ８５１０１６３７、ＷＯ３５１０４３０ ７、ＷＯ３７１００７３０、ＷＯ３７１０３７８２、ＷＯ８６１０４４８１、お よびＷＯ３８１０１１３３に記載されているアリールトリアゾリノン類。

アリールトリゾリノン類ｉたとえば米国特許第４，７３４．１２４号、ならびに 国際出願（ＰＣＴ）ＷＯ８５１０１９３９右よびＷＯ８７１０３８７３に記載さ れているもの。

アリールトリアゾンジオン類；たとえば米国特許第４，７５５．２１７号および 同第４，７６６．２３３号ならびに国際出願（ＰＣＴ）ＷＯ８６１０００７２に 記載されているもの。

アリールヒダントイン類；たとえば米国特許第４，４２７．４３８号に記載され ているもの。

アリールウラゾール類；たとえば米国特許第４，４５２．９８１号に記載されて いるもの。

アリールへキサヒドロピリダジン類たとえば米国特許第４，６１９．６８７号に 記載されているもの。

Ｂ、　アリール複素環ウレタン類。

たとえば米国特許第４，５２１．２４２号に記載されているアリール複素環ウレ タン類があげられる。

Ｃ０ｐ−ハロまたはｐ−ニトロフェノキシフェニル構造をもつようなフェニルエ ーテル除草剤、たとえば商業的に入手しうる下記の物質： ５−（２−クロロ−４−（ト　メチル　５−　（２，４−ジクリフルオロメチル ）フェノキ　クロフエノキシ）−２−ニトリ）−２−ニトロ−Ｎ−メタ　ロペン ゾエート（ビフェノッンスルホニルベンズアミド　クス） （ホムサフェン） ナトリウム　５−（２−クロ　２−クロロ−１−（３−エトロー４−（トリフル オロメチ　キシ−４−ニトロフェノキルフェン）　フェン） 他の好適な商業的に入手しうるジフェニルエーテル除草剤は次のとおりである： ラクトフェン：１−（カルボエトキシ）エチル　５−（２−クロロ−４−トリフ ルオロメチルフェノキシ）−２−ニトロベンゾエート、 フルオログリコフェン：　（カルボエトキシ）メチル　５−　（２−クロロ−４ −トリフルオロメチルフェノキシ−２−ニトロベンゾエート、 フロメソフェン：　５−　（２−クロロ−４−トリフルオロメチル）フェノキシ ）−Ｎ−メチルスルホニル−２−二トロペンズアミド、 クロロニトロフェン：２，４．８−トリクロロ−（４−ニトロフェノキシ）−ベ ンゼン、 フルオロジフェン＝２−二トロー１−（４−ニトロフェノキシ）−４−トリフル オロメチルベンゼン、 ニトロフェン＝２．４−ジクロロ−１−（４−ニトロフェノキシ）ベンゼン、 クロメトキシフェン：４−（２，４−ジクロロフェノキシ）−２−メトキシ−１ −二トロベンゼン。

更に別の好適なジフェニルエーテル除草剤はメチル　５−（２−クロロ−４−ト リフルオロメチルフェノキシ）−２−ニトロアセトフェノンオキシム−〇−アセ テートである。

Ｄ、　アリールピラゾール除草剤たとえば米国特許第４，５６３．２１０号、同 第４．４５９，１５０号および西独公開公報３５２０３２７Ａ１゜ Ｅ、　次式の化合物 ただしｘ″はＯまたはＳであり、ｐｈは前記定義のとおりである。たとえば公開 欧州特許出願２７３４１７またはターウエントアブストラクト　Ｎｏ、８７−０ ４０７４９に記載の化合物類である。

本発明の試剤による治療は皮下注射または腹膜内注射によって行なうことができ る。試剤は医薬として許容しうる担体に溶解または分散した試剤から成る滅菌組 成物として、たとえば食塩水（たとえば０．９％ＮａＣ１）または２　、５　Ｂ ／　ｍｌの濃度のＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような等張 水溶液として使用することができる。あるいはまた試剤はマッグ・パブリッシン グ・カンパニー刊行のＲｅ＋ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｎｔｉｃａ ｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、　！９８５　（第１７版）の第１６５９−１６６０頁に記 載のようにしてリン指体担体を用いて製造されるようなりボッマール系中の試剤 から成る滅菌組成物として使用することができる。たとえばＪｏｒｉらの、Ｂｒ 、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　（１９８３）、　４８．　ｐｐ　３０７に記載の処方 と同様にして、５１．４Ｈのジパルミトイルージホスファテイジルーコリンを１ ０＠ｌの試剤１ミリモル溶液（クロロホルム−メタノール、９：１ｖ／ｖ中）に 溶解し、十分に混合した後に溶媒を３０℃で真空下に除去して、固体を得ること ができ、そしてこの固体は１５０ｍＭのＮａＣ１を含むｐＨ７，４のＯ，’ＯＩ Ｍリン酸塩緩衝液中に再懸濁させることができ、生成する曇った溶液は次いで５ ０℃で３０分間、音波処理することができる。

本発明の実施に使用することのできる酵素阻害剤は、酵素阻害剤を特定の腫瘍の 場所に当てるための手段として５業技術に周知のり一カー技術を使用して、適当 な腫瘍特異性モノクロナール抗゛　体（ＭＡＲ）に結合させることができる。

本発明に使用する酵素阻害剤はたとえば下記の実施例６に説明するように食品に 添加することによって、好ましくは医薬的に許容しうる担体と一緒の希釈形体で 、単一の摂取によって使用することもできる。

水溶性塩であるか又は酸性で水溶性ナトリウムもしくはカリウム塩を作る酵素阻 害剤を使用するのが経口投与にとってとくに望ましい、このような水溶性塩はた とえば国際出願（ＰＣＴ）ＷＯ８７１０３７８２に記載されている種類の酸性ス ルホンアミド〔たとえば下記の実施例６中の試剤ｃ〕、またはＷＯ３５１００１ ９３９およびＷＯ３７１０３７８７３に記載のもの、あるいはその水溶性塩だと 、えばアシフルオルフェンとして知られているナトリウム塩である。

