LU87949A1 - Preparation et utilisation de porphyrines - Google Patents

Description

Préparation et utilisation de porphyrines -

Un aspect de la présente invention concerne le traitement photodynamique de cellules tumorales d'un mammifère, tel qu'utilisé dans le traitement photodynamique du cancer.

A l'heure actuelle, il est bien connu d'acheminer un dérivé d'hématoporphyrine ou un mélange de porphyrines qui en dérivent (par exemple, la Photofrine II (marque commerciale déposée)), à des cellules de mammifères et ensuite, de soumettre de telles cellules à une lumière ayant une longueur d'ondes appropriée pour mettre en oeuvre la destruction des cellules. Une telle thérapie photodynamique fait l'objet d'une série d'articles ayant donné lieu à une édition spéciale de Photochemistry and Photobiology, volume 46, numéro 5, novembre 1987 (désigné ci-après par l'expression "P&P 46-5”). Comme indiqué dans ces articles, on utilise une telle thérapie photodynamique dans le traitement d'une large variété de cancers, y compris les cancers des bronches, de la vessie, de l'oesophage, du poumon, de la peau, de la tête et du cou, du cerveau, ainsi que les cancers du côlon, les cancers intra-oculaires et les cancers gynécologiques). On a établi que les effets biologiques d'une telle photosensibilisation de la porphyrine englobent:. la réticulation des protides membraneux, la peroxydation des lipides, l'inhibition du transport de certains métabolites essentiels, . la lyse de membranes lysosomiques et mitochondriennes, 1'inactivation de diverses enzymes, ainsi qu'une fixation accrue des porphyrines au niveau ' des cellules (P&P' 46-5, page 695) En général, on injecte la matière de porphyrine (par exemple, par voie intraveineuse ou par voie intrapéritonéale) , une dose spécifique s.' élevant à ..environ:..2._mg._de.-Photof r.ine_i:L_par_kgLde_poids du._corps

On peut également incorporer la matière de porphyrine dans un liposome et l'injecter (par exemple, par voie intrapéritonéale), comme révélé dans Spikes et collaborateurs "Photodynamic Behavior of Porphyrins in Model Cell, Tissue and Tumor Systems" dans Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases (édité par G. Jori et C.A. Perria), pages 45-53, Libreria Progetto, Padoue (1985), ainsi que dans les références citées dans ce document.

Dans la littérature technique, on fait mention du fait que 11 introduction de protoporphyrine dans des cellules telles que les érythrocytes humains (Dubbelman et collaborateurs, Biochimica et Biophysica Acta, 511 (1978) 141-151) ou dans des cellules de leucémie chez la murine (Kessel, Cancer Research 42, 1703-1706, mai 1982), a un effet de photosensibilisation marqué. Dans l'article de Kessel, on énonce le fait qu'il s'agit de l'agent de photosensibilisation le plus puissant de ceux soumis à. l'essai. Toutefois, lorsque Kessel et d'autres (par exemple, Berenbaum et collaborateurs, Br. J. Cancer (1982) 45, 571-581) ont injecté de la. protoporphyrine à des animaux, ils n'ont trouvé aucune protoporphyrine détectable dans les tumeurs, ce qui indique que la protoporphyrine introduite comme, telle dans le corps peut être aisément perdue dans le système circulatoire.

Il est également bien connu d'utiliser un dérivé de l’hématoporphyrine, ainsi que des matières similaires, pour la détection et la localisation de tumeurs telles que le cancer de. la vessie ou des poumons (P&P 46-5, page 759, par exemple).

Dans un aspect de la présente invention, l'agent destiné à traiter les cellules dans un tel traitement photodynamique ou dans les procédés connus -—de—détection—et"· de—localisation--de-tumeurs,-n'est pas une porphyrine ou n'est pas seulement une porphyrine. Au lieu de cela, il consiste en un agent inhibiteur enzymatique qui inhibe la transformation enzymatique du protoporphyrinogène en hème dans ces cellules, provoquant ainsi une accumulation de protoporphyrine IX endogène dans ces cellules. On a constaté que des agents tels que certains types de composés herbicides, qui inhibent la trans formation enzymatique du protoporphyrinogène en chlorophylle dans les cellules végétales, inhibent également la transformation enzymatique de protoporphyrinogène en hème dans les cellules de mammifères. La demanderesse pense que l'inhibition provoquée par de tels agents affecte probablement l'étape de transformation de protoporphyrinogène en protoporphyrine IX, à l'intervention d'une enzyme (la protoporphyrinogène-oxydase, EC 1.3.3.4)r de telle sorte que le protoporphyrinogène ne peut suivre la voie enzymatique normale pour aboutir à la protoporphyrine IX, mais au lieu de cela, s'oxyde dans la cellule (par exemple, dans le plasma), mais en dehors de la voie enzymatique normale (par exemple, à l'extérieur de la membrane des organites), le résultat étant une accumulation de protoporphyrine IX à des endroits où elle est indisponible, pour la transformation normale en hème, avec comme conséquence que, lorsque les cellules sont exposées à la lumière, cette protoporphyrine , IX accumulée a un effet destructeur des cellules, semblable à celui manifesté dans le traitement photodynamique décrit ci-dessus.

Les agents inhibiteurs enzymatiques de la présente invention sont des inhibiteurs spécifiques de la protoporphyrinogène-oxydase, dans ce sens qu'ils n'agissent pas comme des poisons enzymatiques généraux tels—que-des-iagents- de-~dénaturation ou de réticulation -(par exemple, des réactifs sulfhydriles) ; de préférence, il ne s'agit pas de matières qui affectent les conditions d'oxydation, telles que des accepteurs d'électrons ; c'est ainsi que des agents préférés pour la présente invention possèdent des potentiels d' oxydoréduction plus négatifs que -500 mV, tels que des potentiels plus négatifs que -800 mV (mesuré, par exemple de manière conventionnelle dans un solvant aprotique pour l'agent, comme lorsqu'on utilise la voltampèremétrie cyclique ou la polarographie). Il est également préféré que l'agent ne soit pas un tétrapyrrole et que son I50 pour la protoporphyrinogène-oxydase soit inférieure à environ 1 μΜ, à savoir inférieure à environ 0,3 μνα, par exemple, qu'il possède une I50 d'environ 0,1 ou de 0,03 ou encore de 0,01 μΜ ou moins.

De préférence, l'agent inhibiteur enzymatique est un agent possédant une capacité élevée de rompre la membrane plasmatique de la matière végétale. Un essai destiné à évaluer cette capacité consiste en un écoulement décrit dans l'article de Hailing et Peters dans Plant Physiology, 84, 1114-5 (1987) . Dans un tel essai (décrit plus en détail dans l'annexe A ci- dessous) , les agents préférés manifestent un écoulement total d.'au moins. 50% à un taux de traitement de 100 •μια, de préférence, à un taux de traitement de 1 μια ou moins, tel que 100 nM ; des matières fortement actives telles que la l-(4-chloro-2-fluoro-5- propargy1oxyphényl)-3-méthyl-4-difluorométhyl2-l,2,4-triazolin-5-one ou le lactophen (décrit ci-dessous) ’ donnent des pourcentages d’écoulement total supérieurs à 90% à une concentration de 100 nM.

