DE3991484C2

DE3991484C2 - Arzneimittel mit einem Gehalt an einem spezifischen Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase

Info

Publication number: DE3991484C2
Application number: DE3991484A
Authority: DE
Inventors: Blaik Phillip Halling; Debra Ann Witkowski
Original assignee: FMC Corp
Current assignee: FMC Corp
Priority date: 1988-12-12
Filing date: 1989-12-08
Publication date: 1995-02-23
Anticipated expiration: 2009-12-09
Also published as: GR890100817A; NZ231658A; BR8907817A; WO1990006748A2; GB9110472D0; GB2247404A; AR243605A1; HUT58202A; IE893925L; SE505938C2; DE3991484T; SE9101807D0; OA09362A; DK110791A; FI912784A0; IL92622A; ES2051675T1; ES2051675T3; MC2171A1; EP0447491A1

Description

Die Erfindung betrifft spezifische Inhibitoren der enzymatischen Umwandlung von Protoposphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase, in Säuger-Tumorzellen, insbesondere bei der photodynamischen Behandlung von Tumorzellen.

Es ist mittlerweile wohlbekannt, Säuger-Tumorzel len mit Hämatoporphyrinderivaten oder einer Mischung von Porphyrinen, die sich davon ableiten, (z. B. Photofrin II®) zu versorgen und dann diese Zellen Licht geeigneter Wellenlänge auszusetzen, um eine Zellzerstörung zu be wirken. Eine solche photodynamische Therapie ist Gegen stand einer Reihe von Artikeln, die eine spezielle Ausgabe von Photochemistry and Photobiology Vol. 46, Nr. 5, November 1987, (im folgenden "P 46-5") bilden. Wie in diesen Artikeln gezeigt, wurde eine solche photo dynamische Therapie zur Behandlung einer großen Vielzahl von Krebsarten verwendet (einschließlich Krebs der Bronchialröhren, der Blase, des Ösophagus, der Lunge, der Haut, des Kopfes und Halses, des Gehirns und Darm- und Intraokular- und gynäkologischer Krebsarten). Es wurde festgestellt, daß die biochemischen Wirkungen einer solchen Porphyrin-Photosensibilisierung das Ver netzen von Membranproteinen, die Peroxidation von Lipi den, die Hemmung des Transports einiger wesentlicher Metaboliten, die Lyse von lysosomalen und Mitochondrien- Membranen, die Inaktivierung verschiedener Enzyme und eine vermehrte Zellaufnahme von Porphyrinen bewirken (P 46-5, S. 695). Das Porphyrinmaterial wird im all gemeinen injiziert, (z. B. intravenös oder intraperito neal), wobei eine typische Dosis etwa 2 mg Photofrin II/kg Körpergewicht ist.

Das Porphyrinmaterial kann auch in ein Liposom einge bracht werden und injiziert werden (z. B. intraperito neal) wie z. B. bei Spikes et. al "Photodyamic Behavior of Porphyrins in Model Cell, Tissue and Tumor Systems"; in Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases (herausgegeben von G. Jori und C. A. Perria); S. 45-53; Libreria Progetto, Padua, (1985) und den darin zitierten Referenzen offenbart ist.

Die technische Literatur zeigt, daß die Einführung von Protoporphyrin in Zellen wie menschliche Erythrozyten (Dubbelman et al., Biochemica et Biophysica Acta, 511 (1978) 141-151) oder Mäuseleukämiezellen (Kessel, Cancer Research 42, 1703-1706, Mai 1982) einen deutlichen pho tosensibilisierenden Effekt hat. Der Kessel-Artikel gibt an, daß es das stärkste photosensibilisierende Mittel von den getesteten ist. Jedoch fanden Kessel und andere (z. B. Berenbaum et al., Br. J. Cancer (1982) 45, 571-581), wenn sie Protoporphyrin in Tiere injizierten, kein nachweisbares Protoporphyrin in den Tumoren, was an zeigt, daß als solches in den Körper eingeführtes Pro toporphyrin leicht im Kreislauf verlorengeht.

Es ist auch wohlbekannt, Hämatoporphyrinderivate und ähnliche Materialien für den Nachweis und die Lokali sierung von Tumoren, wie Krebs der Blase oder der Lun gen, anzuwenden (P 46-5, S. 759 z. B.).

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, das verhindert, daß Protopophyrin im Kreislauf verlorengeht, so daß eine photodynamische Behandlung z. B. von Tumorzellen unter Verwendung dieses Stoffes ermöglicht wird.

Diese Aufgabe wird durch ein Arzneimittel gelöst, das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an einem spezifischen Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase in Säuger-Tumorzellen, als Wirkstoff.

Der Inhibitor weist einen I₅₀ für Protoporphyrinogen- Oxidase von weniger als 1 µM und/oder ein Redoxpotential auf, das negativer als -500 mV ist, wenn der Inhibitor kein Tetrapyrrol ist.

Das erfindungsgemäße Mittel zur Be handlung der Zellen in einer solchen photodynamischen Behandlung oder für die bekannten Methoden zum Nachweis und zur Lokalisierung von Tumoren ist nicht ein Porphyrin oder nicht ein Porphyrin allein. Statt dessen umfaßt es einen Enzymhemmstoff, der die enzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Häm in diesen Zellen hemmt, wodurch eine Anreicherung endogenen Protoporphyrins IX in diesen Zellen bewirkt wird. Es wurde festgestellt, daß Mittel wie bestimmte Arten von Herbizidverbindungen, die die enzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Chlorophyll in Pflanzenzellen hemmen, auch die enzy matische Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Häm in Säugerzellen hemmen. Es wird angenommen, daß die Hemmung durch diese Mittel wahrscheinlich den Schritt der Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch ein Enzym (Protoporphyrinogen-Oxidase E. C. 1.3.3.4) beeinflußt, so daß das Protoporphyrinogen nicht dem normalen enzymatischen Abbauweg zu Protoporphyrin IX folgen kann, sondern statt dessen in der Zelle oxi diert wird (z. B. im Plasma), aber außerhalb des normalen enzymatischen Stoffwechselwegs (z. B. außerhalb der Organellen-Membran) und daß das Ergebnis eine Akkumula tion von Protoporphyrin IX an Stellen ist, wo es uner reichbar für die normale Umwandlung zu Häm ist, mit dem Ergebnis, daß dieses akkumulierte Protoporphyrin IX, wenn die Zellen Licht ausgesetzt werden, eine zellzer störende Wirkung hat, wie die, die bei der oben be schriebenen photodynamischen Behandlung gezeigt wird.

Die Enzymhemmstoffe dieser Erfindung sind spezifische Inhibitoren der Protoporphyrinogen-Oxidase in dem Sinn, daß sie nicht als allgemeines Enzymgift wirken, wie denaturierende oder vernetzende Mittel (z. B. Sulfhydryl- Reagenzien), vorzugsweise sind es nicht Materialien, die die Oxidationsbedingungen wie Elektronenakzeptoren beeinflussen; daher haben die bevorzugten Inhibitoren dieser Erfindung Redoxpotentiale, die negativer als -500 mV sind, wie z. B. negativer als -800 mV (gemessen z. B. in üblicher Weise in einem aprotischen Lösungsmittel für das Mittel wie durch zyklische Voltametrie oder polaro graphisch). Das Mittel ist dann kein Tetrapyrrol. Weitere geeignete Inhibitoren weisen einen I₅₀ für Protoporphyri nogen Oxidase von weniger als 1 µM wie weniger als etwa 0,3 µM auf, z. B. einen I₅₀ von etwa 0,1 oder 0,03 oder 0,01 µM oder weniger.