本発明に使用しつる酵素阻害剤は通常の医薬処方だとりば錠剤で例として砂糖ペ ーストおまび／またはシロップで被覆されつる圧縮錠剤）、座薬、カプセル（た とえば硬質ゼラチンカプセル）、懸濁液、溶液、粉末またはアンプルにくみ入れ ろことができるゆこのような処方において、試剤は医薬的に許容しつる固体ハ逼 は、び／または液体担体（所望ならば栄養剤であってもよい）との混合で存在さ せることができる。たとえば担体はコ・−ンスターチのような固体であ−，＞で もよく、あるいは水または食用油または鉱油、または溶媒（たとえばジメチルス ルホキサイド）のような液体希釈剤であってもよい、酵素阻害剤（複数）の混合 物を使用することもできる。たとえば下記の実施例６の試剤６ｃとアシフルオル フェンとの、たとえばほぼ等しい割合の、混合物も使用することができる。使用 すべき調剤量は日常の実験によって決定することができる。このような実験は５ 業技術において周知であり、たとえばＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ 　ｉｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅ＊ａｔｏｇｏｇｙＶｏ１．２．　第２１ｓｓｕ ｅ　（１９Ｂ４）　、第８３−１１６頁中のｒＰｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ　Ｔｈ ｅｒａｐｙ　ｆＰＤＴ）　ｏｆ　Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　Ｔｕｍｏｕｒｓ　Ｊ　な るＤｏｕｇｈｅｒｔｙの報文中のホトフリン■について記載されている種類の実 験があげられる。

以下の実施例により本発明を更に具体的に説明する。

１胤五工 対数成長相（１１のファルコン組織培養フラスコ中で５日間３７℃で培養したも の）中のＨｅＬａ細胞（アメリカン・タイプ・カルチエアー・コレクションから 得た腫瘍研究に常用されるヒト腫瘍細胞Ｉｌりをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ） 中で洗浄した。

ＰＢＳ　（２■ｌ）中の０，２５％トリプシン溶液を加え、数分後に細胞をフラ スコからおだやかに取出し、１０％（Ｖ／ｖ）不活性化仔牛血清、２００ｍＭグ ルタミン溶液（０，８５％食塩溶液中）１．１＋＋＋１％および１１，０００単 位ペニシリン／１１，０００ｒｒ＋ｃ　ｇストレプトマイシンを補給したミニマ ム必須媒質（ＭＥＭ）中の２５ｍＭへベス溶液１０．ｏｉＩｌ中に入れた。

次いで、生成再懸濁際細胞培養物の５．０＋１分別量０それぞれを５０ｍ１のフ ァルコン組織培養フラスコに入れ、次いで（対照標準を除いて）処理剤と混合し た。これらの分別量を次いで３日間３７℃におい゛Ｃ暗所で培養した６次いでこ れらの細胞を除き、次のようにして緑色光のもとで抽出した。

ＰＢＳ中の０．２５％トリプシン溶液０．８■ｌの添加によりフラスコ底部から 細胞を除いた。暗所での１時間の培養後１に、細胞と媒質をフラスコから除き、 丸底の遠心分離管に入り、次いで凍結−解凍のサイクルを２回行なって細胞を破 壊し、抽出した。

この破壊後の細胞懸濁物の検査は手つかずの細胞がないことを示した０次いで１ ０＋１の塩基性アセトン（９０％アセトン：１０％の０．ＩＮのＮＨ４０Ｈ）を そＪｌぞれの管に加え、これらの管を遠心分離してタンパクと細胞断片を除いた 。１０ｍ１の水をこの上澄液に加え、次いで０．５■ｌの飽和ＮａＣ１水溶液を 加えた。

次いで２ＭのＫＨオＰ０４を滴下状に加λることによってｐ　Ｈｉ６．８に調節 した１次いで水性アセトン抽出物をＣ８ベーカー・・ブレツ・カラムに加えた。

このカラムを乾燥し、次いで２＋＊ｌの水で洗浄した。テトラビロール類を２Ｘ １．５ｍｌ容量の９０／１０ＣＨｓ　ＯＨ／　Ｈ＊　Ｏで溶離した１次いで抽出 物を蛍光分光計上で定置した。

この実験に使用した処理剤は次のとおりであった。

Ａ、　テトラビロール類の周知の前駆体である５−アミノーレＢ、　次式のアシ フルオルフェン−メチル：Ｃ１次式の除草剤： Ｄ、　次式の除草剤： Ｅ、　次式の除草剤： 試剤Ａはフィルター滅菌した２５０ｍＭ水溶液（ｐＨ６，５）として供給した。

試剤Ｂ、Ｃ，ＤＪ３よびＥはアセトン中の５０ｍＭ溶液として供給した。アセト ンは対照標準にも加えて０．２％ｖ／ｖの溶液を与えた。細胞培養物に加えた試 剤の量は下記の表１に示す濃度を与える量でありな、生成したテトラビロール・ プロトポルフィリンＩＸ（“プロトＩＸ”と呼ぶ）の量を表１に示す。

１−よ ’ＨｅＬａ　のテトラビロール Ａ　５０００　４１８４２　４．２ Ｂ　１００　１２９２１　１．３ Ｇ　１００　３３４７７　３．５ Ｄ　ｔｏｏ　１０５５１　１．Ｉ Ｅ　１００　８９Ｂ７　０．９ 対照標準　２７９５　０．３ 実ＪＪＬλ ６個の１１ファルコン組織培養フラスコ中３７℃で６日間培養した対数生長相中 のＨｅＬａ細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。ＰＢＳ中の０． ２５％トリプシン溶液を加え、数分後に細胞をおだやかに除き最小必須媒質（Ｍ ＥＭ）中のヘベスの２５ｍＭ溶液１１０ｍ１中に入れ、１０％ｖ　／　ｖ不活性 化仔牛血清、０．８５％食塩溶液中の２００ｍＭのグルタミン溶液１．１ｍ１． Ｊ５よび１１，０００単位ノヘ＝シＩ７　：／／　１１　、　ＯＯＯｍｃｇのス トレプトマイシンを補充した。

再懸濁させた細胞培養物の分別量（それぞれ５．０ｍ１）を５０−１のファルコ ン組織培養フラスコ中に除草剤と共に又は除草剤なしに入れ、３７℃で４日間暗 所において培養した。除草剤は実施例１のように希薄アセトン溶液で加えた。対 照標準にもアセトンを加えた０、２％（Ｖ／Ｖ）のアセトン濃度を与えた。除草 剤の量は下記の表２に示す調度を与える濃度であった。

