KR930003116B1

KR930003116B1 - 종양의 광역학적 치료용 조성물

Info

Publication number: KR930003116B1
Application number: KR1019900701747A
Authority: KR
Inventors: 필립 홀링 블레이크; 앤 위트코우스키 데브라
Original assignee: 에프엠씨 코포레이션; 챨스 씨. 펠로우스
Priority date: 1988-12-12
Filing date: 1989-12-08
Publication date: 1993-04-19
Also published as: IL92622A; AU633537B2; AR243605A1; HUT58202A; JP2545000B2; GB9110472D0; DK110791D0; ATA903489A; NO912228D0; FI912784A0; AU4822290A; PT92546B; GB2247404A; CH681779A5; WO1990006748A2; SE9101807D0; IE893925L; CA2004979A1; WO1990006748A3; LU87949A1

Abstract

내용없음.

Description

종양의 광역학적 치료용 조성물

본 발명의 한 태양은 암의 광역학적(photodynamic) 치료와 같은 포유동물 종양 세포의 광역학적 치료에 관한 것이다. 헤마토포르피린 유도체 또는 그로 부터 유도된 포르피린의 혼합물(예 : 포토프린 Ⅱ)을 포유동물의 종양세포에 가하고 이어서 상기 세포에 세포과괴 효과에 적당한 파장의 빛을 조사하는 것은 이미 잘 알려져 있다. 그러한 광역학적 치료법은 문헌[Photochemistry and Photobiology, Volume 46, number 5, November, 1987(이후에는 "P ＆ P 46-5"라 함)]의 특별한 문제를 취급하는 일련의 논문의 주제이다. 상기의 논문에 나타난 바와같이, 그러한 광역학적 치료는 광범위한 암(기관지, 방광, 식도, 폐, 피부, 머리와 목, 뇌, 및 결장암과 눈안 및 부인과 암을 포함한다)의 치료에 사용되어 왔다. 상기는 세포막 단백질의 가교결합, 지방의 과산화, 몇몇 필수 대사물질의 이동저해, 라이소솜 및 미토콘드리아 막의 용혈, 여러효소의 불활성화 및 포르피린의 증가된 세포 흡수를 포함하는 상기 포르피린 광감작(photosensitization)의 생화학적효과를 서술한다(P ＆ P 46-5, 페이지 695). 포르피린 물질을 일반적으로 체중 kg당 포토프린 Ⅱ 약 2mg의 전형적인 투여량으로(예를들면, 정맥내 또는 복강내로) 주사한다. 포르피린 물질을 또한, 예를들면 스파이크스 등(Spikes et al.)의 문헌["Photodynamic Behavior of Porphyrins in Model Cell, Tissue and Tumor Systems" : in Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases(Edited by G.Jori and C.A.Perria) ; 페이지 45-53 ; Libreria Progetto, Padua(1985)]에 개시되고 본 발명에 참고로 인용된 바와 같이, 리포솜내에 혼입하고 주사(예를 들면, 복강내로)할 수 있다.

기술 문헌은 세포, 예를들면 인간의 적혈구(Dubbelman et al, Biochimica et Biophysica Acta, 511(1978) 141-151) 또는 뮤린의 백혈병 세포(Kessel, Cancer Research 42, 1703-1706 May 1982)내로 프로토포르피린의 도입은 현저한 광감작 효과를 갖는 다는 것을 나타낸다. 케쎌(Kessel)의 논문은 프로토포르피린이 시험한 것들 중의 가장 강력한 광감작제임을 서술한다. 그러나, 케쎌 및 기타(예를들면, Berenbaum et al, Br.J.Cancer(1982) 46, 571-581)는 프로토포르피린을 동물내로 주사할때 종양내에서 감지할 수 있는 어떤 프로토포르피린도 발견하지 못했으며 이는 상기와 같이 체내로 도입된 프로토포르피린이 순환시 쉽게 상실될 수도 있음을 나타내는 것이다. 방광암 또는 폐암과 같은 종양의 검출 및 위치 추정을 위해 헤마토포르피린 유도체 및 그와 유사한 물질을 사용함이 또한 잘 알려져 있다(예를들면 P ＆ P 46-5,페이지 759).

본 발명의 한 태양으로, 상기의 광역학적 치료, 또는 종양의 검출 및 위치추정에 대해 공지된 방법에서 상기 세포를 치료하는 약제는 포르피린이 아니거나 또는 단독으로 포르피린만이 아니다. 대신에 치료제는 상기 세포에서 프로토포르피리노겐을 헴으로 효소적 전환시키는 것을 저해하는 효소-저해제를 포함하며 이로인해 상기 세포내에 내인성 프로토포르피린 IX의 축적을 야기시킨다. 식물세포에서 프로토포르피리노겐이 엽록소로 효소적 전환하는 것을 저해하는 약제(예를들면 특정 유형의 제초제 화합물)는 또한 포유동물 세포에서 프로토프르피리노겐이 헴으로 효소적 전환하는 것을 저해함을 확인하였다. 상기 약제에 의한 저해는 틀림없이 효소(프로토포르피리노겐 산화효소, EC 1.3.3.4)에 의해 프로토포르피리노겐이 프로토포르피린 IX로 전환하는 단계에 영향을 미치며, 따라서 상기 프로토포르리리토겐은 프로토포르피린 IX로의 정상적인 효소적 경로를 따르지 않지만 그대신 세포내에서(예를들면, 혈장내에서)정상적인 효소 경로를 벗어나(예를들면, 세포기관의 막 밖에서) 산화되며, 그 결과 헴으로의 정상적 전환을 얻을 수 없는 곳에서 프로토포르피린 IX가 축적되게 되므로 상기 세포에 빛을 조사할때, 상기 축적된 프로토포르피린 IX는 상술한 광역학적 치료시 나타낸 바와 같은 세포-파괴 효과를 갖는다고 생각된다.

본 발명의 효소 저해제는 변성 또는 가교결합제(예를들면, 설프하이드릴 시약)와 같이 일반적인 효소 독으로서 작용하지 않고, 바람직하게는 전자 수용체와 같이 산화 상태에 영향을 미치는 물질이 아니라는 점에서 프로토포르피리노겐 산화효소의 특이한 저해제이다 : 따라서, 본 발명의 바람직한 약제는 약-500 밀리몰트 보다 더 음의, 예를들면 -800 밀리볼트 보다 더 음의 산화 환원 전위를 갖는다(예를들면 상기 약제에 대한 반양성자성 용매중에서 환형 전기량계 또는 폴라로그래피법에 의해서와 같은 통상적인 방법으로 측정한다). 또한 상기 약제는 테트라피롤이 아니며 프로토포르피리노겐 산화효소에 대한 그의 I5o은 약 1μM미만,예를들면 약 0.3μM미만(예를들면 약 0.1 또는 0.03 또는 0.01μM이하의 I50)인 것이 바람직하다. 효소-저해제는 식물 물질의 원형질막을 파괴시키는데 높은 능력을 갖는 것이 바람직하다. 상기의 능력에 대한 하나의 시험이 홀링과 피더스(Halling ＆ Peters의 논문[Plant Physiology, 84, 1114-5(1987)]에 개시된 유출 실험이다. 상기의 시험(하기 부록 A에 보다 상세하게 개시됨)에서, 바람직한 약제는 100μM의 치료율, 바람직하게는 1μM이하(예를들면 100nM)의 치료율에서 적어도 50%의 총 유출을 나타낸다 ; 1-(4-클로로-2-플루오로-5-프로파길옥시페닐)-3-메틸-4-디플루오로메틸-△²-1,2,4-트리아졸린-5-온 또는 락토펜(하기 기술함)과 같은 고도의 활성물질은 100nM의 농도에서 90%이상의 총유출%를 나타낸다.