Un autre essai destiné à évaluer la capacité d'une matière à détruire la membrane plasmatique d’une matière végétale, concerne l'essai dfinhibition de verdissement induit à la lumière, décrit plus en détail dans l'annexe B ci-dessous. ‘ Dans cet essai, on mesure la capacité à inhiber le verdissement à la lumière du mutant Y-l décoloré à l'obscurité de Chlamydomonas reinhardi (un type d'algue qui, lorsqu'elle croît dans l'obscurité, ne fabrique pas de chlorophylle, si bien que la masse de l'algue se blanchit du fait de la présence de nouvelles cellules non vertes, et qui procure de la chlorophylle lorsqu'on l'expose à la lumière). Bon nombre des composés préférés (agents) utilisés dans la présente invention ont la capacité d'inhiber le verdissement à la lumière, à raison d'au moins 50%, lorsqu'on utilise le composé à une concentration de 10"5M, de manière plus préférée, à une concentration de 10~6M ou moins, par exemple, de 10“7M. En outre, le composé doit être tel que, lorsqu'on l'utilise à cette concentration dans l'essai d'inhibition de verdissement à la lumière, il procure un produit surnageant qui manifeste un pic d'absorption de lumière à environ 405 nm, qui est supérieur au pic de la chlorophylle (le pic à environ 668 nm dans le système de la présente invention), par exemple, le produit surnageant manifeste un pic de 405 nm dont la hauteur représente 2, 3, voire 4 fois la hauteur du pic de 668 nm.

Parmi les agents inhibiteurs enzymatiques que l'on peut utiliser dans la mise en oeuvre de la présente invention, on peut citer les composés herbicides des classes ci-après (A à D) : A. Les herbicides hétérocycliques arylés de formule générale

Ph-NHet où "Ph" représente un groupe phényle substitué, de préférence ‘un groupe ‘ phényle ~2,4-disubstitué et, de manière plus préférée, un groupe phényle 2,4,5-trisubstitué et NHet représente un noyau hétérocyclique penta- ou hexagonal contenant 1 à 4 atomes cycliques d'azote et répondant à la formule

ou

ou

où Q représente le reste du noyau hétérocyclique et R représente un atome d'hydrogène ou un groupe substituant. Cette classe de composés englobent des matières telles que celles désignées par l'expression "la classe des imides cycliques des herbicides" dans un article de Wakabayashi et collaborateurs, J. Pesticide sci. Il, 635-460 (1986), dans lequel on trouve les composés ci-après en figure 1 :

Quant au composé I, il s'agit d’un herbicide d'oxadiazole arylé, notamment la 2-tert-butyl-4-(2,4-dichloro-5-isopropoxyphényl)-A^-2-1,3,4-oxa-diazolin-5-one. Dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique 3.385.862, 3.836.539 et 3.876.413, par exemple, on révèle d'autres 2-alkyl-4-(phényl 2,4,5-trisubstitué)-A2-l/3,4-oxadiazolin-5-ones que l'on peut utiliser dans la présente invention.

Quant au composé II, il s'agit d'un herbicide de tétrahydro-indazole arylé, notamment le 3-chloro-2-(4-chloro-2-fluoro-5-isopropoxyphényl)-4,5,6,7-tétra-hydro-2H-indazole. D'autres 3-substitué-2-(phényl 2,4,5-trisubstitué)tétrahydro-indazoles que 1 ' on peut utiliser dans la présente invention, sont révélés, par exemple, dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 4.670.043.

Quant aux composés III, IV et V, il s'agit d'herbicides de tétrahydrophtalimides arylés. D'autres tétrahydrophtalimides arylés que l'on peut utiliser dans la présente invention sont révélés, par exemple, dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique 4.431.822, 4.670.046, 4.670.042 et 4.439.229, ainsi que dans la demande internationale publiée (PCT) WO 87/07602. Dans ces deux dernières références, on révèle également d'autres noyaux NHet que l'on peut utiliser, de tels noyaux étant illustrés, par exemple, dë la colonne 4 ligne 25 à la colonne 5 ligne 20 du brevet des Etats-Unis d'Amérique 4.439.229 et. aux pages 12 à 14 du document WO 87/07602.

_______ —·- Comme autres herbicides ^appropriés du type

Ph-NHet, on peut citer : des triazolinones arylées telles que celles révélées dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique 4.318.731, 4.398.943, 4.404.019, 4.702.945, 4.705.557, 4.702.763, 4.761.174 et dans les demandes internationales (PCT) WO 85/01637, WO 85/04307, WO 87/00730, WO 87/03782, WO 86/04481 et WO 88/01133 ; des tétrazolinones arylées telles que celles révélées dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique 4.734.124 et dans les demandes internationales (PCT) WO 85/01939 et WO 87/03873 ; des triazine-diones arylées telles que celles révélées dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique 4.755.217 et 4.766.233, ainsi que dans la demande internationale (PCT) WO 86/00072 ? des hydantoines arylées telles que celles révélées dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 4.427.438 ; des urazoles arylés tels que ceux révélés dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 4.452.981 ; et des hexahydropyridazines arylées telles que celles révélées dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 4.619.687.

B. Des uréthannes hétérocycliques arylés tels que ceux révélés dans le brevet des Etats-Unis d’Amérique 4.521.242.

C. Des herbicides d'éther phénylique tels que ceux à structure ' p-halo- ou p-nitro-phénoxyphényle, tels que les matières ci-après disponibles dans le commerce : 5—(2-chlorb-4-(trifluöröméthyl) le 5-(2,4-dichloro- phénoxy)-2-nitro-N-méthane- phénoxy)-2-nitro- sulfonylbenzamide (fomesafen) benzoate de méthyle (bifenox)

le 5-(2-chloro-4-(trifluoro- le 2-chloro-l-(3- méthyl)phénoxy)-2-nitrobenzoate éthoxy-4-nitro- de sodium (acifluorfen) phénoxy)-4-tri- fluor ométhylbenz ène (oxyfluorfen)

Parmi d'autres herbicides appropriés d'éther diphénylique disponibles dans le commerce, on citera : le lactophen : le 5-(2-chloro-4-trifluoro- méthylphénoxy)-2-nitrobenzoate de l-(carboxyéthoxy)— éthyle, le fluoroglycofen : le 5-(2-chloro-4- trifluorométhylphénoxy)-2-nitrobenzoate de (carbo-éthoxy)méthyle, le fromesofen : le 5-(2-chloro-4-(trifluoro-méthyl)phénoxy)-N-méthylsulfonyl-2-nitrobenzamide, le chloronitrofen : le 2,4,6-trichloro-(4- nitro-phénoxy)benzène, le fluorodifen : le 2-nitro-l-(4-nitro- phénoxy) -4-trif luorométhylbenzène, le nitrofen : le 2,4-dichloro-l-(4-nitro- phénoxy)benzène, le chlométhoxyfen : le 4-(2,4-dichloro- phénoxy)-2-méthoxy-l-nitrobenzène.

Comme autre herbicide encore approprié d’éther diphénylique, on citera la 5-(2-chloro-4-trifluorométhylphénoxy)-2-nitro-acéto-phénone oxime-O-acétate de méthyle.

D. Des herbicides de pyrazoles arylés tels que ceux révélés dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique 4.563.210, 4.496.390 et 4.459.150, ainsi que i-dans la. publication allemande. 3520327 Al .........·.

E. Des composés de formule

où X*3 représente O ou S et "Ph" a la signification décrite ci-dessus, tels que les composés révélés dans la demande de brevet européen publiée 273417 ou dans "Derwent Abstracts", numéro d'ordre 87-040749.

On peut-mettre en oeuvre le traitement avec les agents de la présente invention, par injection par voie intraveineuse ou par voie intrapéritonéale. On peut utiliser l'agent sous forme d'une composition stérile comprenant l'agent dissous ou dispersé dans un support pharmaceutiquement acceptable, par exemple, dans une solution isotonique aqueuse telle qu'une solution saline aqueuse (par exemple, NaCl à 0,9%) ou dans une solution saline tamponnée au phosphate;. de Dulbecco (PBS), à une concentration de, par exemple, 2,5 mg/ml-1 ou bien comprenant l'agent dans un système liposomique tel que préparé à l'aide d'un véhicule phospholipidique, d'une manière, telle que décrite aux pages 1659-1660 dans Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985, (17ème édition), publié par Mack Publishing Company. Par exemple, de manière analogue à la formulation décrite par Jori et collaborateurs, Br. J. Cancer (1983), 48 à la page 307, on peut dissoudre „ 51,4 _mg_.de „dipalmitoyldiphosphatidylcholine,._dansii10,_ml d'une solution ImM de l'agent dans du chloroforme-méthanol (9:1, volume/volume) et après mélange intime on peut éliminer le solvant sous vide à 30°c, ce qui donne un solide que l'on peut remettre en suspension dans 10 ml d'un tampon de phosphate 0,01 M à un pH de 7,4 contenant du NaCl 150 mM et on peut soumettre la solution trouble aux ultrasons pendant 30 minutes à 50 ° C.