Der Enzymhemmstoff ist vorzugsweise einer, der eine hohe Kapazität für das Aufbrechen des Plasmalemmas von Pflanzenmaterial hat. Ein Test für diese Kapazität ist das Efflux-Experiment, das in dem Artikel von Halling und Peters in Plant Physiology, 84, 1114-5 (1987) be schrieben wird. In einem solchen Test (im einzelnen in Appendix A unten beschrieben) zeigen die bevorzugten Mittel einen Gesamtefflux von mindestens 50% bei einer Behandlungsrate von 100 µM, vorzugsweise einer Behand lungsrate von 1 µM oder weniger wie 100 nM; hochaktive Materialien wie 1-(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloxyphe nyl)-3-methyl-4-difluormethyl-Δ²-1,2,4-triazolin-5-on oder Lactophen (unten beschrieben) ergeben Gesamtefflux- Prozentwerte von mehr als 90% bei 100 nH Konzen tration.

Ein weiterer Test der Kapazität eines Materials zum Aufbrechen des Plasmalemmas von Pflanzenmaterial ist der lichtinduzierte Ergrünungshemmungstest, der genauer im nachstehenden Testbeispiel B beschrieben ist. Dieser Test mißt die Kapazität, das im Licht Ergrünen von im dunkeln ge bleichter Chlamydomonas Reinhardi Mutante y-1 zu hem men (einer Algenart, die, wenn sie im dunkeln wächst, kein Chlorophyll bildet, so daß die Algenmasse wegen der Gegenwart neuer nicht grüner Zellen bleicht und die Chlorophyll wieder produziert, wenn sie Licht ausgesetzt wird) zu hemmen. Viele der bevorzugten Verbindungen (Mittel), die erfindungsgemäß verwendet werden, haben die Fähigkeit, das im Licht Ergrünen um mindestens 50% zu hemmen, wenn die Verbindung mit einer Konzentration von 10^-5 M, bevorzugter einer Konzentration von 10^-6 M oder weniger, z. B. 10^-7 M verwendet wird. Zusätzlich sollte die Verbindung eine sein, die, wenn sie bei dieser Konzentration im Lichtergrünungshemmungstest verwendet wird, einen Überstand ergibt, der einen Lichtabsorpti onspeak bei 405 nm zeigt, der höher ist als der Chloro phyllpeak (der Peak bei 668 nm in diesem System), z. B. zeigt der Überstand einen 405 nm Peak, dessen Höhe 2, 3 oder 4 mal höher ist, als die Höhe des 668 nm Peaks.

Unter den Enzymhemmstoffen, die bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden können, sind Herbizid- Verbindungen der folgenden Klassen (A-D):

A. Heterocyclische Arylherbizide der allgemeinen For mel

Ph-NHet,

worin "Ph" ein substituierter Phenylrest, vorzugs weise 2,4-disubstituierter Phenylrest, bevorzugter ein 2,4,5-trisubstituierter Phenylrest ist und NHet ein 5- oder 6-gliedriger heterocyclischer Ring mit ein bis vier Ringstickstoffatomen und mit der Formel

ist, worin Q den Ausgleich des heterocyclischen Rings darstellt und R Wasserstoff oder eine Sub stituentengruppe ist. Diese Klasse von Verbindungen schließt solche Materialien ein, wie die, die als "die cyclische Imidklasse der Herbizide" in einem Artikel von Wakabayashi et al., J. Pesticide Sci., 11, 635-460 (1986) bezeichnet ist, die folgende Verbindungen in Fig. 1 zeigt:

Verbindung I ist ein Aryloxadiazolherbizid, nämlich 2-tert.-Butyl-4-(2,4-dichlor-5-isopropoxyphenyl)- Δ²-1,3,4-oxadiazolin-5-on. Andere 2-Alkyl-4-(2,4,5- trisubstierte phenyl)-Δ²-1,3,4-oxadiazolin-5-one, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind z. B. in den US-Patenten 3.385.862; 3.836.539 und 3.876.413 offenbart.

Die Verbindung II ist ein Aryltetrahydroindazol- Herbizid, nämlich 3-Chlor-2-(4-chlor-2-fluor-5- isopropoxy-phenyl)-4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazol. Andere 3-substituierte 2-(2,4,5-trisubstierte Phe nyl)-tetrahydroindazole, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind z. B. in dem US-Patent 4.670.043 offenbart.

Die Verbindungen III, IV und V sind Aryltetra hydrophthalimid-Herbizide. Andere Aryltetrahydro phthalimide, die bei der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, sind z. B. in den US-Pa tenten 4.431.822; 4.670.046; 4.670.042 und 4.439.229 und der veröffentlichten Internationalen Anmeldung (PCT) WO 87/07602 offenbart. Die letzte ren zwei Literaturstellen offenbaren auch andere NHet-Ringe, die verwendet werden können, wie die Ringe, die z. B. in Spalte 4, Zeile 25 bis Spalte 5, Zeile 20 von US-Patent 4.439.229 und auf den Seiten 12-14 von WO 87/07602 dargestellt sind.

Andere geeignete Herbizide des PhNHet-Typs sind:
Aryltriazolinone wie die, die in den US-Patenten 4.318.731; 4.398.943; 4.404.019; 4.702.945; 4.705.557; 4.702.763; 4.761.174 und den Interna tionalen Anmeldungen (PCT) WO 85/01637; WO 85/04307; WO 87/00730; WO 87/03782; WO 86/04481 und WO 88/01133; Aryltetrazolinone wie die, die in den US-Patenten 4.734.124 und den Internationalen An meldungen (PCT) WO 85/01939 und WO 87/03873 offen bart sind; Aryltriazindione, wie die, die in den US-Patenten 4.755.217 und 4.766.233, der Interna tionalen Anmeldung (PCT) WO 86/00072 offenbart sind; Arylhydantoine wie die, die in US-Patent 4.427.438 offenbart sind; Arylurazole, wie die, die in US-Patent 4.452.981 offenbart sind und Arylhexa hydropyridazine, wie die, die in US-Patent 4.619.687 offenbart sind.

B. Heterocyclische Arylurethane, wie die, die in US- Patent 4.521.242 offenbart sind.

C. Phenylether-Herbizide, wie die, die eine p-Halogen oder p-Nitrophenoxyphenylstruktur haben, wie die folgenden im Handel erhältlichen Materialien:

Andere geeignete im Handel erhältliche Diphenyl- Herbizide sind
Lactophen:
1-(Carboethoxy)-ethyl-5-(2-chlor-4-tri fluormethylphenoxy)-2-nitrobenzoat,
Fluoroglycofen:
(Carboethoxy)-methyl-5-(2-chlor-4- trifluormethylphenoxy)-2-nitrobenzoat,
Fromesofen:
5-(2-Chlor-4-(trifluormethyl)phenoxy)- N-methylsulfonyl-2-nitrobenzamid,
Chloronitrofen:
2,4,6-Trichlor-(4-nitrophenoxy)- benzol,
Fluorodifen:
2-Nitro-1-(4-nitrophenoxy)-4-trifluor methylbenzol,
Nitrofen:
2,4-Dichlor-1-(4-nitrophenoxy)-benzol,
Chlomethoxifen:
4-(2,4-Dichlorphenoxy)-2-methoxy-1- nitrobenzol.

Ein weiteres geeignetes Diphenylether-Herbizid ist Methyl-5-(2-chlor-4-trifluormethylphenoxy)-2- nitroacetophenonoxim-O-acetat.