식물 물질의 원형질막을 파괴시키는 물질의 능력을 시험하는 또다른 시험은 하기 부록 B에서 더욱 특별히 개시한 광-촉진 녹색화 저해시험이다. 상기 시험은 암(暗)-표백된 클라미도모나스 라인하르디(Chlamydomonas reinhardi) 돌연변이체 y-1(어두운곳에서 생육시 엽록소를 만들지 않으므로 따라서 조(棗)류 덩어리가 새로운 비-녹색 세포의 존재로 인하여 표백되고, 빛에 노출시 다시 엽록소를 생성하는 조류 형태)의 명(明)-녹색화를 저해하는 능력을 측 정한다. 본 발명에 사용되는 다수의 바람직한 화합물들(약제)은 10^-5M, 보다 바람직하게는 10^-6M이하, 예를들면 10^-7M의 온도에서 사용시 상기 명-녹색화를 적어도 50%까지 저해하는 능력을 갖는다. 또한, 상기 화합물은, 명-녹색화 저해 시험에서 상기 농도로 사용시, 약 405nm에서 엽록소 피이크(상기 시스템에서, 약 668nm에서의 피이크)보다 높은 흡광 피이크를 나타내는 상등액(예를들면, 이 상등액은 668nm피이크의 높이 보다 2, 3 또는 4배 높은 405nm 피이크를 나타낸다)을 제공하는 것이어야 한다.

본 발명의 실시에서 사용할 수 있는 효소-저해제 중에는 하기 부류(A 내지 D)의 제초제 화합물이 있다 :

A. 하기 일반식의 아릴 헤테로사이클릭 제초제 :

Ph-NHet

상기식에서, "Ph"는 치환된 페닐, 바람직하게는 2,4-이치환된 페닐, 더욱 바람직하게는 2,4,5-삼치환된 페닐이고, NHet는 하기 일반식(여기에서, Q는 헤테로사이클릭 고리의 남은 부분을 나타내고 R은 수소 또는 치환체 그룹을 나타낸다)을 갖고 1개 내지 4개의 고리-질소원자를 갖는 5- 또는 6-원의 헤테로사이클릭 고리이다.

상기 부류의 화합물은 와카바야시 등(Wakabayashi et al.)의 논문[J.Pesticide Sci.11, 635-460(1986)]에서 "환형 이미드 제초제류"로서 표현되는 것과 같은 물질(논문의 도면 제1도에서 하기의 화합물로 나타냄)을 포함한다 :

화합물(I)은 아릴 오사디아졸 제초제, 즉 2-3급-부틸-4-(2,4-디클로로-5-이소프로폭시페닐)-△²-1,3,4-옥사디아졸린-5-온 이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 기타의 2-알킬-4-(2,4,5-삼치환된 페닐)-△²-1,3,4-옥사디아졸린-5-온은 예를들면, 미합중국 특허 제 3,385,862호 ; 제 3,836,539호 ; 및 제 3,876,413호에 개시되어 있다. 화합물(Ⅱ)는 아릴 테트라하이드로인다졸 제초제, 즉 3-클로로-2(4-클롤로-2-플루오로-5-이소프로폭시페닐)-4,5,6,7-테트라하이드로-2H-인다졸이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 기타의 3-치환된-2-(2,4,5-삼치환된 페닐)테트라하이드로인다졸은 예를들면 미합중국 특허 제 4,670,043호에 개시되어 있다. 화합물(Ⅲ), (Ⅳ) 및 (Ⅴ)는 아릴 테트라하이드로프탈이미드 제초제이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 기타의 아릴 테트라하이드로프탈이미드는 예를들면 미합중국 특허 제 4,431,822호 ; 제 4,670,046호 ; 제 4,670,042호 : 및 제 4,439,299호와 공개된 국제출원(PCT) WO 제 87/07602호에 개시되어 있다. 상기 맨 나중의 2개의 인용문에는 또한, 사용할 수 있는 다른 NHet 고리가 개시되어 있다(상기 고리는, 예를들면 미합중국 특허 제 4,439,229호의 컬럼 4라인 25 내지 컬럼 5 라인 20 및 WO 제 87/07602호의 페이지 12 내지 14에 예시되어 있다).

pH-NHet 유형의 기타 적당한 제초제는 다음과 같다 :

아릴 트리아졸리논(예를들면 미합중국 특허 제 4,318,731호 ; 제 4,398,943호 ; 제4,404,019호 ; 제 4,702,945호 ; 제 4,705,557호 ; 제 4,702,763호 ; 제 4,761,174호 및 국제 출원(PCT) WO 제 85/01637호, WO 제 85/04307호, WO 제 87/00730호, WO 제 87/03782호, WO 제 86/04481호, 및 WO 제 88/01133호에 개시됨).

아릴 테트라졸리논(예를들면 미합중국 특허 제 4,734,124호 및 국제 출원(PCT) WO 제 85/01939호 및 WO 제 87/03873호에 개시됨) ; 아릴 트리아진디온(에를들면 미합중국 특허 제 4,755,217호 및 제 4,766,233호와 국제 출원(PCT) WO 제 86/00072호에 개시됨) ; 아릴 하이단토인(예를들면 미합중국 특허 제 4,427,438호에 개시됨) ; 아릴 우라졸(예를들면 미합중국 특허 제 4,452,981호에 개시됨) ; 및 아릴 헥사하이드로피리다진(예를들면 미합중국 특허 제 4,619,687호에 개시됨).

B. 아릴 헤테로사이클릭 우레탄(에를들면 미합중국 특허 제 4,521,242호에 개시됨).

C. 페닐 에테르 제초제(p-할로 또는 p-니트로 페녹시페닐 구조를 가지며, 하기의 상업적으로 구입할 수 있는 물질과 같은 것들이다) :

5-(2-클로로-4-(트리플루오로 메틸 5-(2,4-디클로로

메틸)페녹시)-2-니트로-N-메탄 페녹시-2-니트로벤조

설포닐벤즈아미드(포메사펜) 에이트(비페녹스)

나트륨 5-(2-클로로-4-(트리 2-클로로-1-(3-에톡시-4-

플루오로메틸)페녹시)-2-니트로 니트로페녹시)-4-트리

벤조에이트(아시플루오르펜) 플루오로메틸벤젠(옥시플루오르펜)

상업적으로 구입할수 있는 기타 적당한 디페닐에테르 제초제는 다음과 같다.