Les agents inhibiteurs enzymatiques que l'on peut utiliser dans la mise en oeuvre de la présente invention peuvent être conjugués ou liés à des anticorps appropriés monoclonaux spécifiques à une tumeur (MAB), en faisant appel à une technologie de liaison connue dans la technique, comme moyen pour cibler l'agent inhibiteur enzymatique par rapport à des sites tumoraux particuliers.

On peut également utiliser les agents inhibiteurs enzymatiques de la présente invention par simple ingestion par voie orale, de préférence, sous forme diluée, conjointement avec un support pharmaceutiquement acceptable, en les ajoutant, par exemple, à. la nourriture, comme illustré dans l'exemple 6 ci-dessous.

Il peut être souhaitable, en particulier pour l'administration par voie orale, d'utiliser les agents inhibiteurs enzymatiques qui sont des sels hydrosolubles ou gui sont acides et qui forment des sels de potassium ou de sodium hydrosolubles, tels qu'un sulfonamide acide du. type révélé dans les demandes internationales PCT (WO 87/03782, par exemple, l'agent 6c dans l'exemple 6 ci-dessous) ou WO 85/001939 et WO 87/037873 ou encore un sel hydrosoluble de ce dernier ou bien un acide carboxylique ou un sel hydrosoluble de ce dernier, tel. que le sel de sodium - connu comme - acifluorfen.

On peut incorporer les agents inhibiteurs enzymatiques que l'on peut utiliser dans la présente invention, dans des préparations pharmaceutiques conventionnelles telles que des comprimés (par exemple, des comprimés qui peuvent être enrobés de pâtes sucrée èt/ou de sirop), des suppositoires, des capsules (par exemple, des gélules dures, des suspensions, des solutions, des poudres ou des ampoules. Dans de telles préparations, l'agent peut être présent en mélange avec un support solide et/ou liquide pharmacologiquement acceptable, qui peut être, si on le souhaite, un oligoélément ; par exemple, il peut s'agir d'un solide tel que de l'amidon de maïs ou d'un diluant liquide tel que l'eau ou d'une huile comestible ou d'une huile minérale ou encore d'un solvant, par exemple le diméthylsulf oxyde. On peut utiliser des mélanges d'agents inhibiteurs enzymatiques, par exemple, un mélange de l'agent 6c de l'exemple 6 ci-dessous et d'acifluorfen dans, par exemple, des proportions approximativement égales. La posologie à utiliser peut être déterminée par 1 ' expérimentation de routine bien connue dans la technique, en faisant appel, par exemple, à des expériences du type décrit pour la Photofrine II dans l'article au nom de Dougherty, dans "Photodynamic Therapy" (PDT) of Malignant Tumors" dans CRC Critical Reviews dans Oncology/Hematology, volume 2, 2ème édition, 1984, pages 83-116.

Les exemples ci-après sont donnés dans le but d'illustrer davantage la présente invention.

Exemple 1 /

Dans une solution saline tamponnée au .. phosphate-^ PBS),—on^a-lavé-des-cellules. HeLa„.(une.. ligne de cellules tumorales humaines couramment utilisées pour la recherche des tumeurs et obtenues auprès de la "American Type Culture Collection") en phase de croissance exponentielle (cultivées à 37*C pendant 5 jours, dans des ballons Falcon de 1 1 pour cultures tissulaires). On a ajouté une solution à 0,25% de trypsine dans du PBS (2 ml) et, après plusieurs minutes, on a retiré doucement les cellules hors du ballon et on les a placées dans 110 ml d'uné solution 25 mM de Hepes, dans un milieu essentiel minimal (MEM) auquel on a ajouté du sérum de veau inactivé à 10% (volume/volume), 1,1 ml d'une solution 200 mM de glutamine dans une solution saline à 0,85% et il.000 unités de pénicilline/11.000 mcg de streptomycine.

Ensuite, on a chaque fois placé des quantités aliquotes de 5,0 ml de la culture cellulaire résultante remise en suspension, dans un ballon Falcon de 50 ml pour cultures tissulaires et (sauf pour le témoin) on les a mélangées avec l'agent de traitement. Ensuite, on a incubé les quantités aliquotes à l'obscurité à 37eC pendant trois jours. On_ a alors retiré les cellules et on les a extraites sous la lumière verte, de la manière suivante :

On a retiré les cellules du fond du ballon en ajoutant 0,8 ml d'une solution à 0,25% de trypsine dans du PBS. Après une heure d'incubation à l'obscurité, on a retire des ballons, les cellules et le milieu, on les a placés dans des tubes de centrifugation à fond rond, puis on les a soumis à deux séries de conditions de congélation-décongélation, afin de rompre les cellules et de permettre l'extraction.

L'examen des suspensions cellulaires, suite à ce régime de rupture, n'a révélé aucune cellule intacte. A chaque tube, on a alors ajouté 10 ml .... d'.acétone.basique (acétone 90%...: _l.0% .de.NE^OH 0,1 N)_et on a centrifugé les tubes pour éliminer la protéine et les débris cellulaires. On a ajouté 5 ml d'eau au produit surnagèant et 0,5 ml d'une solution aqueuse saturée de NaCl. On a alors réglé le pH à 6,8 par addition, goutte à goutte, de KH2PO4 2 M. On a alors chargé 1'extrait d'acétone aqueux sur une colonne C8 Baker Prep. On a séché les colonnes et on les a lavées avec 2 ml d'eau. On a élué les tétrapyrroles avec deux fois 1,5 ml en volume de 90/10 CH3OH/H2O. On a alors quantifié les extraits sur un spectrofluoromètre.

Quant aux agents de traitement utilisés dans cette expérience, il s'agissait de : A. L'acide 5-amino-lévulinique qui est connu comme étant un précurseur des tétrapyrroles.

B. L'acifluorfen-méthyle répondant à la formule :

C. Un herbicide de formule :

D. Un herbicide de formule :

E. Un herbicide de formule :

On a acheminé l'agent A sous forme d'une solution 250 mM dans de l'eau, stérilisée par filtration, pH 6,5. On a acheminé les agents B, c, D et E sous forme de solutions 50 mM dans de l'acétone. On a également ajouté de l'acétone aux témoins pour y obtenir une concentration de 0,2% volume/volume. on a ajouté les agents aux. cultures cellulaires, dans des quantités telles qu'elles donnent les concentrations spécifiées dans le tableau 1 ci-dessous. Les quantités de la tétrapyrrole-protoporphyrine IX ("Proto IX") obtenues sont indiquées dans ce tableau.

Tableau 1

Accumulation -- de tétrapyrrole dans des.cellules HeLa traitées

Emission de Quantité de Concentration fluorescence Proto IX Agent de 1*agent [μΜ] cps 400/630 (pmoles) À 5000 41842 4,2 B 100 12921 1,3 C 100 33477 3,5 D 100 10551 1,1 E 100 8967 0,9 Témoin 2795 0,3

Exemple 2

Dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de cellules HeLa (en phase de „j croissance exponentielle, cultivées à 37eC pendant 6 jours dans six ballons Falcon de 1 1 pour cultures tissulaires), on a ajouté une solution à 0,25% de trypsine dans du PBS et, après plusieurs minutes, on a retiré doucement les cellules et on les a placées dans 110 ml d'une solution 25 mM de Hepes dans un milieu essentiel minimal (MEM) auquel on a ajouté du sérum de veau inactivé à 10% volume/volume, 1,1 ml d'une solution 200 mM de glutamine dans une· solution saline à 0,85% et 11.000 unités de pénicilline/11.000 mcg de streptomycine.