処理剤は次のとおりであった。

Ｂ、　実施例１のＢと同じ。

Ｃ０実施例１のＣと同じ。

Ｆ、　次式の除草剤： 抽出：それぞれのフラスコからの媒質を丸底ガラス管に入れ。

フラスコの底部に付着している細胞を０．２５％トリプシン溶液０．５ｍｌの添 加によって弛め％３７℃で数分後にフラスコから洗って再び媒質と混合した０次 いで１００μｌの分別量をそれぞれの細！ｌａ！＆濁液から除いて細胞密度を決 定した。残りの５．４ｉｓｌの細胞懸濁液を次いで３０分間音波処理して細胞を 破壊した。

次いで１０ａ＋１の塩基性アセトン（９０％アセトン４１０％の０、ＩＮのＮＨ ，ＯＨ）をそれぞれの管に入れ、管を遠心分離してタンパクおよび細胞破片を除 いた。５ｍｌの水を上澄液に加え、次いで０．５ｍｌの飽和ＮａＣ１水溶液を加 えた０次いで２ＭのＮ１（ｌＰＯ４を滴下状に加えてｐＨを６．８に調節した。

この水性アセトン抽出物を次いでＣ８ベーカー・ブレブ・カラムに充填した。こ れらのカラムを乾燥し、次いで２ｍｌの水で洗浄した。３耐の９０／ｌ　ＯＣＨ Ｉ　ＯＨ／Ｈ茸０でテトラビロール類を溶離した。実施例１で述べたように、こ れらの抽出法のすべて（ま非ブロトボルフィンエＸ励起光（たとえば緑色光）の もとて又は暗所で（たとえば不透明カバー付き容器中で）実質的に完全に行なっ た０次いで抽出物の蛍光を５ＰＥＸ蛍光分光計で測定した。予め定めた消滅係数 を使用してプロトポルフィリンＩＸ（“プロトＩＸ”）の蓄積を定量した。これ らの結果を下記の表２に示す。

ｕ −の　およ　ロトｌＸ０１１ Ｂ　Ｚｏｏ　９９　５．２０　２３６４Ｆ　１００　１０６　２．７１　１２３ ２ＣＺｏｏ　５２　４．４１　２００５ Ｃ１０−１５”　０．５７　２５９ ＣＩ　−２６’　００１９　８６ 注）傘　ｒ成長阻止」の負の％は成長が起ったことを示す。

参参　ＩＱ’個の細胞当りの平均値。

傘拳傘　対照標準の％。

本発明の別の面はプロトポルフィリンＩＸ（以下「プロトＩＸ」と呼ぶ）の製造 に関する。この面において、真核微細藻はプロトボルフィリーノーゲンからプロ トＩＸへの酵素的転化を阻害する試剤（上記）を含む媒質中で暗所で（または非 ブロトエ、Ｘ励起光のもとで）有機栄養的に成長する。媒質または藻類あるいは その両者を次いで処理してプロトＩＸを抽出し、それをクロロフィル、カロチノ イドおよび細胞断片などから分離する６分離は任意の通常の方法で行なうことが できる。たとえば液相クロマトグラフ（反転液体クロマトグラフを含む）によっ て、溶媒抽出によって、あるいはキレート化によってプロトエｘを沈殿すること ！こよって行なうことができる。キレート化はＦｅ、ＺｎまたはＭｇのような金 属を用いて行ない、生成キレ・−ト化合物を除き、そして所望ならばプロトＩＸ を（希酸によるキレートの周知の処理によって再生する。

分離工程は非プロトＩＸ励起光（たとえば付表Ａの暗さの見出に述べである緑色 光）のもとで、あるいは暗所で行なわれる。鉄キレートはそのような光に感光性 でないので、ｌ！光はこのような材料を取扱う際には更に許容性がある。

微細ＦＩＡ類は好ましくは約１５〜３０℃の範囲の温度で細胞懸濁液として成育 される。阻害剤の濃度はたとえば約１０−’〜１０１Ｍでありうる。使用しつる 微細藻類の例はセネデスマス・エスピー、クラミドモナス・レインハルディ、ユ ーグレナ・エスピー、およびバミレリオブシス・フィリホルミスである。

実ｍ旦 クラミドモナス・レインハルディ（野生種類）の対数相培養物は下記の培養媒質 を使用してステンレス鋼バット（たとえば３００１）に小分は培養される。１− （カルベトキシ）エチル５−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェノキシ ）−２−二トロペンゾエート（商業的フェニルエーテル除草剤であるラクトフェ ン）を加えて１０−’Ｍの濃度を与え、０．１％のアセトン最終濃度を与える。

この混合物をおだやかに攪拌および／またはエアレーションしながら４〜７日間 ２５℃で暗所において成長させる。暗さを保ちながら、バットの内容物を濾過し 、濾液を処理してプロトボルフリンＩＸを回収する。

プロトボルフリンＩＸを回収するための１つの処理法は、反応バットの内容物を （暗さを保ちながら）濾過してその濾液にアセトンを加えることである。この混 合物を石油エーテルで抽出する。この水性アセトン混合物を次いでジエチルエー テルで抽出し、ジエチルエーテルを蒸発によって除去して残渣を残す、この残渣 をメタノールにとかし、反転相クロマトグラフにかけてプロトボルフリンＩＸを 得ろ、また、実施例１および２に記載の回収法も使用することができる。

１１五旦羞 −」■Ｌ−−−　−ＬＩＩ−−りしｌ−１肚ｄムクエン　酸ナトリウム・６Ｍｍ Ｏ１，７ｘ　１Ｇ−’Ｍ　１０％　５痕跡金属類　以下のとおり　以下のとおり 　１０ＦｇＣ１ｇ／６Ｈ１００，３７Ｘ　１０−”ＩＪ　１％　１（：ａＣ１ｇ ／２ｆｉ、ＯＯ，３１ｉ　ｘ　１０−”Ｍ　５．３％　Ｌ財ＳＯ４／７Ｌ０　１ ．２　Ｘ　１０−’Ｍ　１０％　３ＮＨ，ＮＯｘ　３．７　ｘ　１０−”Ｍ　１ ０％　３ＫＨ＊Ｐ０．　２．２　ｘ　１０−”Ｍ　１０％　３Ｋｇ）ＩＰＯ４１ ，７ｘ　１０−’Ｍ　１０％　３ＣＨｍＣＯＪａ　７．５　Ｘ　１０−”Ｍ　１ ０％　１０のス　ッ ＨｍＢｏ、　１００　−ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・　７Ｈｔ　Ｏｌ　００　ｍｇ／ＬＭｎ　Ｓ　Ｏ４・　４　Ｈａ　Ｏ ４０ｍｇ／　ＬＣＯＣ１１・　６）１ｍ０　２０　ｍｇ／ＬＮａＭＯＯ４−２Ｈ ＊　０　２０　ｍｇ／ＬＣｕＳＯａ　４　ｍｇ／Ｌ クラミドモナス・レインハルディの使用に代わる別法は上記の媒質上で培養した センデスマス・エスピーを使用し、酢酸ナトリウムをグルコースに置き換えるこ とである。