락토펜 : 1-(카보에톡시)에틸 5-(2-클로로-4-트리플루오로메틸페녹시)-2-니트로벤조에이트, 플루오로글리코펜 : (카보에톡시)메틸 5-(2-클로로-4-트리플루오로메틸페녹시)-2-니트로벤조에이트, 프로메소펜 : 5-(2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시)-N-메틸설포닐-2-니트로벤즈아미드, 클로로니트로펜 : 2,4,6-트리클로로-(4-니트로페녹시)-벤젠, 플루오로디펜 : 2-니트로-1-(4-니트로페녹시)-4-트리플루오로메틸벤젠, 니트로펜 : 2,4-디클로로-1-(4-니트로페녹시)벤젠, 클로메톡시펜 : 4-(2,4-디클로로페녹시)-2-메톡시-1-니트로벤젠.

적당한 또다른 디페닐 에테르 제초제는 메틸 5-(2-클로로-4-트리플루오로메틸페녹시)-2-니트로아세토페논옥심-O-아세테이트이다.

D. 아릴 피라졸 제초제(예를들면 미합중국 특허 제 4,563,210호 ; 제 4,496,390호 ; 및 제 4,459,150호와 독일 공개특허 제 3520327 A1호에 개시됨)

E. 하기 일반식의 화합물 :

상기식에서, X^b는 O 또는 S이고, "Ph는 상술한 의미를 갖는다. 상기 화합물은 유럽 공개특허원 제 273417호 또는 데어웬트(Derwent) 초록 도서수납번호 제 87-040749호에 개시되어 있다.

본 발명의 약제로의 처리는 정맥내 또는 복강내로 주사함으로써 효과적으로 치료할 수 있다. 상기 약제를 약학적으로 허용가능한 담체, 예를들면 수성 염수(예 : 0.9% NaCl)또는 둘베코(Dulbecco)의 인산염 완충염수(PBS)와 같은 등장성 수용액중에서 2.5mg mL^-1의 농도로 용해시키거나 분산시킴을 포함하거나 또는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985, (17th editon), published by Mack Publishing Company]의 페이지 1659-1660에 개시된 바와 같은 방법으로 인지질 소낭으로 제조한 것과 같은 리포솜 시프템중에 상기 약제를 포함하는 멸균 조성물로서 사용할 수 있다. 예를들면, 조리 등(Jori et al.)의 문헌[Br., J. Cancer(1983), 48 at page 307]에 개시된 배함물과 유사하게, 디팔미토일디포스파티틸-콜린 51.4mg을 클로로포름-메탄올(9 : 1, v/v)중의 약제 1 밀리몰 용액 10㎖중에 용해시키고 충분히 혼합한 후에 용매를 30℃에서 진공하에 제거하여, 고형물을 수득하고, pH 7.4에서 150 밀리몰 NaCl을 함유하는 0.01몰 인산염 완충액 10㎖중에 재현탁시키고 이어서 혼탁한 용액을 50℃에서 30분동안 초음파 처리한다.

본 발명의 실시에서 사용할 수 있는 효소-저해제는 상기 효소-저해제를 특별한 종양 부위에 조준하는 수단으로서, 본 분야에 공지된 결합 기법을 사용하여 적당한 종양-특이성 단일 클론 항체(MABs)에 접합시키거나 또는 결합시킬 수 있다.

본 발명에 사용된 효소-저해제는 또한 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 희석된 형태를 단순히 경구 섭취에 의해, 예를들면 하기 실시예 6에서 예시한 바와 같이 음식물에 상기 형태를 가함으로써 사용할 수도 있다.

효소 저해제는 수용성 염이거나 또는 국제 출원(PCT) WO 제 87/03782호(예 : 하기 실시예 6에서 약제 6C) 또는 WO 제 85/001939호 및 WO 제 87/03873호에 개시된 유형의 산성 설폰아미드 또는 그의 수용성염, 또는 카복실산 또는 그의 수용성 염(예를들면 아시플루오르펜으로서 공지된 나트륨 염)과 같이 수용성 나트륨 또는 칼륨염을 형성하는 산성화합물로 사용하는 것이 특히 경구투여에 바람직할 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 효소-저해제는 정제(예 : 설탕 페이스트 및/또는 시럽으로 코팅할 수 있는 압착된 정제), 좌제, 캡슐(예 : 경질 젤라틴 캡슐), 현탁제, 액제, 분말 또는 앰풀제와 같은 통상적인 약학제제내에 혼입시킬 수 있다. 상기의 제제에서 약제는 경우에 따라 영양분일 수 있는 약리학적으로 허용가능한 고체 및/또는 액체 담체와 혼합하여 존재할 수 있다. 예를들면 담체는 옥수수 전분과 같은 고체 또는 물 또는 식용유 또는 광물섬유 또는 용매, 예를들어 디메틸 설폭사이드와 같은 액체 희석제일 수 있다. 효소-저해제의 혼합물로 예를들면 하기 실시예 6의 약제 6C와 아시플루오르펜의 예를들어 약 동량의 혼합물을 사용할 수 있다. 사용하려는 투여량은 포트프린 Ⅱ에 대해 다우어티(Dougherty)의 논문["Photodynamic Therapy(PDT) of Malignant Tumors"in CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology vol.2 issue 2(1984), page 83-116]에 개시된 유형의 실험과 같이 본 분야에 잘 공지된 통상적인 실험에 의해 결정할 수 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 보다 잘 예시하기 위해서 제공한다.

대수증식기(1리터의 팔콘(Falcon) 조직 배양 플라스크중에서 5일 동안 37℃에서 배양함)의 헬라(HeLa) 세포(종양연구용으로 흔히 사용되고 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로 부터 구입한 인간 종양 세포주)를 인산염 완충염수(PBS)로 세척한다. PBS(2㎖)중의 0.25% 트립신 용액을 가하고, 수분후에, 상기 세포를 플라스크로 부터 부드럽게 제거하여 불활성화된 송아지 혈청 10% v/v, 0.85% 염수용액중의 200 밀리몰 글루타민 용액 1.1㎖, 및 페니실린 11,000단위/스트렙토마이신 11,000mcg으로 보충된 최소 필수 배지(MEM)중의 헤페스 25 밀리몰 용액 110㎖중에 넣는다.

이어서, 생성된 재현탁 세포 배양물 5.0㎖ 분량을 각각 50㎖의 팔콘 조직 배양 플라스크에 넣고 처리제와 혼합한다(대조용은 제외). 이어서 상기 분량을 3일동안 37℃의 어두운 곳에서 배양한다. 이어서 세포를 제거하고 하기의 방법으로 녹색광하에서 추출한다 :

세포를 PBS중의 0.25% 트립신 용액 0.8㎖을 가하여 플라스크의 바닥으로 부터 제거한다. 어두운 곳에서 1시간 배양한 후, 세포와 배지를 플라스크로 부터 제거하여 환저 원심분리튜브에 넣고, 이어서 2회 연속의 동결-융해 조건을 가하여 세포를 파괴한 다음 추출한다.