D. Arylpyrazol-Herbizide, wie die in den US-Patenten 4.563.210; 4.496.390 und 4.459.150 und der deutschen Offenlegungsschrift 3.520.327 A1 offen barten.

E. Verbindungen der Formel

worin X^b O oder S ist und "Ph" die oben beschrie bene Bedeutung hat, wie Verbindungen, die in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 273.417 oder dem Derwent Abstract Nr. 87-040749 offenbart sind.

Die Behandlung mit den Mitteln der Erfindung kann durch intravenöse oder intraperitoneale Injektion bewirkt werden. Das Mittel kann als sterile Zusammensetzung verwendet werden, die das Mittel in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, z. B. einer wäßrigen isotonischen Lösung wie wäßriger Kochsalzlösung (z. B. 0,9% NaCl) oder Dulbecco′s phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit einer Konzentration von z. B. 2,5 mg ml^-1 gelöst oder dispergiert enthält oder das Mittel in einem Liposomen system enthält, wie einem, das mit einem Phospholipid vesikel in einer auf den Seiten 1659-1660 von Reming ton′s Pharmaceutical Sciences 1985 (17. Ausgabe) veröf fentlicht von Mack Publishing Company, beschriebenen Art, hergestellt wurde. Zum Beispiel können analog zu der bei Jori et al., Br. J. Cancer (1983), 48 auf Seite 307 beschriebenen Formulierung 51,4 mg Dipalmitoyldi phosphatidyl-cholin in 10 ml einer 1 mM Lösung des Mit tels in Chloroform-Methanol (9 : 1, V/V) gelöst werden und nach sorgfältigem Mischen kann das Lösungsmittel unter Vakuum bei 30°C entfernt werden, was einen Feststoff er gibt, der in 10 ml eines 0,01 M Phosphatpuffers, pH 7,4 enthaltend 150 mM NaCl resuspendiert werden kann und die trübe Lösung dann bei 50°C 30 Minuten beschallt werden.

Die Enzymhemmstoffe, die bei der Durchführung der Erfin dung angewendet werden, können an geeignete tumorspezi fische monoklonale Antikörper (Mab′s) konjugiert oder gebunden sein unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Bindungstechnologie als Mittel, um den Enzym hemmstoff zu der speziellen Tumorstelle hinzusteuern.

Die Enzymhemmstoffe, die gemäß Erfindung verwendet wer den, können auch durch einfache orale Einnahme, vor zugsweise in verdünnter Form zusammen mit einem pharma zeutisch annehmbaren Träger verwendet werden, z. B. indem sie der Nahrung beigegeben werden, wie in Beispiel 6, unten dargestellt.

Es kann wünschenswert sein, insbesondere für die orale Verabreichung, Enzymhemmstoffe zu verwenden, die was serlösliche Salze sind oder die sauer sind und wasser lösliche Natrium- oder Kaliumsalze bilden, wie ein saures Sulfonamid der Art, wie sie in den Internationa len Anmeldungen (PCT) WO 87/03782 (z. B. Mittel 6c in Beispiel 6 unten) oder WO 85/001939 und WO 87/037873 offenbart sind oder ein wasserlösliches Salz davon oder eine Carbonsäure oder ein wasserlösliches Salz davon, wie das als Natriumsalz bekannte Acifluorfen zu verwen den.

Die Enzymhemmstoffe, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, können in übliche pharmazeutische Formu lierungen wie Tabletten (wie z. B. komprimierte Tablet ten, die beschichtet sein können, z. B. mit Zuckerpaste und/oder Syrup), Zäpfchen, Kapseln (z. B. Hartgelatine kapseln), Suspensionen, Lösungen, Pulver oder Ampullen eingebracht werden. In solchen Formulierungen kann das Mittel in Mischung mit einem pharmakologisch annehmbaren festen und/oder flüssigen Träger vorhanden sein, der, wenn gewünscht, ein Nahrungsmittel sein kann; z. B. kann er ein Feststoff sein wie Maisstärke oder ein flüssiges Verdünnungsmittel wie Wasser oder ein eßbares Öl oder Mineralöl oder ein Lösungsmittel z. B. Dimethylsulfoxid. Mischungen der Enzymhemmstoffe können verwendet werden, z. B. eine Mischung von Mittel 6c von Beispiel 6 unten und Acifluorfen, z. B. in annähernd gleichen Anteilen.

Die Dosierung, die angewendet wird, kann durch Routine versuche, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, bestimmt werden, z. B. Versuche der Art, wie sie für Photofrin II in dem Artikel von Dougherty in "Photodynamic Therapy (PDT) of Malignant Tumors" in CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, Vol. 2, Issue 2, (1984), S. 83-116 beschrieben sind.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

HeLa-Zellen (eine menschliche Tumorzellinie, die all gemein in der Tumorforschung angewendet wird und von der American Type Culture Collection erhalten wurde), die in der logarithmischen Wachstumsphase waren (die bei 37°C 5 Tage in 1 l-Falcon-Gewebekulturkolben kultiviert worden waren) wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Eine 0,25%ige Lösung von Trypsin in PBS (2 ml) wurde zugegeben und nach mehreren Minuten wurden die Zellen vorsichtig aus dem Kolben entfernt und in 110 ml einer 25 mM Lösung von Hepes in Minimum Essential Medium (MEM), das mit 10% V/V inaktiviertem Kälberserum, 1,1 ml einer 200 mM Lösung von Glutamin in 0,85% Kochsalz lösung und 11 000 Einheiten Penicillin/11 000 mcg Streptomycin angereichert war, eingebracht.

Dann wurden 5,0 ml Aliquots der entstehenden resuspen dierten Zellkultur jeweils in einen 50 ml Falcon Gewe bekulturkolben gebracht und (mit Ausnahme der Kontrolle) mit dem Behandlungsmittel gemischt. Die Aliquots wurden dann in der Dunkelheit bei 37°C drei Tage inkubiert. Die Zellen wurden dann entfernt und unter grünem Licht in der folgenden Weise extrahiert: Die Zellen wurden vom Boden des Kolbens durch Zugabe von 0,8 ml einer 0,25%igen Lösung von Trypsin in PBS entfernt. Nach einer Stunde Inkubation im dunkeln wurden Zellen und Medium aus den Kolben entfernt, in Rundzentrifugenröhrchen gebracht und dann zwei Zyklen Einfrier-Auftau-Bedin gungen unterworfen, um die Zellen aufzubrechen und die Extraktion zu ermöglichen.

Die Untersuchung der Zellsuspensionen nach diesem Auf brechsystem zeigte keine intakten Zellen mehr. 10 ml basisches Aceton (90% Aceton: 10% 0,1 N NH₄OH) wurden dann zu jedem Röhrchen zugegeben und die Röhrchen wurden zentrifugiert, um Protein und Zellbruchstücke zu ent fernen. 5 ml Wasser wurden zu dem Überstand zugegeben, anschließend 0,5 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von NaCl. Der pH wurde dann auf 6,8 eingestellt durch tropfenweise Zugabe von 2 M KH₂PO₄. Der wäßrige Ace tonextrakt wurde dann auf eine C8-Baker-Prep-Säule ge laden. Die Säulen wurden getrocknet und dann mit 2 ml Wasser gewaschen. Die Tetrapyrrole wurden mit 2 × 1,5 ml Volumen von 90/10 CH₃OH/H₂O eluiert. Die Extrakte wurden dann in einem Spektrofluorometer quantitativ bestimmt.