On a placé des quantités aliquotes (chaque fois 5,0 ml) de la culture cellulaire remise en î suspension, dans des ballons Falcon de 50 ml pour cultures tissulaires, avec ou sans herbicide, et on les a incubées à l'obscurité à 37 eC pendant 4 jours, l'herbicide étant ajouté dans une solution diluée d ' acétone, comme ~à--l i exemples 1 —^-On~ a.. également... aj outé l'acétone aux témoins pour y obtenir une concentration d'acétone de 0,2% volume/volume. On a utilisé une quantité d'herbicide de façon à obtenir les concentrations spécifiées dans le tableau 2 ci-dessous.

Quant aux agents de traitement, il s'agissait de : B. Comme à l'exemple 1 C. Comme à l'exemple 1 F. Herbicide de formule :

Extraction : on a placé les milieux provenant de chacun des ballons, dans des tubes en verre à fond rond, tandis que les cellules adhérant au fond des ballons ont été détachées par addition de 0,5 ml d'une solution à 0,25% de trypsine dans du PBS et, après plusieurs minutes à 37*C, on les a lavées hors des ballons et on les a recombinées avec leurs milieux. On a alors retiré des quantités aliquotes de 100 μΐ de chaque suspension cellulaire, pour déterminer la densité cellulaire. On a alors'soumis aux ultrasons, pendant 30 minutes, la quantité restante de 5,4 ml de suspension cellulaire, pour rompre les cellules.

A chaque tube, on a. alors ajouté 10 ml d'acétone basique (acétone 90% : 10% de NH4OH 0,1 N) et on a centrifugé' les tubes pour éliminer les protéines et les débris cellulaires. On a ajouté 5 ml d'eau au produit surnageant, puis 0,5 ml d'une solution aqueuse - saturée de NaCl. ,. On a alors . . réglé le pH à - 6,8 par addition, goutte à goutte, de KH2PO4 2 M. On a alors chargé l'ëxträit"d'acétone'aqueux^ sxir une colonne C8 Baker Prep. On a séché les colonnes et on les a lavées avec 2 ml d'eau. On a élué les tétrapyrroles avec 3 ml de 90/10 CH3OH/H2O. Comme à l'exemple 1, tous ces procédés d'extraction ont été effectués pratiquement entièrement à la lumière, n'excitant pas la protoporphyrine IX (par exemple, la lumière verte) ou à l'obscurité (par exemple, dans des récipients opaques recouverts) . On a alors déterminé la fluorescence des extraits sur un spectrofluoromètre SPEX. On a quantifié l'accumulation de protoporphyrine IX ("Proto IX") en utilisant les coefficients d'extinction prédéterminés. Les résultats sont donnés dans le tableau 2 ci-après :

Tableau 2

Inhibition de croissance et accumulation de Proto IX moyenne

Quantité de • concentration inhibition Proto XX °° relatif de agent de l'agent (uM) croissance fpmoles^ ** Proto IX*** B- - - -100 -.............:-.99-.:: - 5.20 2364 F 100 . 106 2.71 1232 C 100 52 4.41 2005 C 10 -15* 0.57 259 C 1 -26* 0.19 86 * Des valeurs négatives pour "Inhibition de croissance" indiquent que la croissance a eu lieu ** Quantité moyenne par 106 cellules *** Pour cent du témoin

Un autre aspect de la présente invention concerne la préparation de protoporphyrine IX (désignée ci-après par l'expression "Proto IX"). Dans cet aspect, on fait croître des micro-algues eucaryotiques de manière hétérotrophique à l'obscurité (ou à la lumière n'excitant pas Proto IX), dans un milieu contenant un agent (décrit ci-dessus) qui inhibe la transformation enzymatique du protoporphyrinogène en Proto IX. On traite alors le milieu ou les algues ou encore les deux pour extraire Proto IX et pour le séparer de la chlorophylle, des caroténoîdes et des débris cellulaires, etc. La séparation peut avoir lieu de n’importe quelle manière adéquate, comme par chromatographie en phase liquide, y compris, la chromatographie liquide à phase réverse ou par extraction dans un solvant ou encore par précipitation de Proto IX par chélation, par exemple, avec un métal tel que Fe, Zn ou Mg, en retirant le ' composé chélate résultant et, si on le souhaite, en régénérant le Proto IX en,_ faisant;-.-appel, par exemple,, à .un traitement „connu du chélate avec de l'acide dilué.

Les étapes de séparation sont effectuées à la lumière qui n'excite pas Proto IX (telle que la lumière verte décrite dans 1 ' annexe A sous le titre "obscurité") ou dans le noir. Le chélate de fer n'est . pas tellement photosensible, si bien que la possibilité d'une exposition à la lumière est plus grande lorsqu'on manipule cette matière.

De préférence, on fait croître les microalgues sous forme d'une suspension cellulaire, à une température dans le domaine d'environ 15 à 30eC. La concentration de l'agent inhibiteur peut être d'environ 10-5 à 10"7 M, par exemple. Comme exemples de microalgues que l'on peut utiliser, on peur citer Scenedesmus sp., Chlamidomonas reinhardi, Euglena sp. et Bumilleriopsis filiformis.

Exemple 3

On repique des cultures en phase exponentielle de Chlamidomonas reinhardi (type sauvage) dans une cuve en acier inoxydable (par exemple, de 300 1), en utilisant le milieu de culture décrit ci-dessous. on ajoute du 5-(2-chloro-4-trifluorométhy1-phénoxy)-2-nitrobenzoate de l-(carbéthoxy)éthyle en solution dans de .1'acétone (lactophen, un herbicide d'éther'phénylique disponible dans le commerce) pour obtenir une concentration de ÎCT5 M et une concentration finale d'acétone de 0,1%. On laisse le mélange croître dans le noir à 25 °C pendant 4 à 7 jours, avec agitation modérée et/ou aération. Tout en maintenant l'obscurité, on filtre les contenus de la cuve et on traite le filtrat pour récupérer la protoporphyrine IX qui s'y trouve.

Un procédé de traitement destiné à récupérer la protoporphyrine IX consiste à filtrer les contenus de la cuve réactionnelle (tout en maintenant l'obscurité) et d'ajouter de l'acétone au filtrat. On extrait ce mélange dans de l'éther de pétrole. On extrait alors le mélange d'acétone aqueux dans de l'éther diéthylique et on élimine l'éther diéthylique par évaporation pour laisser un résidu. On dissout ce résidu dans du méthanol et on le soumet à une chromatographie en phase réverse, pour obtenir la protoporphyrine IX. De même, on peut utiliser les procédés de récupération décrits aux exemples 1 et 2.

Composition du milieu sels molarité réserve ml de réserve/1

Na Citrate·6H20 1.7 x ΙΟ'3!! 10% 5 oligo-éléments comme ci-dessous comme ci-dessous 10

FeCl3*6H20 0.37 x 10‘3M 1% I

CaCl2J*_2H2Q.______0.36:,x. ,10*3M____________5.3% . ____________1

MgS04 · 7H20 1.2 x ΙΟ’3!! 10% 3 NH4NO3 3.7_X 10*3M 10% 3 KH2P04 2.2 X 10*3M 10% 3 K2HP04 Γ.7 X 10*3M 10% 3 CH3C02Na 7.5 X 10'3M 10% 10 Réserve d'un mélange d'oligo-éléments H3BO3 100 mg/1

ZnS04* 7H20 100 mg/1

Hnso4*4H2o '40 mg/1 coci2*6H2o 20 mg/1

NaMo04 * 2H20 20 mg/1

CuS04 4 mg/1

En variante à l'utilisation de Chlamydomonas reinhardi, on utilise Scendesmus sp. cultivé sur le milieu ci-dessus, en remplaçant l'acétate de sodium par du glucose.