상기의 파괴 처리후에 세포 현탁액을 조사하여 본래의 완전한 세포가 존재하지 않음을 밝힌다. 이어서 염기성 아세톤(90% 아세톤 : 10%의 0.1N NH₄OH) 10㎖을 각각의 튜브에 가하고, 상기 튜브를 원심분리시켜 단백질과 세포 부스러기를 제거한다. 물 5㎖을 상등액에 가한 다음 포화된 NaCl수용액 0.5㎖을 가한다. 이어서 pH를 2M의 KH₂PO₄를 적가하여 6.8로 조절한다. 이어서 수성 아세톤 추출물을 C8 베이커 프레프 컬럼(Baker Prep column)상에 부하한다. 상기 컬럼을 건조시키고 이어서 물 2㎖로 세척한다. 테트라피롤을 CH₃OH/H₂O(90/10) 1.5㎖ 부피로 2회 용출시킨다. 이어서 추출물을 형광분광계로 정량측정한다.

본 실험에서 사용한 처리시약은 다음과 같다 :

A. 5-아미노 레불린산(테트라피롤의 공지된 전구체).

B. 하기 구조식을 갖는 아시플루오르펜-메틸 :

C. 하기 구조식의 제초제 :

D. 하기 구조식의 제초제 :

E. 하기 구조식의 제초제 :

시약 A는 수중의 pH 6.5의 여과-멸균된 250 밀리몰 용액으로 사용한다. 시약 B,C,D 및 E는 아세톤중의 50 밀리몰 용액으로 사용한다. 아세톤을 또한 대조용에 가하여 0.2% v/v의 농도를 제공한다. 세포 배양물에 가한 시약의 양은 하기 표 1에 구체적으로 제공한 농도와 같다. 생성된 테트라피롤 프로토포르피린IX("프로토 IX")의 양을 표1에 나타낸다.

[표 1]

처리된 헬라 세포중의 테트라피롤 축적

[실시예 2]

6개의 1리터 팔콘 조직 배양 플라스크중에서 6일동안 37℃에서 배양한 대수 증식기의 헬라 세포를 인산염 완충 염수(PBS)로 세척한다. PBS중의 0.25% 트립신 용액을 가하고 수분후에, 상기 세포를 부드럽게 제거하여 불활성화된 송아지 혈청 10% v/v, 0.85% 염수용액 중의 200밀리몰 글루타민 용액 1.1㎖, 및 페니실린 11,000단위/스트렙토마이신 11,000mcg으로 보충된 최소 필수 배지(MEM)중의 헤페스 25 밀리몰 용액 110㎖중에 넣는다.

재현탁 세포 배양물의 분량(각각 5.0㎖)을 제초제와 함께 또는 제초제 없이 50㎖ 팔콘 조직 배양 플라스크중에 넣고 4일 동안 37℃의 어두운 곳에서 배양하고 상기 제초제를 실시예1에서와 같이 묽은 아세톤 용액에 가한다. 아세톤을 또한 대조용에 가하여 0.2% v/v의 아세톤 농도를 제공한다. 제초제의 양은 하기 표 2에 구체적으로 제공한 농도와 같다.

처리제는 다음과 같다.

B. 실시에 1에서와 같다.

C. 실시예 1에서와 같다.

F. 하기 구조식의 제초제 :

추출 : 각각의 플라스크로 부터의 배지를 환저 유리관에 넣고, 한편으로는 플라스크 바닥에 접착된 세포를 PBS 중의 0.25% 트립신 용액 0.5㎖을 가하여 유리시키고 37℃에서 수분후에 상기 플라스크로 부터 세척하고 그의 배지와 재결합시킨다. 이어서 100㎕ 분량을 세포 밀도를 결정하기 위해서 각각의 세포 현탁액으로 부터 제거한다. 이어서 남아 있는 세포 현탁액 5.4㎖을 세포를 파괴하기 위해서 30분 동안 초음파 처리한다.

이어서 염기성 아세톤(90% 아세톤 : 10%의 0.1N NH₄OH) 10㎖을 각각의 튜브에 가하고, 상기 튜브를 원심분리시켜 단백질과 세포 부스러기를 제거한다. 물 5㎖을 상등액에 가한 다음 포화된 NaCl 수용액 0.5㎖을 가한다. 이어서 pH를 2M의 KH₂PO₄를 적가하여 6.8로 조절한다. 이어서 수성 아세톤 추출물을 C8베이커 프레프 컬럼상에 부하한다. 상기 컬럼을 건조시키고 이어서 물 2㎖로 세척 한다. 테트라피롤을 CH₃OH/H₂O(90/10) 3㎖ 부피로 용출시킨다. 실시예1에서와 같이, 상기의 모든 추출 방법은 전적으로 비-프로토포르피린 IX-여기 광(예 : 녹색광)하에서 또는 어두운 곳(예 : 불투명 덮개를 덮은 용기내)에서 실질적으로 행한다. 이어서 추출물의 형광을 SPEX 형광 분광계상에서 측정한다. 프로토포르피린 IX("프로토 IX")의 축적을 예정된 소광계수를 사용하여 정량측정 한다. 결과를 하기 표 2에 나타낸다.

[표 2]

평균 생육 저해 및 프로토 IX 축적

*"생육 저해율"에서 음수 값은 생육이 일어난 것을 나타냄.

**10⁶세포당 평균양

*** 대조용의 퍼센트

본 발명의 또다른 태양은 프로토포르피린 IX(이후에는 "프로토 IX"라 함)의 생산에 관한 것이다. 상기 태양에서는 진핵 미세조류를 프로토포르피리노겐이 프로토 IX로 효소적 전환되는 것을 저해하는 약제(상술함)함유 배지중에서 어두운 곳(또는 비-프로토 IX-여기 광하에서)에서 이형적으로 증식시킨다. 이어서 배지 또는 조류 또는 모두를 처리하여 프로토 IX를 추출하고 엽록소, 카로티노이드 및 세포 부스러기 등으로 부터 이를 분리시킨다. 분리는 역상 액체 크로마토프래피를 포함하는 액상 크로마토그래피, 또는 용매 추출, 또는 Fe, Zn 또는 Mg와 같은 금속으로 킬레이트화 함으로써 프로토 IX를 침전시키고, 생성된 킬레이트 화합물을 제거하고, 원한다면 묽은산으로 상기 킬레이트를 처리함으로써 프로토 IX를 재생성시킴과 같은 어떠한 편리한 방법으로도 수행할 수 있다.

분리단계를 비-프로토 IX-여기 광(예를들면 부록 A에 "어둠"이란 표제하에 기술한 녹색광)하에서 또는 어두운 곳에서 수행한다. 철 킬레이트는 그다지 빛에 민감하지 않으므로 상기 물질을 다룰때에는 빛에 노출시키는 것이 보다 더 허용적일 수 있다.

미세조류를 약 15내지 30℃의 온도범위에서 세포 현탁액으로서 증식시키는 것이 바람직하다. 저해 시약의 농도는 예를들면 약 10^-5내지 10^-7몰일 수 있다. 사용할 수 있는 미세조류의 예로는 스케네데스무스 종(Scenedesmus sp.), 클라미도 모나스 라인하르디, 유그레나 종(Euglena sp.) 및 부밀레리옵시스 필리포르미스(Bumilleriopsis filiformis)가 있다.