Die Behandlungsmittel, die in dieser Untersuchung ver wendet wurden, waren:

A. 5-Amino-laevulinsäure, die als Vorläufer von Tetra pyrrolen bekannt ist.

B. Acifluorfen-methyl mit der Formel:

C. ein Herbizid der Formel:

D. ein Herbizid der Formel:

E. ein Herbizid der Formel:

Das Mittel A wurde als Filter sterilisierte 250 mM Lösung in Wasser, pH 6,5 angewendet. Die Mittel B, C, D und E wurden als 50 mM Lösungen in Aceton geliefert.

Aceton wurde auch zu der Kontrolle zugegeben, um eine Konzentration von 0,2% V/V darin zu liefern. Die zu den Zellkulturen zugegebenen Mengen der Mittel waren so, daß sich die in Tabelle 1 unten angegebenen Konzentrationen ergaben. Die Mengen des Tetrapyrrols Protoporphyrin IX ("Proto IX"), die produziert wurden, sind in dieser Tabelle gezeigt.

Tabelle 1

Tetrapyrrol-Akkumulierung in behandelten HeLa-Zellen

Beispiel 2

HeLa-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase, die sechs Tage in 6 1 l Falcon Gewebekulturkolben bei 37°C gezogen worden waren, wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Eine 0,25%ige Lösung von Trypsin in PBS wurde zugegeben und nach mehreren Minuten wurden die Zellen sanft entfernt und in 110 ml einer 25 mM Lösung von Hepes in Minimum Essential Medium (MEM), das mit 10% V/V inaktiviertem Kälberserum, 1,1 ml einer 200 mM Lösung von Glutamin in 0,85% Koch salzlösung und 11 000 Einheiten Penicillin/11 000 mcg Streptomycin angereichert war, gebracht.

Aliquots (jeweils 5,0 ml) der resuspendierten Zellkultur wurden in 50 ml Falcon Gewebekulturkolben gebracht, mit oder ohne Herbizid und im dunkeln 4 Tage bei 37°C inku biert, wobei das Herbizid in verdünnter Acetonlösung wie in Beispiel 1 zugegeben wurde. Aceton wurde auch zu den Kontrollen zugegeben, was eine Konzentration an Aceton von 0,2% V/V darin lieferte. Die Menge an Herbizid war so, daß die in Tabelle 2 unten angegebenen Konzentra tionen erreicht wurden.

Die Behandlungsmittel waren:

B. wie in Beispiel 1
C. wie in Beispiel 1
F. ein Herbizid der Formel:

Extraktion:
Die Medien aus jedem der Kolben wurden in Glasrundbo denröhrchen gebracht, während die Zellen, die an den Böden der Kolben hafteten, durch Zugabe von 0,5 ml einer 0,25%igen Lösung von Trypsin in PBS gelockert wurden und nach mehreren Minuten bei 37°C dann aus den Kolben gewaschen und mit ihren Medien wiedervereinigt wurden. Aliquots von 100 µl wurden dann aus jeder Zellsuspension entfernt, um die Zelldichte zu bestimmen. Die verblei benden 5,4 ml Zellsuspension wurden dann 30 Minuten beschallt, um die Zellen zu aufzubrechen.

10 ml basisches Aceton (90% Aceton: 10% 0,1 N NH₄OH) wurden dann zu jedem Röhrchen zugegeben und die Röhrchen wurden zentrifugiert, um Protein und Zellbruchstücke zu entfernen. 5 ml Wasser wurden zu dem Überstand zugege ben, anschließend 0,5 ml einer gesättigten, wäßrigen Lösung von NaCl. Der pH wurde dann auf 6,8 eingestellt durch tropfenweise Zugabe von 2 M KH₂PO₄. Der wäßrige Acetonextrakt wurde dann auf C8-Baker-Prep-Säulen ge laden. Die Säulen wurden getrocknet und dann mit 2 ml Wasser gewaschen. Die Tetrapyrrole wurden mit 3 ml 90/10 CH₃OH/H₂O eluiert. Wie in Beispiel 1 wurden alle diese Extraktionsverfahren im wesentlichen vollständig unter Protoporphyrin IX nicht anregendem Licht (z. B. Grün licht) oder im dunkeln (z. B. in lichtundurchlässig be schichteten Behältern) durchgeführt. Die Fluoreszenz der Extrakte wurde dann bestimmt an einem SPEX-Spektral fluorometer. Die Protoporphyrin IX-("Proto IX")-Akkumu lation wurde quantitativ bestimmt unter Verwendung vorbestimmter Extinktionskoeffizienten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten angegeben.

Tabelle 2

Durchschnittliche Wachstumshemmung und Proto IX-Akkumulation

Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft die Her stellung von Protoporphyrin IX (im folgenden "Proto IX"). Gemäß diesem Aspekt werden eukaryontische Mikro algen heterotroph im dunkeln (oder unter Proto IX nicht anregendem Licht) in einem Medium, das ein Mittel (oben beschrieben) enthält, das die enzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen in Proto IX hemmt, gezüchtet. Das Medium oder die Algen oder beides werden dann behandelt, um Proto IX zu extrahieren und es von Chlorophyll, Ca rotinoiden und Zellbruchstücken etc. zu trennen. Die Trennung kann in jeder geeigneten Art erfolgen, wie durch Flüssigphasenchromatographie einschließlich Reverse Phase Flüssigchromatographie oder durch Lösungs mittelextraktion oder durch Ausfällen von Proto IX durch Komplexierung z. B. mit einem Metall wie Fe, Zn oder Mg, Entfernung der entstehenden Chelatverbindung und, falls gewünscht, Regenerierung des Proto IX z. B. durch die bekannte Behandlung des Chelats mit verdünnter Säure.

Die Abtrennungsschritte werden unter Proto IX nicht anregendem Licht (wie grünem Licht, wie es in Testbeispiel A unter der Überschrift "Dunkelheit" beschrieben ist) oder im dunkeln durchgeführt. Das Eisenchelat ist nicht so lichtempfindlich, so daß die Belichtung mit Licht eher erlaubt ist, wenn dieses Material behandelt wird.

Die Mikroalgen werden vorzugsweise als Zellsuspension bei einer Temperatur im Bereich von etwa 15 bis 30°C gezüchtet. Die Konzentration des Hemmstoffes kann etwa 10^-5 bis 10^-7 M zum Beispiel sein. Beispiele von Mikro algen, die verwendet werden können, sind Scenedesmus sp., Chlamydomonas Reinhardi, Euglena sp. und Bumille riopsis filiformis.

Beispiel 3

log-Phasen-Kulturen von Chlamydomonas Reinhardi (Wildtyp) wurden in einer Tonne aus rostfreiem Stahl (z. B. 300 l) unter Verwendung des unten beschriebenen Kulturmediums gezüchtet. Eine Acetonlösung von 1- (Carbethoxy)-ethyl-5-(2-chlor-4-trifluormethylphenoxy)- 2-nitrobenzoat (Lactophen, ein im Handel erhältliches Phenylether-Herbizid) wird zugegeben, um eine Konzen tration von 10^-5 M und eine Endkonzentration von Aceton von 0,1% zu schaffen. Diese Mischung wird im dunkeln 4-7 Tage bei 25°C unter leichtem Rühren und/oder Belüf tung wachsen gelassen. Während die Dunkelheit aufrecht erhalten wird, wird der Inhalt der Tonne filtriert und das Filtrat wird behandelt, um das darin enthaltene Protoporphyrin IX zu gewinnen.