Exemple 4

Cet exemple est le même que l'exemple 3, à l'exception du composé herbicide, à savoir la l-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyphényl) -3- (méthyl-4-difluorométhyl-/^ 2-l,2,4-triazolin-5-one que 1'on utilise à la place du lactophen.

Exemple 5 ________________________ Détermination de la I50

Protoporphyrinogène ix ("Protogène IX").

Proto IX est vendu par Porphyrin Products, Logan, UT et a été purifié comme décrit par T. P. Fuesler et collaborateurs, Plant Physiol,, 67, 246-249 (1981). On a préparé du protogène IX frais par réduction de Proto IX avec un amalgame de Na/Hg, comme décrit par N. J. Jacobs et J. M. Jacobs, Enzyme, 28, 206-219 (1982), en utilisant le Proto IX purifié à une concentration de 300 μΚ.

Matière végétale. On a cultivé du concombre (Cucumis Sativus L. cultivar "Wisconsin S MR 18") dans une chambre de croissance à 1 ' obscurité sur de la vermiculite irriguée à l'aide d'un engrais disponible dans le commerce (9-45-Ï5) . On a fait croître les semences à 25*C et sous une humidité relative de 80 à 90%. On a procuré une illumination intermittente, une minute de lumière par cycle de 60 minutes, avec une intensité mesurée de 25 μΕ/m“2 sec“1 (PAR), à l'intervention d'un "Bright Stick" de General Electric commandé par un dispositif de synchronisation électronique. Cette illumination a permis au tissu de réaliser une synthèse rapide de la chlorophylle, tout en minimisant les réserves d'amidon et les niveaux initiaux de chlorophylle.

Isolation des chloroplastes. On a isolé les chloroplastes en développement, comme décrit par- T.P. Fuesler et collaborateurs, Plant Physiol., 75, .662-664 (1984), avec cette exception que, au cours de l'étape finale de purification, on a centrifugé les plastides à travers un coussin Percoll à 40% plutôt qu'à 45% (volume/volume). „. .On a remis les_ chloroplastes en suspension dans un tampon d'analyse contenant du mannitol 0,5 M,'TES 20 mM,'HEPES 10 mM,' pH 7,7, EDTA 1 mM, MgCl2 1 mM, de l'albumine de sérum bovin à 1% (poids/volume) et du dithioérythritol 1 mM, pour obtenir une concentration finale de 2 mg de protéine/ml.

Détermination de la protoporphyrinogène- oxydase

On a effectué les analyses, comme décrit par J.M. Jacobs et N.J. Jacobs, Arch. Biochem. Biophys., 229, 312-319 (1984). On a préincubé des échantillons (0,2 ml) de la suspension de chloroplastes dans le noir pendant 15 minutes, avec diverses concentrations d'acifluorfen-méthyle ("AFM") ou avec de l'acétone à 0,2% (volume/volume) (comme "témoin"). A la suspension, on a alors ajouté 50 μΐ de Protogen fraîchement préparé (environ 15 nM) pour déclencher la réaction. On a mis un terme à la détermination par addition de 2,75 ml des milieux fluorométriques de N.J. Jacobs et J.M. Jacobs, Enzyme, 28, 206-219 (1982) constitués par du Tween 20 à 1% (volume/volume) (monolaurate de polyoxyéthylènesorbitanne), tris-HCl 50 mM, pH 8,5, EDTA 1 mM ? on a remplacé le dithioérythritol 1 mM par du glutathion 5 mM. On a alors lu directement les suspensions sur un spectrofluoromètre SPEX Fluorolog-2 équipé d'un accessoire frontal de fluorescence pour des échantillons de turbidité biologique. On a quantifié la quantité de Proto IX obtenue à partir d’une courbe normale (de quantité de Proto IX par rapport à une émission à 630 nm, avec une excitation à 400 nm) obtenue à partir de Proto IX purifiée dans des milieux fluorométriques.

Afin de déterminer la quantité d'oxydation non .enzymatique en Proto IX dans 1'.analyse _ ci-dessus·, __ on a procédé à la même détermination, avec cette exception qu'au lieu dé la suspension de chloroplastes actifs, on a utilisé une suspension dans laquelle les chloroplastes avaient été inactivés en les chauffant pendant 15 minutes à 85 *C. En soustrayant la quantité de Proto IX ainsi obtenue de la quantité obtenue en présence des chloroplastes actifs, on a obtenu la quantité de Proto IX qui s'est formée par voie enzymatique. Les résultats sont représentés sous forme d'un graphique en figure I (dans laquelle LSD indique la plus petite différence significative, selon les conventions) . Dans la figure I, on indique que la valeur I50 (la concentration qui procure une inhibition à 50%) est inférieure à 0,1 μΜ, c'est-à-dire d'environ 0,03 μΜ.

Les analyses quant à l'effet d'AFM de 10 μΜ sur la transformation enzymatique de Proto IX en Proto IX de magnésium dans la suspension de chloroplastes (en présence d'ATP), ont indiqué que AFM n'avait pas d'effet inhibiteur sur cette transformation.

Exemple 6

Dans cet exemple, on a ajouté les agents inhibiteurs enzymatiques à l'alimentation de souris porteuses de tumeurs ; pour un certain nombre de souris utilisées comme témoins, on n'a pas ajouté d'agent à la nourriture. On a alors sacrifié les souris et on a retiré leurs reins, leurs intestins, leurs glandes surrénales, leurs foies et leurs tumeurs et, on les a analysés pour déterminer leur teneur en Proto IX.

Plus spécifiquement, quant aux souris, il s'agissait de souris DBA/2 Ha auxquelles on avait injecté des tumeurs SMT-F par voie sous-cutanée, au jour 0, dans l'épaule droite. Les souris·, logées individuellement, ont reçu un mélange de grains "Purina Rodent Chow 5001" non traité au jour 1, ensuite, aux jours 2 à 10, les souris ont reçu le même mélange de grains traité avec 2000 ppm de l'agent inhibiteur —soumis—à—ïJ essai—(ou - pour. ..les_témoins._le_même_mélange.L. de grains non traité) . On a réalisé le traitement du mélange de grains en le mélangeant avec une petite quantité de l'agent à soumettre à l'essai en solution dans de l'acétone. On a alors sacrifié les souris au jour 10, à l'exception des souris traitées avec l'agent désigné par 6j : ces dernières ont été sacrifiées au jour 7. On a réfrigéré les tissus à 4eC pendant une nuit et puis, on les a fait sécher sur du papier filtre et on a enregistré le poids frais de chaque échantillon de tissu. On a alors homogénéisé les tissus dans 5 ml, ou dans 10 ml lorsqu'il s'agissait des intestins et du foie, d'acétone-NH40H 0,1 N (9:1 volume/volume). On a alors centrifugé les produits résultant de l'homogénéisation, à 1500 g et on a analysé les produits surnageants, sur un spectrofluoromètre SPEX FA112 : excitation 400 nm, longueur d'ondes d'émission 630 nm, le maximum pour Proto IX. On a déterminé l'accumulation de Proto IX sous forme de CPS (quantité de fluorescence par seconde d'émission) par gramme de tissu. Les résultats sont repris sous forme de tableaux ci-dessous (les résultats représentent des moyennes pour deux souris pour chaque traitement, à l'exception des traitements avec les agents 6f, 6h, 6i et 6j, dans lesquels on n'a chaque fois traité qu'une seule souris) :

Tps Hr Proto IX en moyenne par gramme. x 10^*_ poids de la tumeur agent tumeur foie .reins. surrénales intestin .a l'état excisé (n 6a 1203 4291 10817 6572 5870** 143 6b 1520 1261 2441 2529 5577** 90 6c 14336 2739 16186 13790 9937** 157 6d 2006 1581 12865’ 443 5565** 294 6 e" '837 ..... 876 915’........1331 2069** 165 6f 449 1170 661 5611 1157 69 6g 166 803 606 1984 466 250 6h 298 914 585 2259 584 192 6i 932 1510 4014 36940 3454 20 6j 1251 538 315 491 572 11 témoin 239 536 494 1504 233 200 424** * les chiffres dans le tableau correspondent à des données . . brutes X 10 3

On a fait les mesures sur des échantillons dilués avec 3 parties d'acétone basique pour 1 partie d'échantillon.