１立五Ａ この実施例はラクトフェンの代りに１−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロ パルギルオキシフェニル）−３−メチル−４−ジフルオロメチル−Δ”−１，２ ，４−トリアゾリン−５−才ンなる除草剤化合物を使用した以下は実施例３と同 じである。

１立五Ａ ＬＪ二迭１ プロトボルフ　ｔノーゲンエＸ　“ブロトゲンＩＸ”　プロＩ−Ｉ　Ｘを米国ユ タ州ローガンのポルフィリン・プロダクツから購入し、Ｔ、Ｐ、　Ｆｕｅｓｌｅ ｒらのＴ’１ａｎｔ　Ｐｙｓｉｏｉ、、　ｆｉ７．２４６−２４９　（１９８１ ）に記載の方法により精製した。　Ｎｕ、　ＪａｃｏｂｓおよびＪ−Ｍ、　Ｊａ ｃｏｂｓのＥｎｚｙｍｅ、　２８．２０６−２１．９　（１９８２）に記載され ているようにＮａ／ＨｇアマルガムによりプロトＸｘを還元することによってプ ロトゲンｒＸを新たに製造した。その際に精製プロトエＸを３００μＭの濃度で 使用した。

ｎ材上　クカンパ−（ククミス・サテイバスフＬ、カルティパー「ライスコンシ ン５ＭＲ１８Ｊ）を商業用（９−４５−１５）肥料で湿潤させたバーミキ二上の 暗い生育室中に植えた。これらの苗を２５℃、相対湿度８０〜９０％で生育させ た。２５μＥ／ｍ−”５ｅｃ−’　（ＰＡＲ）の測定強度をもつ光で６０分サイ クル毎に１分の光により間けつ的な照明を、電子タイマー制御のジェネラル・エ レクトリックのＢｒｉｇｈｔ　５ｔｉｃｋによって、供給した。

これはデンプンの保存および初期クロロフィル水準を最少にしながら迅速なりク ロフィル合成をなしつる組織を与えた。

クロロプラスト単１　発達しつつあるクロロプラストはＴ、　Ｐ。

Ｆｕ６５１６ｒらのＰｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　７５６６２−６６４　ｆ １９８４１　に記載されているようにして単離した。ただし、最終の精製工程に おいて、ブラスチドは４５％（Ｖ／Ｖ）ではな（て４０％のパーコール・クッシ ョンにより遠心分離した。０．５Ｍのマニトール、２０ｒｎＭＴＥＳ、１０ｍＭ のＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　（ｐ　Ｈ７、７）　、　１　ｍ　ＭのＥＤＴＡ、１ｍＭの Ｍ　ｇ　Ｃ１友、１％（ｖ　／　ｖ　）牛血清、および１ｍＭのジチオエリスリ トールを含む分析緩衝液中に上記のクロロプラストを再懸濁させて２ｍｇタンパ ク／　ｔｎ　ｌの濃度をえた。

プロトボルフ　１ノーゲン・オキシ　−ゼの　Ｊ、　Ｍ。

ＪａｃｏｂｓおよびＮｕ、　ＪａｃｏｂｓのＡｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、、　２２９゜３１２−３１９　（１９δ４）に記載の方法のよう にして分析を行なった。クロロプラストの試料（０、２ｍｌ）を、種々の濃度の アシフルオルフェン−メチル（ＡＦＭ”’）により、または０．２％（ｖ　／　 ｖ　）アセトン（対照標準として）により１５分間暗所で予備培養した０次いで ５０μｌの新しく調製したブロトゲン（約１５ｍＭ）を上記の懸濁液に加えて反 応を開始させた。　Ｎ、Ｊ、　ＪａｃｏｂｓおよびＪＪ、　ＪａｃｏｂｓのＥｎ ｚｙｍｅ、　２８．２０６−２１９　（１９８２）に記載の１％（Ｖ／ｖ）トウ イーン２０（ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノラウレート）、５０ｍＭの トリス−ＭＣＩ、ＰＨ８，５，１ｍＭのＥＤＴＡ、ｉｍＭのジチオエリストール （５ｍＭのグルタチオンの代り）から成る蛍光分析媒質２．７５ｍ１の添加によ って１分析を終らせた９次いでこの懸濁液を、混濁生物学的試料のための前面蛍 光オプション付きの５ＰＥＸフルオロ　ログ−２−蛍光分光計上で直接に読んだ 、生成したプロトＩＸの量を、蛍光媒質中の精製プロトＩＸから発生した標準白 ＃ｉ（プロトＩＸ：６３０ｎｍでの放出（４００ｎｍでの励起の際の）の量の標 準曲線から定量化した。

上記の分析におけるプロトＩＸへの非酵素的酸化の量を決定するために、活性ク ロロプラストの懸濁液の代りにクロロプラストを８５℃で１５分間の加熱するこ とによって不活性にした懸濁液を使用して同じ分析を行なった。このようにして 生成したプロトＩＸの量を活性クロロプラストの存在下で生成したプロトＩＸの 量から差引くと酵素的に生成したプロトＩＸの量かえられる。これらの結果を図 １に示す（図中でＬＳＤは常法どおり最少の有意差を示す）９図１は工、。値（ ５０％阻止を与える濃度）が０．１ａＭ未満すなわち約０．０３ｇＭであること を示している。

クロロプラスト懸濁液（ＡＴＰの存在下）中のプロトＩＸからマグネシウム・プ ロトＩＸの酵素的転化に及ぼす１０ｇＭのＡＦＭの効果の分析は、ＡＦＭがこの 転化に阻止効果をもたないことを示した。

！五且互 この実験において、腫瘍をもつマウスの飼料に酵素阻害剤を加えた。対照標準と して使用したマウスの若干については飼料に酵素阻害剤を加えなかった６次いで これらのマウスを殺し、それらの腎臓、腸、副腎、肝臓および腫瘍を除き、それ らのプロトエＸ含量を分析した０次の酵素阻害剤を使用した。