Eine Methode der Behandlung, um das Protoporphyrin IX zu gewinnen, ist, den Inhalt der Reaktionstonne (unter Auf rechterhaltung der Dunkelheit) zu filtrieren und Aceton zu dem Filtrat zuzugeben. Diese Mischung wird mit Pe trolether extrahiert. Die wäßrige Acetonmischung wird dann mit Diethylether extrahiert und der Diethylether wird durch Verdampfen entfernt, wobei ein Rückstand zurückbleibt. Dieser Rückstand wird in Methanol gelöst und einer Reverse Phase Chromatographie unterworfen, um Protoporphyrin IX zu liefern. Auch die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Gewinnungsverfahren können ver wendet werden.

Zusammensetzung des Mediums

Stammlösung der Spurenmetallmischung
H₃BO₃
100 mg/L
ZnSO₄·7 H₂O	100 mg/L
MnSO₄·4 H₂O	40 mg/L
COCl₂·6 H₂O	20 mg/L
NaMoO₄·2 H₂O	20 mg/L
CuSO₄	4 mg/L

Eine Alternative zur Verwendung von Chlamydomonas Rein hardi ist Scendesmus sp., der auf dem obigen Medium gezüchtet wurde, wobei Natriumacetat durch Glucose er setzt ist, zu verwenden.

Beispiel 4

Dieses Beispiel ist dasselbe wie Beispiel 3, mit der Ausnahme, daß die Herbizidverbindung 1-(4-Chlor-2- fluor-5-propargyloxyphenyl)-3-methyl-4-difluormethyl-Δ²- 1,2,4-triazolin-5-on statt Lactophen verwendet wird.

Beispiel 5 Bestimmung von I₅₀

Protoporphyrinogen IX ("Protogen IX") Proto IX wurde von Porphyrin Products, Logan UT. erwor ben und wie bei T. P. Fuesler et al., Plant Physiol., 67, 246-249 (1981) ausgeführt, gereinigt. Protogen IX wurde frisch hergestellt durch Reduktion von Proto IX mit Na/Hg-Amalgam, wie bei N. J. Jacobs und J. M. Jacobs, Enzyme, 28, 206-219 (1982) beschrieben, unter Verwendung des gereinigten Proto IX bei einer Konzentration von 300 µM.

Pflanzenmaterial

Gurke (Cucumis sativus L, cultivar "Wisconsin SMR 18") wurde in einer dunklen Wachstumskammer gezogen auf Ver miculit, der mit einem handelsüblichen (9-45-15) Dünger berieselt worden war. Die Keimlinge wurden bei 25°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 80-90% gezogen. Zwischenzeitliche Belichtung, 1 Minute Licht pro 60- Minuten-Zyklus mit einer gemessenen Intensität von 25 µE/m^-2sec^-1 (PAR) wurde durch eine General Electric "Bright Stick"-Vorrichtung, die durch eine elektroni sche Zeitschaltuhr kontrolliert wurde, geliefert. Dies lieferte Gewebe, das zu einer schnellen Chlorophyll synthese fähig war, wobei die Stärkereserven und An fangschlorophyllgehalte minimal waren.

Chloroplast Isolierung

Sich entwickelnde Chloroplasten wurden isoliert, wie von T. P. Fuesler et al., Plant Physiol., 75, 662-664 (1984) beschrieben, mit der Ausnahme, daß im Endreinigungs schritt die Plastide durch ein 40% statt 45% (V/V) Percoll Kissen zentrifugiert wurden. Die Chloroplasten wurden in einem Testpuffer, der 0,5 M Mannit, 20 mM TES, 10 mM Hepes, pH 7,7, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl₂, 1% (G/V) Rinderserumalbumin und 1 mM Dithioerythritol enthielt, auf eine Endkonzentration von 2 mg Protein pro ml re suspendiert.

Test auf Protoporphyrinogen-Oxidase

Tests wurden durchgeführt, wie von J. M. Jacobs und N. J. Jacobs, Arch. Biochem. Biophys. 229, 312-319 (1984) ausgeführt. Proben (0,2 ml) der Chloroplastensuspension wurden 15 Minuten im dunkeln vorinkubiert mit verschie denen Konzentrationen von Acifluorfenmethyl ("AFM") oder mit 0,2% (V/V) Aceton (als "Kontrolle"). Dann wurden 50 µl frisch hergestelltes Protogen (etwa 15 nM) zu der Suspension zugegeben, um die Reaktion zu ini tiieren. Die Tests wurden durch die Zugabe von 2,75 ml des fluorimetrischen Mediums von N. J. Jacobs und J. M. Jacobs, Enzyme, 28, 206-219 (1982) beendet, das aus 1% (V/V) Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), 50 mM Tris HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA bestand; 1 mM Dithioery thritol ersetzte 5 mM Glutathion. Die Suspensionen wur den dann direkt an einem SPEX-Fluorolog-2- Spektralfluorometer, das mit einem Frontfluoreszenzzu satz für trübe biologische Proben ausgestattet war, abgelesen. Die Menge an produziertem Proto IX wurde aus einer Standardkurve quantitativ bestimmt (Menge an Proto IX gegen Emission bei 630 nm, bei Anregung mit 400 nm), die mit gereinigtem Proto IX in fluorometrischem Medium erstellt wurde.

Um die Menge der nichtenzymatischen Oxidation zu Proto IX im obigen Test zu bestimmen, wurde derselbe Test durchgeführt mit der Ausnahme, daß statt der Suspension aktiver Chloroplasten eine Suspension verwendet wurde, in der die Chloroplasten durch 15-minütige Erhitzung auf 85°C inaktiviert worden waren. Das Subtrahieren der Menge an so produziertem Proto IX von der Menge, die in Gegenwart der aktiven Chloroplasten produziert wurde, ergab die Menge an enzymatisch gebildetem Proto IX. Die Ergebnisse sind graphisch in Figur 1 gezeigt (worin LSD die geringstwertige Differenz angibt, wie es üblich ist). Figur 1 zeigt, daß der I₅₀-Wert (die Konzentra tion, die 50% Hemmung liefert) geringer ist, als 0,1 µM, d. h. etwa 0,03 µM.

Tests der Wirkung von 10 µM AFM auf die enzymatische Umwandlung von Proto IX zu Magnesium-Proto IX in der Chloroplastensuspension (in Gegenwart von ATP) zeigten, daß AFM keine Hemmwirkung auf die Umwandlung hatte.

Beispiel 6

In diesem Beispiel wurden die Enzymhemmstoffe dem Futter für tumortragende Mäuse beigegeben; bei einigen der Mäuse, die als Kontrolle verwendet wurden, wurde dem Futter kein Mittel zugegeben. Die Mäuse werden dann getötet und ihre Nieren, Darm, Nebennieren, Leber und Tumor wurden entfernt und auf ihren Gehalt an Proto IX analysiert. Die folgenden Enzymhemmstoffe wurden ange wendet:

Im einzelnen waren die Mäuse DBA/2 Ha-Mäuse, denen SMT- F-subkutane Tumoren am Tag 0 in die rechte Schulter injiziert worden waren. Die Mäuse, die einzeln unterge bracht waren, erhielten unbehandeltes Purina Nagetier futter 5001-(Purina Rodent Chow 5001)-Brei am Tag 1, danach vom Tag 2 bis 10 erhielten die Mäuse denselben Brei, der mit 2000 ppm des zu testenden Hemmstoffes (oder bei den Kontrollen desselben unbehandelten Breis) behandelt war. Die Behandlung des Breis wurde bewirkt, indem er mit einer geringen Menge einer Acetonlösung des zu untersuchenden Stoffes gemischt wurde. Die Mäuse wurden dann am Tag 10 getötet, mit Ausnahme der mit dem als 6j bezeichneten Mittel behandelten Maus; letztere wurde am Tag 7 getötet. Die Gewebe wurden über Nacht bei 4°C gekühlt, dann trocken-geblottet und das Frischge wicht jeder Gewebeprobe wurde aufgezeichnet. Die Gewebe wurden dann in 5 ml oder 10 ml, im Fall des Darms und der Leber, Aceton-0,1 N NH₄OH (9 : 1, V/V) homogenisiert. Die Homogenate wurden dann bei 1500 g zentrifugiert und die Überstände wurden auf einem SPEX-FA 112 Spektral fluorometer analysiert; Anregung 400 nm, Emission 630 nm Wellenlänge, die Optima für Proto IX. Die Proto IX-Ak kumulation wurde bestimmt als cps (Fluoreszenzzählim pulse pro Sekunde emittiert) pro Gramm Gewebe. Die Ergebnisse sind unten aufgelistet (die Ergebnisse sind Durchschnittswerte für zwei Mäuse pro Behandlung mit Ausnahme der Behandlungen mit den Mitteln 6f, 6h, 6i und 6j, bei denen nur eine Maus behandelt wurde):

Proto IX Durchschnitts cps pro Gramm × 10³

Diese Zahlen entsprechen den folgenden Konzentrationen an Proto IX in den jeweiligen Geweben, ausgedrückt als µg Proto IX pro Gramm Gewebe:

Der oben zitierte Artikel von Dougherty gibt eine Zahl von 3,6 µg/g für die Konzentration des Porphyrins bei derselben Art (SMT-F) Tumor nach Injektion von 10 mg/kg Hämatoporphyrinderivat in dieselbe Art (DBA/2 Ha) Maus an. Andere technische Literatur (Moan et al. P 46-5, Seiten 713-721; beachte Figur 2 auf Seite 716) deuten an, daß eine Konzentration von etwa 12 µg/g des Porphy rins in Tumoren erreicht wird (C₃H/Tif Mammakarzinom) in DBA/H2-Mäusen nach intraperitonealer Injektion von 25 mg/kg Photofrin II, dem weitverbreiteten Sensibilisie rungsmittel für photodynamische Behandlung und Nachweis von Krebs.

Die Gesamtmengen der von den Mäusen verbrauchten, das Mittel enthaltenden Nahrung waren wie folgt 6a, 22 und 35 g; 6b 37 und 35 g; 6c 25 und 22 g; 6d 41 und 32 g; 6e 40 und 44 g; 6f 27 g; 6g 33 und 40 g; 6h 36 g; 6i 10 g; 6j 20 g.

Bei der Vorbereitung der in diesem Beispiel 6 beschrie benen Untersuchungen wurden die folgenden Routine schritte durchgeführt, unter Verwendung (wenn nicht anders angegeben) des Mittels, das in diesem Beispiel als 6c bezeichnet wird bei nicht tumortragenden Tieren:

a. Die LD₅₀ des Mittels wurde bestimmt als über 2600 mg/kg liegend (d. h. mg des Mittels pro kg Körper gewicht) für Ratten (bestimmt während eines 14- tägigen Zeitraumes anschließend an eine einzelne orale Dosis, die Maisöl enthaltend 15% des Mittels umfaßte) und mehr als 700 mg/kg für Mäuse (bestimmt während eines 14-tägigen Zeitraumes folgend auf eine einzelne orale Dosis, die Maisöl und 5% des Mittels umfaßte).
b. Bei Tests für die Trägermittel für die intraperi toneale Injektion, ohne das Mittel, wurde bestimmt, daß die Mäuse eine Injektion einer 0,5 ml Dosis einer Mischung von gleichen Teilen DMSO (Dimethylsulfoxid) und Wasser tolerieren konnten.
c. In Tests des in einer Mischung von 60% Maisöl und 40% DMSO intraperitoneal injizierten Mittels wurde bestimmt, daß die Mäuse eine Dosis von 100 mg/kg tolerieren konnten.
d. Die folgenden Versuche wurden mit Mäusen durchge führt:
- i) tägliche orale Gabe von 50 mg/kg (unter Verwendung einer 1%igen Lösung des Mittels in Aceton) 8 Tage lang
- ii) tägliche i.p.-Injektion von 50 mg/kg (unter Verwendung einer 1%igen Dispersion des Mit tels in Mineralöl, hergestellt durch Auflösen des Mittels in einem Tropfen DMSO und Mischen der entstehenden Lösung mit dem Mineralöl) 8 Tage lang;
- iii) tägliche topische Anwendung auf die Haut mit 50 mg/kg (unter Verwendung einer 1%igen Lösung in DMSO) 8 Tage lang;
- iv) Füttern 8 Tage lang mit einer Standardnahrung, in die 2000 ppm des Mittels, bezogen auf das Gewicht der Nahrung eingebracht worden waren;
- v) tägliche i.v.-Injektion von 50 mg/kg (unter Verwendung einer 2%igen Lösung in DMSO) 4 Tage lang.

Die in diesen Versuchen verwendeten Mäuse wurden dann getötet und ihre Gewebe auf Proto IX-Akkumulation untersucht.

In einem anderen Test wurde eine männliche Fisher 344- Ratte 27 Tage mit einem Futter, das 5000 ppm des Mit tels 6c enthielt, gefüttert und dann getötet. Die Gewebe dieser Ratte zeigten erhöhte Gehalte an Proto IX ver glichen mit einer Kontrolle, mit deutlichen Anstiegen der Gehalte in der Niere, dem Darm, dem Magen und dem Gehirn und nur einem geringen Anstieg des Gehalts in Muskelgewebe.

In den vorhergehenden Tests mit Ratten und Mäusen wurden die Tiere in einem Standard-12-Stunden-Dunkel-12-Stun den-Licht-Zyklus gehalten.

Beispiel 7

In einer Reihe von Versuchen gemäß den Beispielen 1 und 2 wurden Kulturen von HeLa-Zellen in Gegenwart von 100 µM verschiedener unten aufgeführter Behandlungsmittel inkubiert. Die aufgeführten %-Angaben neben jedem Be handlungsmittel zeigen das Ansteigen der Menge an Proto IX, das in Gegenwart dieses Behandlungsmittels produ ziert wurde, bezogen auf die von den Kontrollen im sel ben Experiment produzierten Mengen.

In Beispiel 6 verwendete Mittel:
6a) 337%; 6b) 366%; 6c) 297%; 6d) 1200%; 6e) 1210%; 6f) 280%; 6g) 326%; 6h) 431%; 6i) 544%; 6j) 469%.

Andere Mittel:

Beispiel 8

In diesem Beispiel wurde der Enzymhemmstoff 6c von Bei spiel 6 an Ratten verfüttert, Tumore wurden in Ratten implantiert und die tumortragende Zone wurde mit Licht bestrahlt, was eine Regression des Tumors bewirkte.