[실시예 3]

클라미도모나스 라인하르디(야생종)의 대수기 배양물을 하기 기술된 배양 배지를 사용하여 스테인레스 강철 통(예 : 300ℓ)에서 계대 배양한다. 1-(카브에톡시)에틸 5-(2-클로로-4-트리플루오로메틸페녹시)-2-니트로벤조에이트(락토펜, 상업적인 페닐에테르 제초제)의 아세톤 용액을 가하여 10^-5M의 농도와 0.1%의 아세톤 최종농도를 제공한다. 상기 혼합물을 25℃의 어두운 곳에서 4일 내지 7일동안 부드럽게 교반 및/ 또는 통기하면서 증식시킨다. 어둠을 유지하면서, 통의 내용물을 여과하고 여과물을 처리하여 그속의 프로토포르피린 IX를 회수한다.

프로토포르피린 IX를 회수하기 위한 처리의 한 방법은 반응통의 내용물을 여과하고(어둠을 유지하면서)상기 여액에 아세톤을 가하는 것이다. 상기 혼합물을 석유 에테르로 추출한다. 이어서 수성 아세톤 혼합물을 디에틸 에테르도 추출하고, 상기 디에틸 에테르는 증발시켜 제거하여 잔류물을 남긴다. 상기 잔류물을 메탄올에 용해시키고 역상 크로마토그래피시켜 프로토포르피린 IX를 수득한다. 또한, 실시예 1 및 2에 개시된 회수 방법을 사용할 수 있다.

배지의 조성

미량금속 혼합물의 주

H₃BO₃100mg/ℓ

ZnSO₄ㆍ7H₂O 100mg/ℓ

MnSO₄ㆍ4H₂O 40mg/ℓ

COCl₂ㆍ6H₂O 20mg/ℓ

MaMoO₄ㆍ2H₂O 20mg/ℓ

CuSO₄4mg/ℓ

클라미도모나스 라인하르디를 사용하는 대신에 나트륨 아세테이트를 글루코스로 대치시킨 상기 배지상에서 배양한 스켄데스무스 종을 사용한다.

[실시예 4]

본 실시예는 제초제 화합물 1-(4-클로로-2-플루오로-5-프로파길옥시페닐)-3-메틸-4-디플루오로메틸-△²-1,2,4-트리아졸린-5-온을 락토펜 대신에 사용한 것을 제외하고 실시예 3과 동일하다.

[실시예 5]

[I₅₀의 결정]

[프로토포르피리노겐 IX("프로토겐 IX")]

프로토 IX를 유타주의 로간에 위치한 포르피린 프로덕츠사로 부터 구입하고 티.피. 푸에슬러 등(T. P. Fuesler et al.)의 문헌[Plant Physiol., 67, 246-249(1981)]에 개략된 바와 같이 정제한다. 300μM 농도의 정제된 프로토 IX를 사용하고 엔. 제이. 제이콥스와 제이. 엠. 제이콥스(N. J. Jacobs and J. M. Jacobs)의 문헌[Enzyme, 28, 206-219(1982)]에 개략된 바와 같이 Na/Hg 아말감으로 프로토 IX를 환원시킴으로써 프로토겐 IX를 새로이 제조한다.

[식물물질]

오이(큐커미스 사티브스(Cucumis sativus) L. 변종 'Wisconsin SMR 18')를 어두운 증식방에서 시판용(9-45-15) 비료와 함께 관개한' 질석상에서 키운다. 발아종자를 25℃ 및 80 내지 90%의 상대습도에서 키운다. 간헐적인 조명, 즉 60분을 주기로 1분동안 25μE/m^-2sec^-1(PAR)로 측정된 강도의 빛을 전자 타이머에 의해 조절된 제네랄 일렉트릭사의 '브라이트 스틱(Bright Stick)'으로 적용시킨다. 상기는 녹말 저장과 초기 엽록소 수준을 최소화하는 반면 급속히 엽록소를 합성할 수 있는 조직을 제공한다.

[엽록체 단리]

성장한 엽록체를 최종 정제 단계에서, 색소체를 45%(v/v) 보다는 40%의 퍼콜(Percoll)쿠션을 통하여 원심분리시킴을 제외하고 티. 피. 푸에슬러 등의 문헌[Plant Physiol. 75, 662-664(1984)]에 개시된 바와 같이 단리시킨다. 상기 엽록체를 0.5 몰 만니톨, 20 밀리몰 TES, 10 밀리몰 HEPES, pH 7.7, 1 밀리몰 EDTA, 1 밀리몰 MgCl_2,1%(w/v) 소혈청 알부민 및 1밀리몰 디티오 에리트리톨을 함유하는 검정 완충 액중에 최종농도 2mg 단백질/㎖로 재현탁시킨다.

[프로토포르피리노겐 산화효소의 검정]

제이. 엠. 제이콥스 및 엔. 제이. 제이콥스의 문헌[Arch. Biochem. Biophys 229, 312-319(1984)]에 개략된 바와 같이 검정을 수행한다. 엽록체 현탁액의 샘플(0.2㎖)을 다양한 농도의 아시플루오르펜-메틸("AFM") 또는 0.2%(v/v) 아세톤(대조용 으로서)과 어두운 곳에서 15분 동안 미리 배양시킨다. 이어서 새로이 제조된 프로토겐 50㎕(약 15nM)을 현탁액에 가하여 반응을 개시한다. 1%(v/v) 트윈-10(폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트), 50밀리몰 트리스-HCl, pH 8.5, 1 밀리몰 EDTA(1 밀리몰 디티오에리트리톨은 5 밀리몰 글루타치온 대신 치환됨)로 구성된 엔. 제이. 제이콥스 및 제이. 엠. 제이몹스의 문헌 [Enzyme, 28, 206-219(1982)]의 형광측정 배지 2.75㎖을 가하여 검정을 종료시킨다. 이어서 탁한 생물학적 샘플용의 정면의 형광 옵션을 갖춘 SPEX 플루오로그-2-형광분광계상에서 현탁액을 직접 읽는다. 생성된 프로토 IX의 양을 형광측정 배지중의 정제된 프로토 IX로 부터 작성한 표준 곡선(400nm의 여기상태에서, 630nm에서의 방사에 대한 프로토 IX의 양)으로 부터 정략측정한다.

상기 검정에서 프로토 IX로 비효소적 산화하는 양을 결정하기 위해서, 활성 엽록체의 현탁액 대신에 85℃에서 15분 동안 가열함으로써 불활성화시킨 엽록체의 현탁액을 사용함을 제회하고 상기와 동일한 검정을 수행한다. 활성 엽록체의 존재하에서 생성된 양에서 이렇게 하여 생성된 프로토 IX의 양을 감하여 효소적으로 형성된 프로토 IX의 양을 구한다. 상기 결과를 도면 I (여기에서 LSD는 통상적인 바와 같이 최소의 유의한 차이(Least Significat difference)를 나타낸다)에 도식적으로 나타내었다. 도면 I 은 I₅₀값(50%의 저해를 제공하는 농도)이 0.1μM 미만, 즉, 약 0.03μM임을 나타낸다.

엽록체 현탁액(ATP 존재하의)중에서 프로토 IX가 마그네슘 프로토 IX로 효소적 전환하는데 대한 10μM AFM 효과의 검정은 AFM이 상기 전환에 대해 어떠한 저해 효과도 없음을 나타낸다.