Les chiffres ci-après correspondent aux concentrations suivantes de Proto IX dans les tissus respectifs, exprimées en ßg de Proto IX par gramme de tissu :

Agent fumeur Foie _ Reins Surrénales Intestin 6a 11 39 99 60 54 5 6b 14 12 22 23 51 6c 131 25 148 126 91 6d 18 14 117 4 51 6e 8 8 8 12 19 6f · 4 —.......' 11..... 6 - -------51................ ..........11 1 6g 2 7 6 18 4 6h 3 8 5 21 5 6i 9 14 37 337 32 6j 11 5 3 4 5 témoin 2 5 5 14 2 4

Dans l'article de Dougherty cité ci-dessus, on donne un chiffre de 3,6 Atg/g pour la concentration de porphyrine dans le même type (SMT-F) de tumeurs, après injection de 10 mg/kg de dérivés d'hématoporphyrine dans le même type de souris (DBA/2 Ha). Dans d'autres documents de la littérature technique (Moan et collaborateurs P&P 46-5, pages 713-721, note de la figure 2 page 716) , on mentionne que l'on atteint un concentration d'environ 12 /xg/g de porphyrine dans des tumeurs (carcinome mammaire C3H/Tif) chez des souris DBA/H2, après injection par voie intrapéritonéale de 25 mg/kg de Photofrine II, à savoir l'agent sensibilisateur le plus largement utilisé pour le traitement photodynamique et la détection du cancer.

Les quantités totales de nourriture contenant l'agent, consommée par les souris, étaient les suivantes : 6a, 22 et 35g ; 6b, 37 et 35g ; 6c, 25 et 22g ; 6d, 41 et 32g ; 6e, 40 et 44g ; 6f, 27g ; 6g, 33 et 40g ; 6h, 36g ; 6i, 10g ; 6j, 20g.

Pour préparer les expériences décrites à l'exemple 6, on est passé par les étapes de routine ci-après en utilisant (sauf indication contraire) l'agent désigné par l'abréviation 6c dans cet exemple, avec des animaux non porteurs de tumeurs : a. On~a’déterminé ' la DL50 de l'agent comme étant supérieure à 2600 mg/kg (c'est-à-dire la quantité de l'agent en mg par kg de poids du corps) pour des rats (déterminé au cours d'une période de 14 jours suivant une dose unique administrée par voie orale comprenant de l'huile de maïs contenant 15% de l'agent) et supérieure à 700 mg/kg pour des souris (déterminée au· cours d'une période de 14 jours suivant une dose unique administrée par voie orale comprenant de l'huile de maïs et 5% de l'agent).

b. Dans des essais de véhicules pour l'injection par voie intrapéritonéale, sans l'agent, on a déterminé que les souris pouvaient tolérer une injection d'une dose de 0,5 ml d'un mélange de parties égales de DMSO (diméthylsulfoxyde) et d'eau.

c. Dans des essais quant à l'agent injecté par voie intrapéritonéale dans un mélange d'huile de maïs à 60% et de DMSO à 40%, on a déterminé que les souris pouvaient tolérer une dose de 100 mg/kg.

d. On a effectué les essais ci-après avec les souris : i. gavage quotidien par voie orale de 50 mg/kg (en utilisant une solution à 1% de l'agent dans de l'acétone) pendant 8 jours ; ii. injection quotidienne par. voie intrapéritonéale de 50 mg/kg (en utilisant une dispersion à 1% de l'agent dans de l'huile minérale préparée en dissolvant l'agent dans une goutte de DMSO et en mélangeant la solution résultante à l'huile minérale) pendant 8 jours ; iii. application locale quotidienne sur la peau de 50 mg/kg (en utilisant une solution à 1% ___dans„du_ DMSO)_ pendant. 8 jours ; ____;__________ iv. alimentation pendant 8 jours avec une nourriture classique dans laquelle on avait incorporé 2000 ppm de l'agent, basé sur le poids de la nourriture ; V. injection quotidienne par voie intraveineuse de 50 mg/kg (en utilisant une solution à 2% dans du DMSO) pendant 4 jours.

On a alors sacrifié les souris utilisées dans ces essais et on a examiné leurs tissus pour détecter 1'accumulation de Proto IX.

Dans un autre essai, on a nourri un rat mâle Fisher 344 pendant 27 jours avec une alimentation contenant 5000 ppm de l'agent 6c et on l'a ensuite sacrifié. Les tissus de ce rat ont indiqué des concentrations supérieurs de Proto IX, comparé à un témoin, avec des augmentations marquées quant aux concentrations dans les reins, dans l'intestin, dans 1 ' estomac et dans le cerveau et seulement une petite augmentation au niveau des tissus musculaires.

Dans les essais précédents concernant les rats et les souris, on a maintenu les animaux dans un cycle classique de 12 heures d'obscurité et de 12 heures de lumière.

Exemple 7

Dans une série d'expériences effectuées avec les lignes utilisées dans les exemples 1 et 2, on a incubé des cultures de cellules HeLa en présence de 100 μΜ de divers agents de traitement dont on donne la liste ci-dessous. Le pourcentage donné, à côté de chaque agent de traitement, indique l'augmentation . ._quant^à„la^quantité_deJProto . IX „obtenue en présence^ de_______ cet agent de traitement par rapport à la quantité obtenue par le témoin dans la même expérience.

Agents utilisés dans les exemples 6 : 6a, 337% ; 6b, 366% ; 6c, 297% ; 6d, 1200% ; 6e, 1210%, 6f, 280% ; 6g, 326% ; 6h, 431% ; 6i, 544% ; 6j, 469%.

Autres agents :

Exemple 8

Dans cet exemple, on a procuré l'agent inhibiteur enzymatique 6c de l'exemple 6 à des rats, on a implanté des tumeurs dans les rats et on a exposé à la lumière la zone porteuse de tumeurs, ce qui a provoqué la régression de ces dernières.

Spécifiquement·, pendant une période de 6 joursy-on—a-soumis-à-un -régime-de-nourriture contenant 2000 ppm de l'agent, trois^rats Sprague-Dawley ayant un poids moyen de 120 g. Au troisième jour, on a implanté des chondrosarcomes dans le membre arrière droit de chaque rat, en injectant 0,3 ml d'une suspension des cellules tumorales (1.000.000 de cellules tumorales).

Au jour 6, on a rasé et épilé le membre externe droit de chaque rat, on a mesuré la dimension de chaque tumeur et on a exposé la zone de la tumeur, ainsi que la peau environnante, à des doses non thermiques de lumière 630 nm pour un total de 270 J/cm2. Le jour suivant, deux des rats se sont révélés apparemment libérés de leur tumeur (c'est-à-dire qu'il n'y avait plus de masse tumorale palpable), et le troisième rat a indiqué une régression pratiquement complète de sa tumeur. Le tissu musculaire et la peau environnante des rats étaient légèrement décolorés et ont indiqué un ,1 léger gonflement significativement inférieur à celui rencontré dans le cadre de la thérapie photodynamique utilisant la Photofrine II.