更に詳しくは、これらのマウスはゼロ８目に右肩にＳＭＴ−Ｆ皮下腫瘍を注射し たＤＢＡ／２　Ｈａマウスであった。これらのマウスは個々に室に入れ、１日目 に未処理ビュリナ・ロープント・チャウ５００１　Ｍ　ａ　ｓ　ｈを与え、その 後に２〜１０日目に白目らのマウスに試験すべき阻害剤２０００ｐｐｍで処理し た同じＭ　ａ　ｓ　ｈを与えた（なお、対照標準については、同じ未処理Ｍ　ａ 　ｓ　ｈを与えた）、Ｍａ５ｈの処理は試験すべき阻害剤のアセトン溶液の少量 をＭ　ａ　ｓ　ｈに混合することによって行なった。これらのマウスを次いで１ ００日目殺した。ただし阻害剤６ｊで処理したマウスは７日目に殺した０組織を ４℃で一夜冷蔵してからプロット乾燥し、それぞれの組織試料の新鮮重量を記録 した０次いで組織を５ｍｌの（腸および肝臓の場合には１０■ｌの）アセトン− Ｏ，ＩＮ−ＮＨ，ＯＨ（９：　１、ｖ　／　ｖ　）中でホモジナイズした。これ らのホモジナイズしたものを次いで１５００Ｇで遠心分離し、上澄液を５ＰＥＸ 　ＦＡ１１２蛍光分光計で分析した（プロトＩＸの最適条件は４００ｎｍの励起 、６３０ｎｍ波長の放出）、プロトＩＸ蓄積は組織１ｇ当りのｃｐｓ　（蛍光カ ウント数／放出した秒）として決定した。これらの結果を下記に表示する（これ らの結果はそれぞれの処理についてマウス２匹当りの平均値である：ただし阻害 剤６ｆ、６ｈ、６ｉおよび６ｊによる処理についてはそれぞれ一匹のマウスのみ を処理した）。

ラム　のプロ）ｒＸ　−Ｃｓ　Ｘ　１０”６ａ　１２０３　４２９１　１０８１ ７　６５７２　５８７０″”　１４３６ｂ　１５２０　１２６１　２４４１　２ ５２９　５５７７’″’　９０６ｃ　１４３３６　２７３９　１６１８６　１３ ７９０　９９３７”　１５７６ｄ　２００６　１５８１　１２８６５４４３　５ ５６５”　２９４６ｅ　８３７　ｇ７６　９１５　１３３１　２０６９”　１６ ５６ｆ　４４９　１１７０　６６１　５６１１　１１５７　６９６ｇ　１６６　 ８０３　６０６　１９８４　４６６　２５０６ｈ　２９ｇ　９１４　５８５　２ ２５９　５８４　１９２６ｉ　９３２　１５１０　４０１４　３６９４０　３４ ５４　２０６ｊ　１２５１　５３８　３１５　４９１　５７２　１１対照標準　 ２３９　５３６　４９４　１５０４　２３３　２００４２４” 注）傘　表中の数値は（生のデータ）ＸＩＯ−”に等しい。

拳傘　測定は１部の試剤に対して３部の塩基性アセトンで希釈した試料について 行なった。

これらの数字は組織１ｇ当りのプロトＩＸのμｇ数として表示して、それぞれの 組織中、次のプロトＩＸの濃度に相当する。

’　！ｉｌＪ！ｉ　ＬＪｉ　ＩＩＬＪ　ＬＪｉ　ＬＪｔ　ＪＩＬ６ａ　ｌ　１　 ３９　９９　６０　５４６ｂ　１４　１２　２２　２３　５１ ６ｃ　１３１　２５　１４８　１２６　９１６ｄ　１８　１４　１１７　４　５ １ ６ｅ　’　８　８　８　１２　１９ ６ｆ　４　１１　８　５１　１１ ６ｇ　２　７　８　１８　４ ６ｈ　３　８　５　２１　５ ６ｉ　９　１４　３７　３３７　３２ ６ｊ　１１　５　３　４　５ 対照標準　２　５　５　１４　２ 上記のＤｏｕｇｈｅｒｔｙによる文献は同種（ＤＢＡ／２　Ｈａ）のマウスにｌ 　Ｏｍｇ／　ｋｇのヘマトポルフィリン誘導体を注射した後に同種（ＳＭＴ−Ｆ ）の腫瘍中のポルフィリンの濃度について３．６ｇｇ／ｇの数字を与えている。

他の技術文献（Ｍｏａｎら、　Ｐ＆Ｐ４６−５、ｐｐ　７１３−７２１　、９ｐ 　７１６の図２に注目のこと）はポルフィリンの約１２μｇ／ｇの濃度が、ガン の光力学的治療と検出に広（使用されている感光剤であるホトフリン■の２５− ｇ／　ｋｇの腹膜内注射の後のＤ　Ｂ　Ａ／Ｈ２マウス中の腫瘍（Ｃｓ　Ｈ／　 Ｔ　ｉｆ　”ｉｌｌ乳動物ガン）中に達成されていることを示している。

マウスによって消費された酵素阻害剤含有飼料の合計量は次のとおりでありた。

６ａ、２２および３５ｇ、６ｂ、３７１３よび３５ｇ　；　６　ｃ　。

２５右よび２２ｇ、６ｄ、４１および３２ｇ；　６ｅ、４０および４４１；　６ ｆ、２７ｇ；　６ｇ、３３および４０ｇ；６ｈ、３６ｇ；　６ｉ、１０ｇＨ６ｊ 、２０ｇ。

この実施例６に記載の実験の準備において、腫瘍をもたない動物にこの実施例の ６０の阻害剤を（他に記載のない限り）使用して次の常法工程を行な９た。

ａ、　阻害剤（試剤）のＬＤｓｏはラット（１５％の試剤を含むコーン油から成 る単一の経口調剤後１４日の期間中に決定）について２６００■ｇ／ｋｇ（すな わち体重ｋｇ当りの試剤のｓｓｇ）以上であると決定され、マウスについては７ ００　ｍｇ／　ｋｇ以上であると決定された（コーン油と５％の試剤とから成る 単−経口調剤後１４日の期間中に決定）。

ｂ、　試剤を含まない腹膜内注射のビヒクルの試験において、マウスはＤＭＳＯ （ジメチルスルホキサイド）と水の等量混合物の０．５ｍｌ調剤量の注射に耐え うることが決定された。