[실시예 6]

본 실시예에서는 효소-저해제를 종양을 갖고 있는 마우스의 먹이에 가한다 ; 대조용으로서 사용한 몇몇 마우스에 대해서는 약제를 가하지 않는다. 이어서 마우스를 죽이고, 그의 신장, 장, 부신, 간 및 종양을 제거하고 그의 프로토 IX 함량을 분석한다. 하기의 효소-저해제를 사용한다 :

보다 특히, 상기 마우스는 오른쪽 어깨에 0일째에 SMT-F 피하의 종양을 주사한 DBA/2 Ha 마우스이다. 개별적으로 수용한 마우스에게 1일째에, 처리되지 않은 푸리나 로덴트 쵸우 5001 매쉬(Purina Rodent Chow 5001 Mash)를 주고, 그후 2내지 10일째에 상기 마우스에게 시험한 저해제 2000ppm으로 처리한 동일한 매쉬를 준다(또한 대조용에게는, 처리되지 않은 동일한 매쉬를 준다). 매쉬의 처리는 매쉬와 시험된 약제의 아세톤 용액 소량을 블렌딩함으로써 수행한다. 이어서 6j로서 표시된 약제로 처리한 마우스를 제외하고 마우스를 10일째에 죽인다 ; 상기 마우스는 7일째에 죽인다. 조직을 4℃에서 밤새 냉장하고, 이어서 흡수하여 건조시키고, 각 조직 샘플의 새로운 중량을 기록한다. 이어서 조직을 장 및 간의 경우에 아세톤-0.1N NH₄OH(9 : 1, v/v) 5㎖ 또는 10㎖중에 균질화시킨다. 이어서 상기 균질물을 1500g에서 원심분리시키고 상등액을 SPEX FA112 형광분광계(프로토 IX에 대한 최적 조건인 400nm에서 여기, 630nm파장에서 방사)상에서 분석한다. 프로토 IX 축적은 조직 g당 CPS(초당 방출된 형광수)로서 결정한다. 결과를 하기에 표로 작성하였다(결과는 약제 6f,6h,6i 및 6j각각은 단 한마리의 마우스만을 처리함을 제외하고, 각각 처리한 두마리의 마우스의 평균이다) :

g당 프로토 IX평균 Cps X10^3*

* 표의 수와 동일한 원래의 데이타 X10^-3.

** 1부 샘플에 대해 3부 염기성 아세톤으로 희석한 샘플에 대한 측정량.

각각의 조직에 있어서 하기의 프로토 IX의 농도에 상응하는 숫자들을 조직의 g당 프로토 IX의 ㎍으로서 표현한다 :

상기 인용된 다우어티의 논문은 동일한 유형(DBA/2Ha)의 마우스에 10mg/kg의 헤마토포르피린 유도체를 주사한 후에 동일한 유형(SMT-F)의 종양내에서 3.6㎍/g의 포르피린 농도를 획득함을 나타낸다. 기타의 기술문헌[Moan et al. P ＆ P 46-5, pages 713-721 ; note fig 2 on page 716]은 암의 광역학적 치료와 검출용으로 광범위하게 사용되는 감작약인 포토프린 Ⅱ 25mg/kg의 복강내로 주사한 후에 DBA/H2 마우스의 종양(C₃H/Tif유방암)에서 약 12㎍/g의 포르피린 농도를 얻을 수 있음을 나타낸다.

마우스가 소비한 약제-함유 먹이의 총량은 다음과 같다 : 6a,22 및 35g ; 6b, 37일 35g ; 6c, 25 및 22g ; 6d, 41 및 32g ; 6e, 40 및 44g ; 6f, 27g ; 6g, 33 및 40g ; 6h, 36g ; 6i, 10g, 6j, 20g.

본 실시예 6에 개시된 실험에 대비하여, 하기의 일상적인 단계를 본 실시예에서 6c로 표시한 약제를(다른 언급이 없는 경우)사용하여 종양을 갖고 있지 않는 동물에 수행한다.

a. 약제의 LD₅₀은 래트에 대해서는 2600mg/kg(즉,체중 kg당 약제의 mg)이상으로 결정되었고(14-일의 기간동안 15%의 약제를 함유하는 옥수수기름을 포함하는 하기의 단일 경구투여량에 따라 결정함) 마우스에 대해서는 700mg/kg 이상으로 결정한다(14-일의 기간동안 5%의 약제 및 옥수수기름을 포함하는 하기의 단일 경구 투여량에 따라 결정함).

b. 약제 없이 복강내 주사용 비히클에 대한 시험에서, 마우스는 동일부의 DMSO(디메틸설폭사이드)와 물의 혼합물 0.5㎖ 투여량을 주사해도 견딜 수 있음이 결정된다.

c. 60% 옥수수기름과 40% DMSO의 혼합물중의 약제를 복강내로 주사하는 시험에서, 마우스는 100mg/kg의 투여량을 견딜수 있음이 결정된다.

d. 하기의 시도를 마우스에게 수행한다 :

i. 8일동안 50mg/kg(아세톤중의 약제 1% 용액을 사용함)을 매일 경구적으로 위관영양함 ;

ii. 8일 동안 50mg/kg(광물성 오일중의 약제 1% 분산액(DMSO 한방울중에 약제를 용해시키고 생성된 용액을 광물성 오일과 혼합함으로써 제조)을 사용함)을 매일 복강내로 주사함 ;

iii. 8일동안 50mg/kg(DMSO중의 1% 용액을 사용함)을 매일 피부에 국부적으로 도포함 ;

iv. 먹이의 중량을 기준으로, 2000ppm의 약제를 혼입한 표준 먹이를 8일 동안 먹임 ;

v. 4일 동안 50mg/kg(DMSO중의 2% 용액을 사용함)을 매일 정맥내로 주사함. 이어서 상기의 시도에서 사용한 마우스를 죽이고 프로토 IX축적에 대해 조직을 검사한다.

또다른 시험에서는, 피셔(Fisher) 344 수컷 래트에게 27일동안 5000ppm의 약제 6c를 함유하는 먹이를 먹이고 이어서 죽인다. 상기 래트의 조직은 대조용에 비해 프로토 IX의 증가된 수준과 함께, 신장, 장, 위 및 뇌에서 현저히 증가되고 근육조직에서는 단지 조금 증가된 수준을 나타낸다.

래트와 마우스의 전술한 시험에서 상기 동물들을 표준 12시간, 어둠-12시간의 광 주기에서 수용한다.

[실시예 7]

실시예 1 및 2와 같은 일련의 실험에서, 헬라 세포의 배양물을 하기 목록의 다양한 처리제 100μM의 존재하에서 배양한다. 각각의 처리제 옆에 나타낸 퍼센트는 동일한 실험에서 대조용에 의해 생성된 프로토 IX의 양에 비하여 상기 처리제의 존재하에 생된 프로트 IX의 양의 증가를 나타낸다.