Annexe Ά

Essai d'écoulement en pour cent L'essai d'écoulement en pour cent utilise des cotylédons récoltés à partir de semences de concombres étiolées. Au cours d'une étape initiale, on traite une masse de cotylédons dans le noir avec une solution .....aqueuse^tamponnée contenant un sucre radiomarqué. On mesure alors la quantité de sucre absorbé par les cotylédons (par comptage, comme décrit ci-dessous). On divise alors la masse des cotylédons en deux portions ; on traite une portion des cotylédons dans le noir avec une solution aqueuse tamponnée contenant le composé à soumettre à l'essai, tandis que l'on traite l'autre portion de la même manière dans le noir avec une solution exempte du composé d'essai et par ailleurs identique, comme témoin. On expose alors à la lumière pendant 16 heures, les cotylédons mis en contact avec les solutions aqueuses, puis on les sépare des

solutions aqueuses ; on mesure alors ces dernières (par comptage) pour déterminer leurs teneurs en matières radiomarquées. Les résultats sont exprimés en pour cent d'écoulement que l'on calcule comme suit : S

représente la quantité de matière radiomarquée (par cotylédon) absorbée par-' les cotylédons dans leur traitement initial, représente la quantité de matière radiomarquée (par cotylédon) dans la solution aqueuse contenant le composé à soumettre à l'essai, après exposition à la lumière, et Sq représente la quantité de matière radiomarquée (par cotylédon) dans la solution aqueuse du témoin après exposition à la lumière :

Plus spécifiquement, on a utilisé les matières et les conditions ci-après dans l’essai d'écoulement en pour cent.

Matière végétale ï on a fait germer et croître des semences de concombres (cucumisSativus L. cultivar "Wisconsin SMR 18") dans de la vermiculite irriguée '~avë”c“lih engrais disponiblë ^dans le commerce (9-45-15). On a fait croître les semences à 25 “C et sous une humidité relative de 80-90% dans une chambre noire d’incubation. On a récolté les cotylédons à partir des semences étiolées, cinq jours après la plantation, et on les a rincées dans du CaCl2 1,0 mM, toutes ces opérations étant effectuées à la lumière verte.

Solution tamponnée ï KC1 1 mM, CaCl2 1 mM et phosphate de potassium 2,0 mM réglé à un pH de 6,5 (par exemple, avec du NaOH).

Sucre radiomarqué ï 3-0-méthyl-3-[U-14C]glucose ayant une activité spécifique de 10,9 GBq/mmole (Amersham Corp., Arlington Heights IL).

Traitement initial s on ajoute des cotylédons lavés (180 à 230) dans un -ballon d'Erlenmeyer de 250 ml à large goulot et muni d'un bouchon en mousse, contenant 50 ml de la solution tamponnée, et on ajoute le sucre radiomarqué en une quantité telle qu'elle permet d'obtenir une concentration de 600 nM dans la solution. On agite le ballon pendant 24 heures à 125 tours/minute sur un agitateur rotatif dans le noir. On récupère alors les cotylédons sur des mailles en nylon et on les rince trois fois dans des volumes de 20 ml de CaCl2 ImM. On mesure l'absorption du sucre radiomarqué par digestion de trois échantillons de 5 cotylédons chacun, dans un solubilisant de tissu NCS (Amersham Corp.) et en comptant le produit de macération résultant dans . un spectromètre de scintillation de liquide. (Les résultats de ces digestions se sont avérés être équivalents à la même détermination obtenue par combustion des cotylédons prélevés comme échantillon, dans un agent auto-oxydant.)

Traitement avec le composé à soumettre à “1* essai (et traitementr du témoin) · :------ -n fait . flotter cinq des cotylédons, côté abaxial vers le haut, sur 3 ml dela solution tamponnée, dans des boîtes de Pétri en plastique recouvertes ayant un diamètre de 35 mm. On ajoute alors le composé d'essai (sous forme d'une solution de ce dernier dans de 1 ' acétone) en une quantité telle qu'elle permet d'obtenir une concentration prédéterminée (mentionnée ci-dessous) du composé d'essai dans la solution tamponnée ? on règle alors la concentration d'acétone dans la solution tamponnée à 0,1% (volume/volume) dans le témoin, ainsi que dans la solution contenant le composé d'essai. On fait alors tourbillonner les cotylédons flottants, en agitant les boîtes de Pétri à 90 tours/minute à la surface d'un agitateur rotatif pendant 16 heures.

Exposition à la lumière : on expose les boîtes de Pétri contenant les cotylédons flottant sur les solutions, pendant 16 heures à un éclairage fourni par quatre lampes fluorescentes GE F20T12-CW, à une intensité mesurée de 150 μΕ m”2 sec”1 dans la. région photosynthétiquement active du spectre (PAR) (mesurée à la surface des cotylédons), tandis qu'on agite les boîtes de Pétri.

Mesure de la quantité de la matière radiomarquée dans le liquide : on sépare des cotylédons la quantité totale de liquide et on“ procède à un comptage dans un spectromètre de scintillation de liquide.

Obscurité : on effectue tous les traitements précédant' l'étape d* éclairage, dans le .noir ou à... la lumière verte fluorescente (c'est-à-dire de la lumière filtreë”à“travèrs ün filtre verf'en plastique"à arêtes, qui laisse passer la lumière de 450-600 nm) .

Annexe B

Milieux _de culture

Milieu M

Sels Molarité Réserve . ml de rëserve/1 jèitrate de. Na· 6H7O *' .1:.7 X' 10-¾ . , , 10% " ' -, . _5 oligo-éléments comme ci-dessous comme ci-dessous 10 ......Fecl3”· 6H20 ..... 0737 x"10'3M 1% ' 1

CaCl2*2H20 0.36 X 10*3M 5.3% 1

MgS04 · 7H20 1.2 X 10‘3M 10% 3 NH4NO3 3.7 X 10*3M 10% 3 KH2P04 2.2 X 10-¾ 10% 3 K2HPO4 1.7 X 10’3M 10% 3

Réserve de mélange d'oligo-éléments H3BO3 100 mg/L

ZnS04·7H20 100 mg/L

MnS04-4H20 40 mg/L

COCl2 * 6H20 20 mg/lL

NaMo04-2H20 20 mg/L

CuS04 4 mg/L

On prépare le milieu de culture A en ajoutant 10 ml/1 d'une solution aqueuse d'acétate de sodium s 10% (7,5 X ÎCT3 M) au milieu M.

On aj oute les composants à de 1'eau distillée dans l'ordre mentionné ci-dessus et. on les fait passer à l'autoclave à 15 psi pendant 15 minutes.

Cultures-mères que l'on a fait croître en présence de lumière . , . ·..On maintient des cultures-mères de cellules Y-l en position axénicale dans une culture liquide sur un milieu A ou M, de préférence sur un milieu M, dans un cycle de 14/10 heures lumière/obscurité à 25°C, dans des ballons d'Erlenmeyer munis de bouchons de polyuréthanne. On incube les cultures-mères sans aération supplémentaire sur des agitateurs rotatifs à 125 tours/minute. L'intensité lumineuse au niveau des cultures est de 120 μΕ m“2 sec-1 (PAR). Dans ces conditions, les cultures se trouvent dans un mode semi-synchrone de croissance jusqu'à ce qu'elles atteignent une phase stationnaire de 2-4 x 106 cellules/ml.

Cultures que l'on a fait croître sans lumière (cultures que l'on a fait croître à l'obscurité) j

On transfère des cellules provenant de la phase stationnaire des cultures-mères que l'on a fait croître en présence de lumière (7,5 ml) à 750 ml d'un milieu A dans un ballon d'Erlenmeyer. On incube les cellules à l'obscurité, avec aération transmise par un tube d'aération immergé, à 25°c pendant 3 à 4 jours. Pendant cette période, cette culture de cellules Y-l subira 7 à 8 divisions cellulaires, perdant ainsi toute la chlorophylle visible et la concentration doit être de 2-3 X 106 cellules/ml.

Préparation des cellules destinées à être utilisées dans 1'analyse

On récolte des cellules à partir d’une culture fraîchement préparée, que l'on a fait croître à J- 'obscurité (750 ml),_par centrifugation - à petite vitesse, c'est-à-dire”environ 2000 tours/minute pendant approximativement "5 “minutes' à “environ' 20°C. On 'remet doucement en suspension les cellules dans 50 ml de milieu A. Il y a lieu d'examiner un échantillon de cette suspension (approximativement 0,25 ml) afin de détecter la mobilité et, après fixation avec une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 1%, il y a lieu de pratiquer un comptage cellulaire pour déterminer le nombre de cellules/ml. Un comptage cellulaire normal correspond à environ 5 x 107 cellules/ml. On place ' des quantités aliquotes de 1 ml (107 cellules/ml) dans les récipients d'essai (par exemple, des plaques Falcon (marque commerciale déposée) à 24 puits pour cultures de tissus). A ce moment, les cellules sont très mobiles et sont de couleur jaune.