ｃ、８０％コーン油と４０％ＤＭＳＯとの混合物中の腹膜内注射した試剤の試験 において、マウスは１００腸ｇ／ｋｇの調剤量に耐えうろことが決定された。

ｄ、　次の試みをマウスについて行なった。

！）８日間の（アセトン中の１％試剤溶液を使用する）５０謁ｇ／　ｋｇの毎日 の経口投与。

ｉｉ）　８日間の（−滴のＤＭＳＯ中に試剤を溶解し、生成溶液を鉱油と混合す ることによって製造した、鉱油中の試剤の１％分散液を使用する）　５０　ｋｇ ７　ｋｇの毎日のｒ、ｐ、注射。

１ｉｉ１　８日間の（ＤＭＳＯ中の１％溶液を使用する）５０＋ａｇ／ｋｇの毎 日の皮膚への局所塗布。

ｉｖ）　飼料の重量を基準にして２０００ｐｐｍの試剤を配合した標準飼料の８ 日間の供給。

ｖ）　４日間の５０ｍｇ／ｋｇ（ＤＭＳＯ中の２％溶液を使用）の１、Ｖ、注射 。

これらの試みに使用したマウスを殺し、それらの組織のプロ）・ｒｘ蓄積を試験 した。

別の試験において、雄のＦｉｓｈｅｒ　３４．４ラツトを２７日間、試剤６ｃの ５０００ｐｐｍを含む飼料で飼育し、次いで殺した。このラットの組織は対照８ ｇ卓に比べて増大したプロトＩＸ水準を示し、腎臓、腸、胃および脳において水 準の増加は顕著であり、筋肉組織中での水準の増加は小さかった。

上記のラットおよびマウスの試験において、これらの動物は標準１２時間、暗所 １２時間の光サイクルに保った。

Ｘ胤■ユ 実施例１ｉ５よび２の線にそった一連の実験において、ＨｅＬａ細胞の培養物を 下記に示す種々の処理剤１１００ｕの存在で培養した。それぞれの処理剤の次に 記す％は同じ実験における対照標準によって生成する量に比べての処理剤の存在 下で生成したプロ）ＴＸの量の増加を示す。

実施例６に使用した試剤：　６ａ、３３７％；　６ｂ、３６６％：　６ｃ、２９ ７％、６ｄ、１２００％；　６ｅ、１２１０％；　６ｆ、２８０％；　６ｇ、３ ２６％、６ｈ、４３１％；６ｉ、５４４％；　６ｊ、４６９％。

その他の試剤： ゛　ｉΔ烹ｌ この実施例において、実施例６の酵素阻害剤６Ｃをラットに供給し、腫瘍をラッ トと移植し、そして腫瘍をもつ区域を露光し、腫瘍の退化を起させた。

具体的には、平均体重１２０ｇの＾ｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット３匹を２ ０００ｐｐｍの試剤を含む飼料に６日装置いた。３日目に腫瘍細胞の懸濁液０． ３ｍ１（１００万個の腫瘍細胞）の注射によってそれぞれのラットの右の後肢に ガンを移植した。６日目にそれぞれのラットの右後肢をそりで脱毛し４それぞれ の腫瘍の大きさを測定し、そして腫瘍区域および周囲の皮膚を合計２７０Ｊ／ａ ｍ”の６３０ｎｍの光の非熱的投与にさらした１次の日に、これらのラットのう ちの２匹には腫瘍がなく（すなわち触疹腫腫塊がなく、３匹目のラットは腫瘍の 殆ど完全な退化が認められる、ということを見出した。これらのラットの周囲の 皮膚と筋肉組織はやや白くなって、フォトフリン■処方の光力学的治療で遭遇す るよりも著しく小さい若干の膨潤を示した。

住塞Ａ 旌凰旦バ１ 流出％試験は青白いキラリの苗から収穫した子葉を使用する。

初期工程において、子葉集塊を放射性標識砂糖含有のａ新水溶液で暗所において 処理する。子葉によって吸収された砂糖の量を次いで（以下に述べるようにカウ ントによって）測定する。子葉の集塊を次いで２つの部分に分ける二子葉の１方 の部分は試験すべき化合物を含む緩衝水溶液で暗所において処理し、他方の部分 は試験化合物を含まない以外は同じ水溶液（対照標準）で暗所において同様に処 理する。水溶液と接触している子葉を次いで１６時間露光してから水溶液から分 離し、次いで後者を（カウンティングによって）測定してそれらの放射性標識物 質の含量を決定する。これらの結果を下記のように計算される流出％として表示 する。ただしＳは初期処理において子葉によって吸収された放射性標識物質の（ 子葉当りの）カウントであり、Ｓ？は露光後の試験化合物含有水溶液中の（子葉 当りの）放射性標識物質のカウントであり、そしてＳｃは露光後の対照標準の水 溶液中の（子葉当りの）放射性物質のカウントである。

更に詳しくは１次の物質と条件を流出％試験において使用する。

鼠１社五：　キラリの種子を殺菌し、商業的（９−４５−１５）肥料で漬液した バーミキュライト中で成長させる。苗を２５℃、８０〜９０％ＲＨ（相対湿度） で暗所培養室中で成長させる。子葉を５日後の青白い（光を当てない）苗から収 穫し、すべて緑色光のもとで１．ＯｒｎＭのＣａＣ１，中で洗浄する。

１ＬｆＬ？ＩＬｌ！’　”ｍ’のＫＣＩ、１ｍＭのＣａ　Ｃ１ｍおよび２　、０ 　ｍ　Ｍのリン酸カリウム１Ｐｆ（を（たとえばＮ　ａ、　ＯＨにより）６．５ に調整。

雄肚檄ｌ立１：　３−０−メチル−３−［ｕ−１４ｃｌグルコース；比活性１０ ．９Ｇ１３ｇ／ミリモル（米国イリノイ州アーリントン・ハイツのアマ−ジャム ・コーポレーション）。

五皿恭」：　洗浄した子葉（１８０〜２３０）を２５０閣１の広［１の発泡体栓 付きエルレンメイヤー・フラスコ（５０ｍｌの緩衝溶液を含む）に加え、放射標 識砂糖を溶液中６００ｎＭの濃度を与える量で加える。フラスコを暗所の旋回振 どう器上で１２５ｒｐｍで２４時時間上うする。次いで子葉をナイロン網上に回 収し、２０耐容量の１ｍＭのＣａＣ１、中で３回洗浄する。放射ｍｓ砂糖を、そ れぞれＮＣ３！ＪＩＪＩ’Ｊ溶化剤（アマ−ジャム・コーポレーション）中の５ つの子葉のうちの３つの試料を消化し生成マセレートを液体シンチレーション分 光計中でカウントすることによって、測定する。（これらの消化からの結果は自 動酸化器中での試料子葉を燃焼することによって行なった同じ決定と均等である ことが見出された。） 区１似九艷二Ａ、６瓜皿」およ　： 子葉５コを直径３５ｍｍの蓋付きプラスチック・ベトリ皿中の３ｍｌの緩衝溶液 上に軸外に浮遊させる０次いで試験化合物を所定濃度Ｃ以下に述べる）の試験化 合物な緩衝溶液中に与えるような量で加える。ａ衝溶液中のア七トン濃度は対照 標準において、ならびに試験化合物含有溶液において、０．１％（Ｖ／Ｖ）であ る。