마우스가 소비한 약제-함유 먹이의 총량은 다음과 같다 : 6a, 22및 35g ; 6b, 37 및 35g ; 6c, 25 및 22g ; 6d, 41 및 32g ; 6e, 40 및 44g ; 6f, 27g ; 6g, 33 및40g ; 6h, 36g ; 6i, 10g ; 6j, 20g.

[실시예 8 ]

본 실시예에서는 실시예 6의 효소-저해제 6c를 래트에게 먹이고, 종양을 상기 래트에 이식하고 종양을 갖는 부위를 빛에 노출시켜 종양의 퇴행을 일으킨다.

구체적으로는, 평균 중량 120g 스프레그-덜리(Sprague-Dawley)래트 3마리에게 6일의 기간동안 2000ppm의 약제를 함유하는 먹이를 먹인다. 3일째에, 각 래트의 오른쪽 뒷다리에 종양 세포의 현탁액 0.3㎖(백만개의 종양 세포)를 주사함으로써 연골 육종을 이식한다. 6일째에 각 래트의 오른쪽 뒷다리를 면도하고 털을 뽑아 각 종양의 크기를 측정하고 이어서 종양 부위와 주위 피부를 총 270J/㎠에 대한 비-열성 투여량의 630nm 빛에 노출시킨다. 그 다음날에, 두마리의 래트에는 외관상으로 종양이 없음(즉, 촉지가능한 종양 덩어리가 없음)이 밝혀지고 세번째 래트에는 거의 완전히 종양이 퇴행했음을 나타낸다. 상기 래트의 주위 피부와 근육조직은 가볍게 표백되고 포토프핀 Ⅱ-매개된 광역학적 치료시 보다 현저히 덜한 약간의 팽창을 나타낸다.

부록 A

유출율 시험

유출율 시험은 황화된 오이 발아종자로 부터 수확한 자엽을 사용한다. 초기 단계에서 한 덩어리의 자엽을 방사성 표지된 당을 함유하는 완충 수용액으로 어두운 곳에서 처리한다. 이어서 자엽에 용해된 당의 양을 측정한다(하기에 개시된 바와 같이 셈으로써 측정함). 이어서 상기의 자엽 덩어리를 2부분으로 나눈다 ; 한 부분의 자엽을 시험할 화합물을 함유하는 완충수용액으로 어두운 곳에서 처리하는 한편, 다른 부분은 대조용으로서 시험 화합물 없이 동일한 용액으로 어두운 곳에서 동일한 방법으로 처리한다. 이어서, 수용액과 접촉한 자엽을 16시간 동안 빛에 노출시키고, 수용액으로 부터 분리해낸다 ; 이어서 분리해낸 자엽을 측정하여(셈으로서)그의 방사성 표지된 물질의 함량을 결정한다. 결과를 하기 식과 같이 계산한 유출율로서 표현한다.

상기식에서, S는 초기 처리시 자엽에 용해된 방사성 표지된 물질의 수(자엽당)이고, S_T는 빛에 노출된 후에, 시험할 화합물을 함유하는 수용액중의 방사성 표지된 불질의 수(자엽당)이며, S_C는 빛에 노출된 후에, 대조용 수용액중의 방사성 표지된 물질의 수(자엽당)이다.

보다 구체적으로, 하기의 물질과 조건을 유출율 시험에서 사용한다.

식물 물질 : 오이 종자(큐커미스 사티브스 L. 변종'Wisconsin SMR 18')를 발아시키고 시판용(9-45-15)비료와 함께 관개한 질석에서 재배한다. 발아종자를 어두운 배양실에서 25℃ 및 80내지 90% RH에서 재배한다. 자엽을 재배5일 후에 황화된 발아종자로 부터 수확하고, 1.0밀리몰 CaCl₂중에서 헹군다(항상 녹색광하에서).

완충 용액 : pH 6.5로 조정한(NaOH로서) 1밀리몰 KCl, 1밀리몰 Cacl₂및 2.0밀리몰 인산 칼륨.

방사성 표지된 당 : 비활성 10.9 GBq/밀리몰의 3-0-메틸-3[U-14c]글루코스(Amersham Corp., Arlington Heights IL).

초기 처리 : 세척한 자엽(180개 내지 230개)을 완충용액 50㎖을 함유한 250㎖의 주둥이 넓은 거품-스토퍼가 있는 3각 플라스크에 가하고, 방사성 표지된 당을 용액내에 600nM의 농도를 제공하는 양으로 가한다. 상기 플라스크를 어두운 곳에서 125rpm의 회전 진탕기에서 24시간 동안 진탕한다. 이어서 자엽을 나일론체로 회수하고 20㎖ 부피의 1밀리몰 CaCl₂로 3번 헹군다. 방사성 표지된 당의 이용은 NCS조직 용해화제(Amersham Corp.)중에 각각 자엽 5개의 샘플 3개를 침지시키고 액성 섬광분광계 중에서 생성된 침연물을 셈으로써 측정한다(상기 침지물로 부터의 결과는 자동산화기중에서 샘플 자엽을 연소시킴으로써 이루어진 동일한 결정과 같음이 밝혀졌다).

시험할 화합물로의 처리(및 대조용 처리) : 5개의 자엽을 35mm 직경의 뚜껑이 있는 플라스틱 페트리 디쉬내의 완충용액 3ml상에 축외의 측면으로 세워 띄운다. 이어서 시험 화합물을 상기 완충용액중의 시험 화합물의 예정농도(하기 논의됨)를 제공할 정도의 양으로 가한다(아세톤중의 시험 화합물의 용액으로서) ; 이때 완충용액중의 아세톤 농도는 시험 화합물을 함유하는 용액뿐 아니라 대조용에서도 0.1%(v/v)이다. 이어서 부유 자엽을 16시간 동안 90rpm의 회전 진탕기의 표면상에서 상기 디쉬를 진탕시킴으로써 소용돌이치게 한다.

빛에 노출 : 용액상에 부유된 자엽을 함유하는 디쉬를 진탕시키면서 이 디쉬에 광합성적으로 활성인 스펙트럼의 영역(PAR)에서 측정된(자엽의 표면에서 측정함)강도 150μE m^-2sec^-1로 4개의 GE F20T12-CW형광 램프에 의해 제공된 조명에 16시간 동안 노출시킨다.

액체중의 방사성 표지된 물질의 함량 측정 : 상기 모든 액체를 자엽으로 부터 분리시키고 이어서 액성 섬광 분광계로 센다.

어둠 : 조명 단계 이전에 모든 처리는 어두운 곳 또는 녹색 형광빛(즉, 450내지 600nm의 빛을 통과시키는 녹색의 플라스틱 절단 여과기를 통해 여과된 빛)하에서 수행한다.

부록 B

배양배지

배지 M

미량 금속 혼합물의 주

H₃BO₃100mg/ℓ

ZnSO₄ㆍ7H₂O 100mg/ℓ

MnSO₄ㆍ4H₂O 40mg/ℓ

COCl₂ㆍ6H₂O 20mg/ℓ

NaMoO₄ㆍ2H₂O 20mg/ℓ

CuSO₄4mg/ℓ

배양배지 A는 A에 10% 나트륨 아세테이트 수용액 10㎖/ℓ(7.5*10^-3몰)을 가함으로써 제조한다.