On dissout le composé d'essai dans un solvant (de l'acétone, de -l'éthanôl, du diméthylsulfoxyde ou de l'eau, de préférence, de l'acétone) pour obtenir une concentration qui correspond à 1000 fois la concentration finale. On ajoute 1 μΐ de cette-solution d'essai à 1 puits sur deux, avec une microseringue de 5 ou de 10 μΐ.

On prépare les quatre puits témoins par plaque de culture tissulaire, de la manière décrite ci-dessus, en l'absence du composé d'essai. On recouvre les plaques de cultures tissulaires avec une couverture transparente en plastique et on les place dans un chambre de croissance avec une intensité lumineuse de 70-90 μΕ m“2' sec”1 pendant 13-16 heures à 25'C. Si les j contenus des puits d ' essai apparaissent j aunes, ... on les extrait comme décrit dans la section ci-après concernant l'évaluation des résultats, si les. contenus des puits d'essai apparaissent transparents ou présentent une couleur vert pâle, on les place sur un agitateur rotatif à approximativement 125 tours/minute et on les irradie pendant deux heures avec mie ""intensité“lumineuse’ d'environ 600 /iE’m“2 "sec“1 gavant de les extraire.

Evaluation des résultats .

On ajoute une solution aqueuse de dodécylsulfate de sodium à 10% (250 μΐ) et de méthanol (1 ml) à chaque puit d'essai et on mélange intimement. On laisse les mélanges au repos à l'obscurité pendant 3 à 4 heures. On centrifuge les plaques de cultures tissulaires à la température ambiante à petite vitesse (environ 2000 tours/minute), pendant 5 minutes. On retire les produits surnageants et on les analyse dans un spectrophotomètre Beckman Modèle 35 entre 350 nm et 500 nm, pour détecter la présence de protoporphyrine IX, à 668 nm, à savoir le pic d'absorption de la chlorophylle dans ce système de solvants et à 720 nm que l'on utilise comme lecture de fond de turbidité.

Analyse des données

Pour chaque puits, on obtient, une valeur de vert en soustrayant la lecture à 720 nm de la lecture à 668 nm. On fait, une moyenne de ces. valeurs pour chaque concentration du composé à soumettre à l'essai et pour le témoin. L'inhibition en pour cent est égale à .„ :yaleurr de : vert:, moyenne pour la concentration particulière Ï0Ö X (1 -

Valeur de vert moyenne pour le témoin

Claims (11)

1. Procédé destiné à tuer des cellules de tumeurs chez des mammifères, en soumettant ces cellules à la lumière en présence d'un tétrapyrrole photo-activable, caractérisé en ce qu'on traite les cellules avec un composé qui est un inhibiteur spécifique de la transformation enzymatique de protoporphyrinogène en protoporphyrine IX par la protoporphyrinogène-oxydase, au sein de ces cellules, provoquant ainsi une a'cciimülatión'de “protoporphyrine ix dans les cellules."

2. Composition pharmaceutique destinée à être utilisée dans un procédé destiné à tuer des cellules de tumeurs chez des mammifères, en soumettant ces cellules à la lumière en présence d'un tétrapyrrole photo-activable, la composition étant stérile et caractérisée par un composé, à savoir un inhibiteur spécifique de la transformation enzymatique de protoporphyrinogène en protoporphyrine IX par la protoporphyrinogène-oxydase, au sein de ces cellules, provoquant ainsi une accumulation de protoporphyrine IX dans les cellules, le composé possédant une I50 pour la protoporphyrinogène-oxydase inférieure à 1 μΜ, la composition comprenant également un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

3. Composition pharmaceutique destinée à être utilisée dans un procédé destiné à tuer des cellules de tumeurs chez des mammifères, en soumettant ces cellules à la lumière en présence d'un tétrapyrrole photo-activable, la composition étant stérile et caractérisée par un composé, à savoir un inhibiteur spécifique de la transformation enzymatique de protoporphyrinogène en protoporphyrine IX par la protoporphyrinogène-oxydase, au sein de ces cellules, provoquant ainsi une accumulation de protoporphyrine IX dans les cellules, le composé n'étant pas un tétrapyrrole et ayant un potentiel redox plus négatif que -500 mV, la composition comprenant également un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

4. Inhibiteur spécifique de la transformation ____enzymatique .„deprotoporphyrinogène en protoporphyrine IX par la protoporphyrinogène-oxydase dans des cellules tumorales chez des mammifères, provoquant ainsi une accumulation de protoporphyrine IX dans ces cellules, le composé ayant une I50 pour la protoporphyrinogène-oxydase inférieure à 1 μΜ, à des fins thérapeutiques.

5. Inhibiteur spécifique de la transformation enzymatique de protoporphyrinogène en protoporphyrine IX par la protoporphyrinogène-oxydase dans des cellules tumorales chez des mammifères, provoquant ainsi une accumulation de protoporphyrine IX dans ces cellules, le composé ayant une I50 pour la protoporphyrinogène-oxydase inférieure à 1 μΜ, destiné à être utilisé dans le traitement photodynamique de tumeurs.

6. Inhibiteur spécifique de la transformation enzymatique de protoporphyrinogène en protoporphyrine IX par la protoporphyrinogène-oxydase dans les cellules tumorales chez des mammifères, provoquant ainsi une accumulation de protoporphyrine IX dans ces cellules, le composé n'étant pas un tétrapyrrole et ayant un potentiel redox plus négatif que -500 mV, à des fins thérapeutiques.

7. Inhibiteur spécifique de la transformation enzymatique de protoporphyrinogène en protoporphyrine IX par la protoporphyrinogène-oxydase dans des cellules tumorales chez des mammifères, provoquant ainsi une accumulation de protoporphyrine IX dans ces cellules, le composé n'étant pas un tétrapyrrole et ayant un potentiel redox plus négatif que -500 mV, destiné à être utilisé dans le traitement photodynamique de tumeurs. _________________________8. „Procédé „destiné... à „augmenter .· la teneur; en protopoiphyrine IX de cellules tumorales chez des mammifères, caractérisé en ce que l'on traite les cellules ou un organisme comprenant ces cellules avec un composé, à savoir un inhibiteur spécifique de la transformation enzymatique de protoporphyrinogène en protoporphyrine IX par la protoporphyrinogène-oxydase dans ces cellules, provoquant ainsi une accumulation de protoporphyrine IX dans ces cellules,

9. Procédé destiné à détecter ou à localiser des cellules tumorales chez des mammifères, en augmentant la teneur en porphyrine de ces cellules et en examinant les tissus de mammifères à la lumière stimulant la porphyrine et en observant la fluorescence provenant de la tumeur, caractérisé en ce que l'on traite un organisme comprenant ces cellules avec un composé, à savoir un inhibiteur spécifique de la transformation enzymatique de protoporphyrinogène en protoporphyrine IX par la protoporphyrinogène-oxydase dans ces cellules, provoquant ainsi une accumulation de protoporphyrine IX dans ces cellules.

10. Procédé pour la préparation de protoporphyrine IX, caractérisé en ce que l'on fait croître une micro-algue eucaryotique dans le noir ou à la lumière qui n'excite pas la protoporphyrine IX, en présence d'une quantité efficace d'une triazolinone arylée, d'une tétrazolinone arylée ou d'une triazine-dione arylée, à savoir un inhibiteur de l'enzyme protoporphyrinogène-oxydase.

11. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les micro-algues sont du genre Chlamidomonas.

12. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'inhibiteur est la l-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyphényl) -3-méthyl-4-difluoro-méthyl-A2_1f2,4-triazolin-5-one.