Genauer wurden 3 Sprague-Dawley Ratten mit Durch schnittsgewicht 120 g 6 Tage auf eine Diät mit einer Nahrung, die 2000 ppm des Mittels enthielt, gesetzt. Am Tag 3 wurden Chondrosarkoma in den rechten hinteren Schenkel jeder Ratte implantiert, indem 0,3 ml einer Suspension der Tumorzellen (1 Million Tumorzellen) in jiziert wurden. Am Tag 6 wurde der rechte hintere Schenkel jeder Ratte rasiert und enthaart, die Größe jedes Tumors gemessen und die Tumorfläche und die um gebende Haut wurden dann mit nicht-thermischen Dosen von 630 nm Licht mit insgesamt 270 J/cm² bestrahlt. Am nächsten Tag wurde gefunden, daß zwei Ratten offen sichtlich frei von Tumoren waren (d. h. keine tastbare Tumormasse) und die dritte Ratte zeigte eine fast voll ständige Regression des Tumors. Die umgebende Haut und das Muskelgewebe der Ratten waren leicht gebleicht und zeigten eine geringe Schwellung, deutlich weniger als mit der Photofrin II vermittelten photodynamischen Therapie einhergeht.

Testbeispiel A % Efflux-Test

Der % Efflux-Test verwendet Kotyledonen, die von etio lierten Gurkenkeimlingen geerntet wurden. In einem Anfangsschritt wird eine Masse von Kotyledonen im dun keln mit einer wäßrigen gepufferten Lösung, die einen radioaktiv markierten Zucker enthält, behandelt. Die Menge des von den Kotyledonen aufgenommenen Zuckers wird dann gemessen (durch Auszählen, wie unten beschrieben). Die Kotyledonenmasse wird dann in zwei Teile geteilt; ein Teil der Kotyledonen wird im Dunkeln mit einer wäßrigen gepufferten Lösung, die die zu testende Ver bindung enthält, behandelt, während der andere Teil auf dieselbe Weise im dunkeln behandelt wird, mit einer ansonsten identischen Lösung, ohne die Testverbindung, als Kontrolle. Die Kotyledonen im Kontakt mit der wäß rigen Lösungen werden dann 16 Stunden mit Licht be strahlt und dann aus den wäßrigen Lösungen getrennt; letztere werden dann gemessen (durch Zählen), um ihre Gehalte an radioaktiv markiertem Material zu bestimmen. Die Ergebnisse werden als % Efflux ausgedrückt, der wie folgt berechnet wird, worin s die Zählung des radioaktiv markierten Materials (pro Kotyledone), das durch die Kotyledonen in der Anfangsbehandlung aufgenommen wird, ist, S_T die Zählung des radioaktiv markierten Materials (pro Kotyledone) in der wässrigen Lösung, die die zu testende Verbindung enthält, nach Bestrahlung mit Licht und S_c die Zählung des radioaktiv markierten Materials (pro Kotyledone) in der wäßrigen Lösung der Kontrolle nach Bestrahlung mit Licht ist:

Genauer werden die folgenden Materialien und Bedingungen in dem % Efflux-Test angewendet:
Pflanzenmaterial:
Gurkensaat (Cucumis sativus L. cultivar "Wisconsin SMR 18") wurde gekeimt und in Vermiculit, der mit einem üblichen (9-45-15) Dünger berieselt worden war, gezüch tet. Die Keimlinge wurden bei 25°C und 80-90% relativer Luftfeuchtigkeit in einer dunklen Inkubationskammer gezogen. Die Kotyledonen wurden von den etiolierten Keimlingen 5 Tage nach Pflanzen geerntet und in 1,0 mM CaCl₂ gespült, alles unter grünem Licht.

Gepufferte Lösung:
1 mM KCl, 1 mM CaCl₂ und 2,0 mM Kaliumphosphat, einge stellt auf pH 6,5 (z. B. mit NaOH)
Radioaktiv markierter Zucker:
3-O-Methyl-3-[U-14C]-glucose der spezifischen Aktivität 10,9 GBq/mmol (Amersham Corp., Arlington Heights IL).

Anfangsbehandlung:
Gewaschene Kotyledonen (180-230) werden in einen 250 ml Weithals-Erlenmeyerkolben mit Schaumstoffstopfen, der 50 ml der gepufferten Lösung enthält, gegeben und der radioaktiv markierte Zucker wird in einer Menge zugege ben, die eine Konzentration von 600 nM in der Lösung ergibt. Der Kolben wird 24 Stunden mit 125 UpM auf einem Kreisschüttler im dunkeln geschüttelt. Die Kotyledonen werden dann auf einem Nylonnetz gewonnen und dreimal mit 20 ml Volumen 1 mM CaCl₂ gespült. Die Aufnahme des radioaktiv markierten Zuckers wird gemessen, indem 3 Proben von 5 Kotyledonen jeweils in NCS Gewebesolubili sierungsmittel (Amersham Corp.) aufgeschlossen werden und das entstehende Mazerat in einem Flüssigszintil lationsspektrometer gezählt wird. (Die Ergebnisse dieser Aufschlüsse erwiesen sich als äquivalent mit derselben Bestimmung, die gemacht wurde, indem Probekotyledonen in einer Autooxidationsvorrichtung verbrannt wurden).

Behandlung mit der zu testenden Verbindung (und Kontrollbehandlung)

5. Kotyledonen werden mit der abaxialen Seite nach oben auf 3 ml der gepufferten Lösung in einer zugedeckten Kunststoff-Petrischale mit 35 mm Durchmesser schwimmen gelassen. Die Testverbindung wird dann zugegeben (als Lösung in Aceton) in einer solchen Menge, daß sich eine vorbestimmte Konzentration (unten diskutiert) der Test verbindung in der gepufferten Lösung ergibt; die Aceton konzentration in der gepufferten Lösung ist dann 0,1% (V/V), in der Kontrolle ebenso wie in der Lösung, die die Testverbindung enthält. Die schwimmenden Kotyledonen werden dann herumgewirbelt durch Schütteln der Schalen 16 Stunden lang bei 90 UpM auf der Oberfläche eines Kreisschüttlers.

Bestrahlung mit Licht

Die Schalen, die die Kotyledonen, die auf den Lösungen schwimmen, enthalten, werden 16 Stunden einer Beleuch tung ausgesetzt, die durch 4 GE F20T12-CW-Fluoreszenz lampen geliefert wird, mit einer gemessenen Intensität von 150 µE m^-2 sec^-1 in der photosynthetisch aktiven Region des Spektrums (PAR) (gemessen an der Oberfläche der Kotyledonen), während die Schalen geschüttelt wer den.

Messung der Menge an radioaktiv markiertem Material in der Flüssigkeit

Die gesamte Flüssigkeit wird von den Kotyledonen ge trennt und dann in einem Flüssigszintillationsspektro meter ausgezählt.

Dunkelheit

Alle Behandlungen vor dem Beleuchtungsschritt werden im dunkeln oder unter grün fluoreszierendem Licht (d. h. Licht, das durch ein grünes Kunststoff-Kantenfilter gefiltert wird, das Licht von 450-600 nm durchläßt) durchgeführt.

Testbeispiel B

Kulturmedien

Medium M

Kulturmedium A wird hergestellt, indem 10 ml pro l einer wässrigen 10%igen Natriumacetatlösung (7,5 × 10^-3 M) zu Medium M zugegeben werden.

Die Komponenten werden zu destilliertem Wasser in der oben angegebenen Reihenfolge zugegeben und bei 15 psi 15 Minuten autoklaviert.

Stammkulturen gezüchtet in Gegenwart von Licht

Stammkulturen von y-1-Zellen werden axenisch in Flüs sigkultur aus Medium A oder M, vorzugsweise Medium M mit einem 14/10 Stunden Licht/Dunkel-Zyklus bei 25°C in Erlenmeyerkolben, die mit Polyurethanstopfen versehen sind, gehalten. Die Stammkulturen werden ohne zusätz liche Belüftung auf rotierenden Schüttlern mit 125 UpM inkubiert. Die Lichtintensität am Kulturlevel ist 120 µE m^-2 sec^-1 (PAR). Unter diesen Bedingungen werden die Kulturen in einer halbsynchronen Wachstumsart gezogen, bis sie die stationäre Phase von 2-4 × 10⁶ Zellen/ml erreichen.