浮遊する子葉を次いで、旋回振どう器の表面上９０　ｒ　ｐ　ｍで１６時時間上 うすることによって旋回さセる。

監ユ立１１二 溶液上に浮遊する子葉を含むベトリ皿を、４個のＧＥ　Ｆ２０Ｔ１２−ＣＷ蛍光 ランプによって与えられる照明に１６時間露光する。ランプの測定強度はスペク トルの光合成的に活性な区域（ＰＡＲ）（子葉表面で測定）において１５０μＥ ｍ−″５ｅｃ−’である。露光はペトリ皿を振とうしながら行なう。

ｆｌ　−の　の　二　すべての液体を子葉から分離し、その後にシンチレーショ ン分光計中でカウントする。

！Ｕ、：　照明工程以前のすべての処理は暗所で又は緑色蛍光（すなわち４５０ 〜６００ｎｍの光を通過する緑色プラスチック・カット・オフ・フィルターをと おして濾過された光）のもとて１１蓋ｌ 菟！Ｍ ｍ−１ＪＬ−−−−　−±に１皮−じＬヒ又クー　１」１蛇ムクエン　酸ナトリ ウム・６Ｌ０　１．７　Ｘ　１０−”１４　１０％　５痕跡金属　下記のとおり 　下記のとおり　１０ｐｅｃｉｓ／ｓｎ＊ｏ　Ｏ，３７Ｘ　１Ｇ−”Ｍ　１％　 ｌＣａＣ１ｇ／２Ｈ＊０　０．３６　Ｘ　１Ｇ−”Ｍ　Ｓ、３％　１Ｍｇ５Ｏ− ／７Ｈ，０１，２Ｘ　１０−”１　１０％　３Ｎ１１．ＮＯｇ　３．７　ｘ　１ ０−”Ｍ　１Ｇ％　３ＫＨ，ＰＯ４２，２ｘ　１０−”Ｍ　１０％　３に、ＨＰ Ｏ４１，７Ｘ　１０−”Ｍ　１０％　３Ａ　のス　− ＨＡ　Ｂｏｇ　１００　ｍｇ／　Ｌ ＺｎＳＯ４・ＴＨ＊　０　１００　ｍｇ／ＬＭｎＳＯ４・４Ｈｚ　０　４０　ｍ ｇ／ＬＣＯＣ１ｍ　・６　Ｈｚ　０　２０　ｍｇ／　ＬＮ１１ＭＯＯ４・２万ｍ 　Ｏ２０ｍｇ／ＬＣｕＳＯａ　４　ｍｇ／Ｌ 培養媒質Ｍに１０ｍ１／ｌの１０％酢酸ナトリウム水溶液（７，５Ｘ　１０−” Ｍ）を加えることによって媒質入を製造する。

諸成分を上記の順序で蒸留水に加え、１５ｐｓ　ｉで１５分間オートクレーブ処 理する。

の　ス Ｙ−１細胞のストック培養物を、ポリウ゛レタンで栓をしたエルレンマイヤー・ フラスコ中で２５℃において１４／１０時間の光／暗のサイクルで、媒質Ａまた はＭ上の、好ましくは媒質Ｍ上の、液体培養物に無菌状態で保持する。このスト ック培養物を１２５ｒｐｍの回転振どう器上で補充エアレージ５ンなしに培養す る。培養物水準での光強度は１２０μＥ−ｍ−”・５ｅｃ−’（ＰＡＲ）である 、これらの条件下で、培養物は、２〜４Ｘ１０’細胞／−１の定常状態に達する まで、半同期的の成長状態にある。

ｔし 光の存在下で成長したストック培養物の定常相（７，５ａＬ）からの細胞をエル レンマイヤー・フラスコ中の７５０購ｌの媒質Ａに移す、これらの細胞を潜水エ アレーシッン管からエアレーションを行ないながら、２５℃で３〜４日間、暗所 で培養する。この期間中、Ｙ−１１細胞のこの培養は７〜８回の細胞分裂を受け 、目にみえるすべてのクロロフィルを失い、濃度は２〜３ＸＩＯ’細胞／閣ｌに あるべきである。

に　るための　の 低速遠心分離（約２０００　ｒ　ｐｍ）を約２０℃で約５分間行なうことによっ て、新たに調製した暗所成長培養物（７５０ｍｌ）から細胞を収穫する。これら の細胞を５０ｍ１の媒質Ａ中でおだやかに再懸濁させる。この懸濁液の試料（約 ０．２５ｍ１）は流動性を試験すべきであり、そして１％ゲルタールアルデヒド 水溶液による固定の後に、細胞の数／ｓｌの決定を行なうべきである。正常細胞 のカウントは約５ＸＩＯ’細胞／ｍｌである。ｌ■１（１０’細胞／ｓ＋１）の 分別量を試験容器（たとえばファルコン２４井戸の組織培養プレート）に入れる 。この時点で細胞は非常に流動性であり、黄色である。

試験化合物を溶媒（アセトン、エタノール、ジメチルスルホキシド、または水、 好ましくはアセトン）にとかして最終濃度の１０００倍の濃度を与える。この試 験溶液の１μｌを５またはｌＯμｌのマイクロ注射器で２つの井戸のそれぞれに 加える。

組織培養プレート毎に４個の対照標準井戸を試験化合物を存在させることなしに 上記のように準備する９組織培養弁戸を透明プラスチックカバーで覆い、７０〜 ９０μＥｍ−”・５ａｃ−’の光強度をもつ成長室に２５℃において１３〜１６ 時間入れる。試験井戸の内容物が黄色にみえたら、それらを下記の結果の評価の 章で述べるように抽出する。試験井戸の内容物が透明または淡緑色にみえたら、 それらを約１２５ｒＰｍの回転振どう器に入れ、抽出前に約６００μＥｍ−”・ ５ｅｃ−’の光強度で２時間照射する。