상기 성분들을 상기 목록된 순서로 증류수에 가하고 15분 동안 15psi에서 가압 멸균한다.

빛의 존재하에서 증식시킨 보존 배양물

y-1세포의 보존 배양물을 25℃에서 14/10시간의 명/암 주기로, 폴리우레탄 플러그로 막은 3각 플라스크 중에서 배지 A 또는 M, 바람직하게는 배지 M상의 액체 배양액중에 무균적으로 유지시킨다. 보존 배양물을 125rpm의 회전 진탕기상에서 보충적인 통기 없이 배양한다. 배양물 수준에서 빛의 강도는 120μEm^-2sec^-1(PAR)이다. 상기 조건하에서 배양물은 2 내지 4×10⁶세포/㎖의 정지기에 도달할때까지 반-동시발생의 증식 형태이다.

빛의 부재시 증식시킨 배양물(암-증식 배양물)

빛의 존재하에 증식시킨 보존 배양물의 정지기로 부터의 세포(7.5ml)를 3각 플라스크중의 750ml의 배지 A로 이동시킨다. 상기 세포를 침수된 통기 튜브를 통해 통기시키면서 3내지 4일 동안 25℃의 어두운 곳에서 배양한다. 이 기간동안 y-1세포의 상기 배양물은 모든 가시적인 엽록소를 잃고 7 내지 8번의 세포 분열을 하게 되며 농도는 2 내지 3×10⁶세포/ml이다.

검정용 세포의 제조

세포를 약 20℃에서 약 5분동안 저속(즉, 약 2000rpm)원심분리에 의해 새롭게 제조한 암-증식 배양물(750ml)로 부터 수확한다. 상기 세포를 50ml의 배지 A중에 부드럽게 현탁시킨다. 상기 현탁액의 샘플(약 0.25ml)을 운동성에 대해 조사하고 1% 글루테르알데하이드 수용액으로 고정시킨 후에, 세포수를 측정하여 세포/ml의 수를 결정한다. 통상적인 세포수는 약 5×10⁷세포/ml이다. 1ml의 분량(10⁷세포/ml)을 시험용기(예를들면, 팔콘24-웰 조직 배양 플레이트)내에 넣는다. 이때 세포는 매우 운동성이 있으며 색깔은 황색이다.

시험 화합물은 용매(아세톤, 에탄올, 디메틸설폭사이드, 또는 물, 바람직하게는 아세톤)중에서 용해시켜 최종 농도의 1000배의 농도를 얻는다. 상기 시험 용액 1㎕을 5 또는 10㎕ 미세 주시기로 각각 2개의 웰에 가한다.

조직 배양 플레이트당 4개의 대조용 웰을 시험 화합물 없이 상술한 방법으로 제조한다. 조직 배양 플레이트를 투명한 플라스틱 덮개로 덮고 25℃에서 13 내지 16시간 동안 70 내지 90μEm^-2sec^-1강도의 빛과 함께 증식방에 놓는다. 시험 웰의 내용물에 황색이 나타나는 경우, 상기를 하기 결과의 평가 부분에서 기술한 바와 같이 추출한다. 시험 웰의 내용물 투명하거나 또는 담-녹색인 경우, 상기를 약 125rpm의 회전 진탕기 상에 놓고 추출하기 전에 2시간 동안 약 600μEm^-2sec^-1강도의 빛을 조사한다.

결과의 평가

10% 나트륨 도데실 설페이트 수용액(250㎕)과 메탄올 (1ml)을 각 시험 웰에 가하고 완전히 혼합한다. 혼합물을 어두운 곳에서 3 내지 4시간 동안 정치시킨다. 조직 배양 플레이트를 실온에서 5분동안 저속 (약2000rpm)으로 원심분리시킨다. 상등액을 제거하고 프로토포르피린 IX의 존재에 대해 350nm 내지 500nm, 상기 용매 시스템중의 엽록소의 흡수 피이크인 668nm 및 혼탁도 백그라운드를 판독하기 위해 720nm에서 베크만(Beckman) 모델 35 분광광도계로 분석한다.

데이타의 분석

각각의 웰에 대한 녹색 값은 668nm판독으로 부터 720nm판독을 감하여 얻는다. 상기 값들을 각각의 시험 화합물 농도와 대조용에 대해서 평균한다. 저해율은 다음과 같다 :

Claims

프로토포르피리노겐이 프로토포르피리노겐 산화 효소에 의해 프로토포르피린 IX로 효소 전환되는데 대한 특이한 저해제로서 프로토포르피리노겐 산화 효소에 대해 1μM미만의 I₅₀을 갖는 화합물을 약학적으로 허용가능한 비히클과 함께 포함함을 특징으로 하는, 종양의 광역학적(photodynamic) 치료 또는 검출용 약학 조성물.
프로토포르피리노겐이 프로토포르피리노겐 산화 효소에 의해 프로토포르피린 IX로 효소 전환되는데 대한 특이한 저해제로서 테트라피롤이 아니고 -500밀리볼트 보다 더 음(-)의 산화 환원 전위를 갖는 화합물을 약학적으로 허용가능한 비히클과 함께 포함함을 특징으로 하는, 종양의 광역학적 치료 또는 검출용 약학 조성물.
프로토포르피리노겐 산화 효소에 대해 1μM미만의 I₅₀을 갖는 , 프로토포르피리노겐이 프로토포르피리노겐 산화 효소에 의해 프로토포르피린 IX로 효소 전환되는데 대해 특이한, 종양의 광역학적 치료용 저해제.
테트라피롤이 아니고 -500밀리볼트 보다 더 음(-)의 산화 환원 전위를 갖는, 프로토포르피리노겐이 프로토포르피리노겐 산화 효소에 의해 프로토포르피린 IX로 효소 전환되는데 대해 특이한, 종양의 광역학적 치료용 저해제.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 1-(4-클로로-2-플루오로-5-프로파길옥시페닐)-3-메틸-4-디플루오로메닐-△²-1,2,4-트리아졸린-5-온인 저해제.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 아릴 트리아졸리논, 아릴 테트라졸리논, 아릴 트리아진디온, 아릴 옥사디아졸, 아릴 테트라하이드로인다졸, 아릴 테트라하이드로프탈이미드, 아릴 히단토인, 아릴 우라졸, 아릴 헥사하이드로피리다진, 아릴 헤테로사이클릭 우레탄, 페녹시페닐 화합물, 아릴 피라졸, 또는 하기 일반식의 화합물인 저해제 :

상기식에서, X^b는 O 또는 S이고, Ph는 치환된 페닐이다.
제6항에 있어서, 아릴 그룹이 산성 설폰아미드 그룹 또는 그의 수용성 염인 치환체를 갖는 저해제.
제7항에 있어서, 아릴 트리아졸리논인 저해제.
제 8항에 있어서, 하기 구조식을 갖는 저해제.
제6항에 있어서, 경구적으로 허용되는 베히클 형태인 저해제.
제6항에 있어서, 멸균 상태인 저해제.
제6항에 있어서, 수용성 염, 또는 수용성 나트륨 또는 칼륨염을 형성하는 산 화합물인, 종양의 광역학적 치료에 경구투여하여 사용되는 저해제.