Kulturen, die ohne Licht gewachsen sind (im dunkeln gewachsene Kulturen)

Zellen der stationären Phase aus den Stammkulturen, die in Gegenwart von Licht gewachsen sind (7,5 ml) werden in 750 ml Medium A in einen Erlenmeyerkolben transferiert. Die Zellen werden 3-4 Tage bei 25°C im dunkeln inku biert, unter Belüftung mit einem submersen Belüftungsrohr. Während dieses Zeitraumes durchläuft diese Kultur von y- 1-Zellen 7-8 Zellteilungen, wobei sie alles sichtbare Chlorophyll verliert und die Konzentration sollte 2-3 × 10⁶ Zellen pro ml sein.

Herstellung von Zellen zur Verwendung im Test

Zellen werden von einer frisch hergestellten, im dunkeln gewachsenen Kultur (750 ml) durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit, d. h. etwa 2000 UpM, ungefähr 5 Minuten bei etwa 20°C geerntet. Die Zellen werden leicht resuspendiert in 50 ml Medium A. Eine Probe dieser Suspension (ungefähr 0,25 ml) sollte auf Motilität ge testet werden, und nach Fixierung mit einer wässrigen 1%igen Glutaraldehydlösung sollte eine Zell Zählung ge macht werden, um die Anzahl der Zellen pro ml zu be stimmen. Eine normale Zellzählung ist etwa 5 × 10⁷ Zellen pro ml. Aliquots von 1 ml (10⁷ Zellen pro ml) werden in die Testgefäße gebracht (z. B. Falcon® 24-Napf Gewebekulturplatten). An diesem Punkt sind die Zellen sehr motil und haben eine gelbe Farbe.

Die Testverbindung wird in einem Lösungsmittel (Aceton, Ethanol, Dimethylsulfoxid oder Wasser, vorzugsweise Aceton) gelöst, um eine Konzentration zu schaffen, die dem 1000 fachen der Endkonzentration entspricht. 1 µl dieser Testlösung wird zu jedem von 2 Näpfen mit einer 5 oder 10 µl Mikrospritze zugegeben. 4 Kontrollnäpfe pro Gewebekulturplatte werden auf die oben beschriebene Weise hergestellt, ohne daß die Testverbindung vorhanden ist. Die Gewebekulturplatten werden mit einem transpa renten Kunststoffdeckel bedeckt und in eine Wachstums kammer mit einer Lichtintensität von 70-90 µE m^-2 sec^-1 13 bis 16 Stunden bei 25°C gebracht. Wenn der Inhalt der Testnäpfe gelb erscheint, werden sie extrahiert, wie in der Sektion für die Auswertung der Ergebnisse unten beschrieben. Wenn der Inhalt der Testnäpfe transparent erscheint oder eine fahlgrüne Farbe hat, werden sie in einen Rotationsschüttler mit ungefähr 125 UpM gebracht und 2 Stunden mit einer Lichtintensität von etwa 600 µE m^-2 sec^-1 bestrahlt, bevor sie extrahiert werden.

Auswertung der Ergebnisse

Eine wäßrige, 10%ige Natriumdodecylsulfatlösung (250 µl) und Methanol (1 ml) werden zu jedem Testnapf zugege ben und sorgfältig gemischt. Die Mischungen werden im dunkeln 3-4 Stunden stehen gelassen. Die Gewebe kulturplatten werden bei Raumtemperatur mit niedriger Geschwindigkeit (ca. 2000 UpM) 5 Minuten zentrifugiert. Die Überstände werden entfernt und in einem Beckman Spektralphotometer Modell 35 zwischen 350 nm und 500 nm auf die Anwesenheit von Protoporphyrin IX, bei 668 nm, dem Absorptionspeak von Chlorophyll in diesem Lösungs mittelsystem und bei 720 nm, um einen Hintergrundtrübungswert zu verwenden, analysiert.

Analyse der Daten

Für jeden Napf wird ein Grünwert erhalten, indem der 720 nm-Wert von dem 668 nm-Wert abgezogen wird. Diese Werte werden für jede Konzentration der zu testenden Verbin dung und für die Kontrolle im Durchschnitt gebildet. Die % Hemmung ist

Claims

1. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem spezifischen Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase in Säuger-Tumorzellen, wobei der Inhibitor einen I₅₀ für Protoporphyrinogen- Oxidase von weniger als 1 µM hat, als Wirkstoff.

2. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem spezifischen Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase in Säuger-Tumorzellen, wobei der Inhibitor kein Tetrapyrrol ist und ein Redoxpotential hat, das negativer als -500 mV ist, als Wirkstoff.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ein Aryltriazolinon, ein Aryltetrazolinon, ein Aryltriazindion, ein Aryloxadiazol, ein Aryltetrahydroindazol, ein Aryltetrahydrophthalimid, ein Arylhydantoin, ein Arylurazol, ein Arylhexahydropyridazin, ein heterocyclisches Arylurethan, eine Phenoxyphenyl- Verbindung, ein Arylpyrazol oder eine Verbindung der allgemeinen Formel ist in der X^b ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und Ph eine substituierte Phenylgruppe darstellt.

4. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor mit einer Sulfonamidgruppe oder einem ihrer wasserlöslichen Salze substituiert ist.

5. Arzneimittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ein Aryltriazolinon ist.

6. Arzneimittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor die Formel aufweist.

7. Arzneimittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor die Formel 1-(4-Chlor-2-fluor-5- propargyl-oxyphenyl)-3-methyl-4-difluormethyl-Δ²-1,2,4- triazolin-5-on hat.

8. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor in Form eines wasserlöslichen Salzes oder in einer sauren Form vorliegt, die ein wasserlösliches Natrium- oder Kaliumsalz bildet.

9. Verwendung eines spezifischen Inhibitors der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase in Säuger-Tumorzellen, wobei der Inhibitor einen I₅₀ für Protoporphyrinogen-Oxidase von weniger als 1 µM hat, in der photodynamischen Behandlung von Tumoren.

10. Verwendung eines spezifischen Inhibitors der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase in Säuger-Tumorzellen, wobei der Inhibitor kein Tetrapyrrol ist und Redoxpotential hat, das negativer als -500 mV ist, in der photodynamischen Behandlung von Tumoren.

11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ein Aryltriazolinon, ein Aryltetrazolinon, ein Aryltriazindion, ein Aryloxadiazol, ein Aryltetrahydroindazol, ein Aryltetrahydrophthalimid, ein Arylhydantoin, ein Arylurazol, ein Arylhexahydropyridazin, ein heterocyclisches Arylurethan, eine Phenoxyphenyl- Verbindung, ein Arylpyrazol oder eine Verbindung der allgemeinen Formel ist in der X^b ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und Ph eine substituierte Phenylgruppe darstellt.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor mit einer Sulfonamidgruppe oder einem ihrer wasserlöslichen Salze substituiert ist.

13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ein Aryltriazolinon ist.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor die Formel hat.

15. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor die Formel 1-(4-Chlor-2-fluor-5- propargyl-oxyphenyl)-3-methyl-4-difluormethyl-Δ²-1,2,4- triazolin-5-on hat.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor in Form eines wasserlöslichen Salzes oder in einer sauren Form vorliegt, die ein wasserlösliches Natrium- oder Kaliumsalz bildet.