級１Ω丘ｊ １０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液（２５０μｍ）右よびメタノール（ｌ　ｍｌ ）をそれぞれの試験井戸に入れ、十分に混合する。

混合物を暗所に３〜４時間放置する０組織培養プレートを低速（約２００ｒｐｍ ）で５分間、２５℃で遠心分離する。上澄液を除いて、ベックマン・モデル３５ 分光計において、プロトホルフリンＩＸについては３５０ｎｍと５００ｎｍとの 間で、この溶媒系中のクロロフィルの吸収ピークである６６８ｎｍにおいて、お よび混濁背景の読みとして使用するために７２０ｎｍにおいて分析する。

ニー区公立量 それぞれの井戸について、７２０ｎｍの読みを６６８ｎｍの読みから差引くこと によって、緑色値を得る。これらの値を試験化合物のそれぞれの濃度について、 および対照標準について平均する。阻害％は次のとおりである。

国際調査報告 １ＩＩｌ轡ａｔｔ・内ａＩＭしｉ【Ｍｍ＋＋５ａＰＣＴ／ＵＳ！！９１０５５９ ９１ｍｍ＋ｖｎｍｓｅ１＾ａ−ト（纏鵞呻１ＩＮ−ＰＣＴ／ＵＳ８９１０５５９ ９”ｌ＝’−ＩＭＩｌ＝−ｂ−ＡＮｅ、ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０５５９９国際調 査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．光活性化性テトラビロールの存在で細胞を光にあてることによって哺乳動物 腫瘍細胞を殺す方法であって、細胞にブロトポルフィリンＩＸの蓄積を生ぜしめ る細胞中のブロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼによるブロトポルフィリノ ーゲンからブロトポルフィリンＩＸへの酵素的転化を特異的に阻害する化合物に より細胞を処理することを特徴とする方法。
2. ２．光活性化性テトラビロールの存在で細胞を光にあてることによって哺乳動物 腫瘍細胞を殺す方法に使用する滅菌した医薬組成物であって、細胞にブロトポル フィリンＩＸの蓄積を生ぜしめる細胞中のブロトポルフィリノーゲン・オキシダ ーゼによるブロトポルフィリノーゲンからブロトポルフィリンＩＸへの酵素的転 化を特異的に阻害する化合物を含み、該化合物が１μＭ未満のブロトポルフィリ ノーゲン・オキシダーゼのＩｓｏをもち、且つ該組成物が医薬的に許容しうるビ ヒクルをも含む、ことを特徴とする組成物。
3. ３．光活性化性テトラビロールの存在で細胞を光にあてることによって哺乳動物 腫瘍細胞を殺す方法に使用する滅菌した医薬組成物であって、細胞にブロトポル フィリンＩＸの蓄積を生ぜしめる細胞中のブロトポルフィリノーゲン・オキシダ ーゼによるブロトポルフィリノーゲンからブロトポルフィリンＩＸへの酵素的転 化を特異的に阻害する化合物を含み、該化合物がテトラビロールではなくて−５ ００ｍＶより大きな負のレドックス電位をもち、且つ該組成物が医薬的に許容し うるビヒクルをも含む、ことを特徴とする組成物。
4. ４．細胞にブロトポルフィリンＩＸの蓄積を生ぜしめる哺乳動物腫瘍細胞中のブ ロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼによるブロトポルフィリノーゲンからブ ロトポルフィリンＩＸへの酵素的転化を特異的に阻害する治療用化合物であって 、該化合物が１μＭ未満のブロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼのＩｓｏｓ ｏをもっことを特徴とする治療用化合物。
5. ５．細胞にブロトポルフィリンＩＸの蓄積を生ぜしめる哺乳動物腫瘍細胞中のブ ロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼによるブロトポルフィリノーゲンからブ ロトポルフィリンＩＸへの酵素的転化を特異的に阻害する腫瘍の光力学的治療用 の化合物であって、該化合物が１μＭ未満のブロトポルフィリノーゲン・オキシ ダーゼ該Ｉｓｏをもつことを特徴とする腫瘍の光力学的治療用化合物。
6. ６．細胞にブロトポルフィリンＩＸの蓄積を生ぜしめる哺乳動物腫瘍細胞中のブ ロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼによるブロトポルフィリノーゲンからブ ロトポルフィリンＩＸへの酵素的転化を特異的に阻害する治療用化合物であって 、該化合物がテトラビロールではなくて−５００ｍＶより大きな負のレドックス 電位をもつことを特徴とする治療用化合物。
7. ７．細胞にブロトポルフィリンＩＸの蓄積を生ぜしめる哺乳動物腫瘍細胞中のブ ロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼによるブロトポルフィリノーゲンからブ ロトポルフィリンＩＸへの酵素的転化を特異的に阻害する腫瘍の光力学的治療の 化合物であって、該化合物がテトラビロールではなくて−５００ｍＶより大きな 負のレドックス電位をもつことを特徴とする光力学的治療用化合物。
8. ８．細胞にブロトポルフィリンＩＸの蓄積を生せしめる細胞中のブロトポルフィ リノーゲン・オキシダーゼによるブロトポルフィリノーゲンからブロトポルフィ リンＩＸへの酵素的転化を特異的に阻害する化合物により細胞または細胞含有の 有機体を治療することを特徴とする哺乳動物腫瘍細胞のブロトポルフィンＩＸ含 量を高める方法。
9. ９．細胞のポルフィリン含量を増大させて哺乳動物組識をポルフィリン刺激光の もとで検査しそして腫瘍からの蛍光を観察することによって哺乳動物腫瘍細胞を 検出または検知する方法であって、細胞にブロトポルフィリンＩＸの蓄積を生ぜ しめる細胞中のブロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼによるブロトポルフィ リノーゲンからブロトポルフィリンＩＸへの酵素的転化を特異的に阻害する化合 物により細胞含有の有機体を処理することを特徴とする方法。
10. １０．酵素ブロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼの阻害剤であるアリール・ トリアゾリノン、アリール・テトラゾリノン、またはアリール・トリアジンジオ ンの有効量の存在下で真核微小藻を暗所でまたは非ブロトポルフリンＩＸ励起光 のもとで成長させることを特徴とするブロトポリフリンＩＸの製造法。
11. １１．微小藻がクラミドモナス属のものであることを特徴とする請求項４の方法 。
12. １２．阻害剤化合物が１−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキ シフェニル）−３−メチル−４−ジフルオロメチル−Δ２−１，２，４−トリア ゾリン−５−オンであることを特徴とする請求項４の方法。